Quantitative 3D<em&gt; In Silico</em&gt; Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-beta Phagozytose in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit

Zusammenfassung

Wir entwickelten eine Methode für die quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zerebraler Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-Krankheit. Dieses Verfahren kann für die Quantifizierung von praktisch jedem phagozytischen Ereignis in vivo verallgemeinert werden.

Zusammenfassung

Neuroinflammation wird nun als wichtiger ätiologischer Faktor bei der neurodegenerativen Erkrankung anerkannt. Mononukleäre Phagozyten sind angeborene Immunzellen verantwortlich für die Phagozytose und die Räumung von Schutt und Geröll. Diese Zellen sind ZNS-Makrophagen als Mikroglia bekannt und mononukleäre Phagozyten von der Peripherie zu infiltrieren. Die Lichtmikroskopie wurde allgemein verwendet worden, die Phagozytose in Nagetieren oder menschliche Gehirn Proben zu visualisieren. Allerdings haben qualitative Methoden nicht definitive Beweise für in vivo Phagozytose zur Verfügung gestellt. Hier beschreiben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM), ein robustes Verfahren ermöglicht für echte 3D - Quantifizierung von Amyloid-β (Aß) Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetier Alzheimer-Krankheit (AD) Modelle. Das Verfahren beinhaltet das fluoreszenz VISUALISIEREN Aß innerhalb Phagolysosome in Nagetier Hirnschnitten verkapselt. Große z-dimensionale konfokalen Datensätze werden dann 3D für die Quantifizierung von A rekonstruiert &# 946; räumlich innerhalb des Phagolysosom colocalized. Wir demonstrieren die erfolgreiche Anwendung von q3DISM zu Maus- und Rattengehirnen, aber diese Methode kann in jedem Gewebe zu praktisch jeder phagozytischen Ereignis verlängert werden.

Einleitung

Alzheimer-Krankheit (AD) ist die häufigste Altersdemenz ¹ wird durch die zerebrale Amyloid-β (Aß) ist eine Anreicherung als "senile" β-Amyloid - Plaques, chronische Low-Level - neuroinflammation, Tauopathie, Verlust von Neuronen charakterisiert und kognitive Störung ² . In AD Patienten Gehirn wird bestimmt neuroinflammation durch reaktive Astrozyten und mononukleäre Phagozyten (bezeichnet als Mikroglia, obwohl ihre zentrale vs. peripheren Herkunft unklar bleibt) umgebende Aß Ablagerungen ^3. Da die angeborene Immun Wächtern des ZNS, sind Mikroglia zentral Aß zu löschen Gehirn positioniert. Mikroglia Rekrutierung Aß - Plaques jedoch durch sehr wenig begleitet, wenn überhaupt, Aß Phagozytose ^4,5. Eine Hypothese ist, dass Mikroglia zunächst neuroprotektive sind durch phagocytozing kleine Versammlungen von Aß. Doch schließlich werden diese Zellen neurotoxisch als überwältigend Aß Belastung und / oder altersbedingten Funktions decline, provoziert Mikroglia in einer dysfunktionalen proinflammatorischen Phänotyp, einen Beitrag zur Neurotoxizität und kognitive Abnahme ^6.

Aktuelle genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben einen Cluster von AD Risiko - Allele Gehören Kern angeborenen Immunwege ⁷ , die ^8-11 Phagozytose identifiziert modulieren. Folglich hat die Immunantwort auf die zerebrale Amyloid - Ablagerung ein bedeutendes Interessengebiet geworden, sowohl in Bezug auf AD Ätiologie zu verstehen und für neue therapeutische Ansätze zu entwickeln ^14.12. Dennoch gibt es ein wesentliches Bedürfnis nach Methodik Aß Phagozytose in vivo zu bewerten. Um diesen ungedeckten Bedarf adressieren, haben wir quantitative 3D in silico - Modellierung (q3DISM) zu ermöglichen , echte 3D - Quantifizierung von zerebralen Aß Phagozytose durch mononukleäre Phagozyten in Nagetiermodellen der Alzheimer-ähnliche Krankheit entwickelt.

nur durch das Ausmaß beschränkt, auf die sie Krankheit rekapitulieren, Tiermodelle habenbewiesen von unschätzbarem Wert für das Verständnis der AD pathoetiology und für experimentelle Therapeutika zu bewerten. Aufgrund der Tatsache, dass Mutationen in den Presenilin (PS) und Amyloid Precursor Protein (APP) Gene unabhängig autosomal dominant AD verursachen, sind diese mutierten Transgene wurden verwendet, umfassend transgene Nagetiermodellen zu erzeugen. Transgene APP / PS1 - Mäuse Koexpression gleichzeitig "Schwedisch" mutiertes menschliches APP (APP _swe) und Δ Exon 9 mutierten humanen Presenilin 1 (PS1ΔE9) vorhanden mit beschleunigten zerebraler Amyloidose und neuroinflammation ^15,16. Ferner haben wir bi-transgenen Ratten co - injiziert mit APP _swe und PS1ΔE9 Konstrukte (Linie TgF344-AD, auf einem Fischer - 344 - Hintergrund) erzeugt. Im Gegensatz zu transgenen Mausmodellen von zerebraler Amyloidose entwickeln TgF344-AD - Ratten , die zerebrale Amyloid - ¹⁷ Tauopathie, apoptotischen Verlust von Neuronen und Verhaltens Beeinträchtigung vorausgeht.

In diesem Bericht beschreiben wir ein Protokoll für die immunostaining Mikroglia, Phagolysosome und Aß-Ablagerungen in Hirnschnitten von APP / PS1-Mäusen und TgF344-AD Ratten und Erwerb von großen z-dimensionalen konfokalen Bildern. Wir Detail in silico Erzeugung und Analyse von echten 3D - Rekonstruktionen aus konfokalen Datensätze ermöglicht die Quantifizierung von Aß - Aufnahme in Mikroglia Phagolysosome. Allgemeiner gesagt, dass die Methodik ausführlich hier können wir nahezu jede Form der Phagozytose in vivo zu quantifizieren.

Protokoll

Erklärung der Forschungsethik: Alle Versuche mit hierin aufgeführten Tiere wurden von der University of Southern California Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) und durchgeführt in strikter Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Leitlinien und Empfehlungen der Gesellschaft für Evaluierung und Akkreditierung von Labor genehmigt Animal Care international.

1. Gehirn von Nagetieren Isolierung und Vorbereitung für Immunostaining

TAG 1:

1. Legen Sie im Alter von TgF344-AD-Ratten (14 Monate alt) oder APP / PS1-Mäuse (12 Monate alte) unter Dauer tief Isoflurananästhesie (4%). Beurteilen Sie die Narkosetiefe durch Zehe Prise und das Fehlen von Rückzugsreflex.
2. Schneiden Sie durch beide Seiten des Brustkorbs und heben Sie das Herz aussetzen. Legen Sie eine 23 G-Nadel in den linken Ventrikel des Herzens und machen einen kleinen Einschnitt in den rechten Vorhof. Fahren Sie mit dem Ausbluten von transkardialer Perfusion mit eiskalter phosphatgepufferter Salzlösung(PBS) eine peristaltische Pumpe (30 ml für Mäuse; 150-200 ml für Ratten) verwendet.
3. Machen Sie einen Schwanzmittelschnitt in die Haut und die Haut und Muskeln zur Seite schieben. Geschnitten durch die Oberseite des Schädels entlang der Mittellinie und zwischen den Augen. Entfernen Sie die Knochenplatten und isolieren das gesamte Gehirn aus dem Schädel.
4. Legen Sie das Gehirn in einen koronalen Gehirn von Nagetieren Matrix und in Scheiben schneiden sie in Viertel. posterior Viertel inkubieren O / N (16 h) in Paraformaldehyd Fixierlösung (4% PFA in PBS) bei 4 ° C. Waschen 3x in PBS, und dann übertragen zu 70% Ethanol. Achtung: PFA ist giftig und sollte unter einer chemischen Abzugshaube mit geeigneter persönlicher Schutzausrüstung gehandhabt werden.

TAG 2:

5. Platzieren Gehirn Viertel in Einbettungskassetten und progressiv Gewebe entwässern in sukzessiv konzentrierter 1 h Ethanolbäder (70%, 80%, 95% und 100% x3).
6. Klar Ethanol aus dem Gewebe mit drei aufeinanderfolgenden 100% Xylol Bäder (jeweils 1 h). Achtung: Xylol ist giftig und shOuld mit entsprechenden persönlichen Schutzausrüstung unter einer chemischen Abzugshaube gehandhabt werden.
7. Einbetten von Gewebe in Paraffinblöcken nach zwei geschmolzene Paraffinwachs Bäder (56-58 ° C, 90 min jeweils).

TAG 3:

8. Schneiden Sie 10 um dicke Abschnitte von in Paraffin eingebetteten Gehirne mit einem Mikrotom. Dip Abschnitte in ein Wasserbad (50 ° C für 1 min) und wenden auf Objektträger. Lassen Sie die Folien O / N, um sicherzustellen, Gewebe Haftung auf der Folie zu trocknen.

2. Immunostaining

Hinweis: Verschiedene Kombinationen von Antikörpern können für das Färbeverfahren eingesetzt werden unten beschrieben. Antikörper - Cocktails kompatibel mit Hirngewebe von Ratten und Mäusen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

TAG 4:

1. Deparaffinisieren Gehirnschnitte mit 2x 100% Xylol Bäder (12 min jeweils).
2. Rehydrieren Hirnschnitten in aufeinanderfolgenden Bädern ethanol - 100% für 10 min, 95% für 5 min, 80% für 10 min, und schließlich 70% für 15 min - followed durch 3x PBS Waschungen [5 min bei RT, mit Licht Agitation]. Inzwischen Lösungswärme Antigen-Retrieval auf 95-97 ° C auf einer Heizplatte mit Magnetstab gerührt wurde.
3. Inkubieren Hirnschnitten in Antigen-Retrieval-Lösung bei 95-97 ° C für 30 min. Dann waschen 3x in PBS (5 min bei RT, mit Licht Agitation).
4. Schnell trocken Dias heikle Aufgabe Wischer mit Gewebe ein Austrocknen zu verhindern, und mit einer hydrophoben Barriere Stift eine hydrophobe Barriere rund um den Gewebebereich zu ziehen. Füllen eingekreisten Gewebebereich mit Blockierungspuffer [PBS, enthaltend 0,3% Triton X-100 und 10% normalem Eselserum (NDS)] und für 1 h in einer befeuchteten Kammer bei RT inkubieren.
5. Ersetzen Blockierungspuffer mit Iba1 primären Antikörper (in Blockierungspuffer verdünnt) mononukleären Phagozyten zu etikettieren, und Inkubieren O / N bei 4 ° C in einer befeuchteten Kammer. Siehe Antikörper - Hosts und Arbeitsverdünnungen, Tabelle 1 und die Tabelle der Materialien.

TAG 5:

6. Spülenprimärer Antikörper mit 3x PBS Bäder (5 min bei RT mit Licht Agitation). Inkubieren mit fluoreszierenden Sekundärantikörper (konjugiert mit einem 594 nm-Emission Fluorophor) für 1 h (in Blockierungspuffer bei RT im Dunkeln), gefolgt von PBS 3x Bäder (5 min bei RT mit leichtem Schütteln). Zu diesem Zeitpunkt halten Abschnitte im Dunkeln Fluoreszenzsignal Bleichen zu vermeiden.

Tag 6 - 7:

7. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit CD68 (Rattenhirnen) oder LAMP1 (Mausgewebe) Antikörper und geeignete Sekundärantikörper (in Verbindung mit einem 488-nm-Emissions Fluorophore) Phagolysosome zu beschriften.

TAG 7 - 8:

8. Wiederholen Sie die Schritte 2.5 und 2.6 mit OC (Rattengewebe) oder 4G8 (Gehirn der Maus) Antikörper und einem geeigneten sekundären Antikörper (gekoppelt mit einem 647 nm Fluorophore) Aß Ablagerungen zu beschriften.
   HINWEIS: Alternativ können 6E10 Antikörper erfolgreich sowohl auf Maus und Ratte Gewebe verwendet werden. Für eine entsprechende Antikörper - Kombinationen finden Sie in der Tabelle der Materialien .
9. Lassen Abschnitte vollständig trocknen O / N bei RT im Dunkeln. Dann Abdeckung Proben mit einem Deckglas versiegelt durch Fluoreszenz Montage Medien mit DAPI.

3. Erwerb von großen Z-Stack konfokale Datensätze

Hinweis: Dieses Protokoll ein Laser-Scanning-konfokalen Mikroskop, ausgestattet mit einem 60X Objektiv und 405 nm, 488 nm, 594 nm und 647 nm Laser vollständig automatisiert erfordert. Alle Geräte sind Computer von Imaging- und Lasersteuerungssoftware gesteuert. Vor dem Bildgebungsprotokoll, Leistung auf dem Computer, epifluoreszenten Lampe, Mikroskop, Laser und Kamera zu beginnen.

TAG 9:

1. Wählen Sie das 60X Mikroskopobjektiv. In Sionsöl auf die Linse, und legen Sie die Probe auf den Mikroskoptisch Diahalter. Heben Sie das Ziel, bis der Öl Kontakt mit der Folie macht. Stellen Sie die Fokusebene zu Amyloid-Plaques im Hippocampus oder Hirnrinde mit epifluoreszenten Beleuchtung durch die Okulare lokalisieren.
2. Erwerben Sie konfokalen imAlter aktivierte mononukleäre Phagozyten Amyloid-Ablagerungen im Hippocampus oder Cortex von Nagetieren umgebenden durch konfokale Mikroskopie (60X Vergrößerung, z-Stapel Schritte: 0,25 & mgr; m

4. q3DISM

Hinweis: Um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, empfehlen wir Ihnen ein Minimum von 3 Bildern pro Tier / Region von Interesse zu analysieren. Für jedes Bild variiert die Fülle von Zellen zu analysieren, auf experimentellen Paradigmen abhängig. In den repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht gezeigt, analysierten wir 3 Zellen / Zustand (zB einkernigen Phagozyten entfernt von oder mit Plaques, siehe 1C - D und 2C - D).

TAG 10:

1. Analysieren Sie konfokalen Datensätze mit wissenschaftlichen 3D-Bildverarbeitung und Analyse-Software Kolokalisation (coloc) Modul für die räumliche Nähe von Iba1 / CD68 (Rattengewebe) oder Iba1 / LAMP1 (Mausgewebe) Färbung in allen z-Ebenen gleichzeitig.Erstellen Sie Iba ⁺ / CD68 ⁺ oder Iba ⁺ / LAMP1 ⁺ Kolokalisierung Kanäle , die zu Phagolysosome innerhalb aktivierten mononukleären Phagozyten entsprechen.
   1. Wählen TRITC für Kanal A (entsprechend Iba1 Anfärbung gekoppelt mit 594 nm Fluorophor) und FITC für Kanal B (entsprechend CD68 oder LAMP1 Anfärbung gekoppelt mit 488 nm-Fluorophor). Auf der rechten Seite des Software-Fensters für 'Modus zu überprüfen, "die Option" Schwelle ", und für" coloc Intensitäten "die Option" Quellkanäle ".
   2. Klicken Sie auf 'Bearbeiten' 'coloc Farbe "auszuwählen, auf der rechten Seite des Software-Fensters.
   3. Für jeden Kanal unabhängig einstellen Schwellen spezifische Färbung zu schließen und Hintergrund / nicht-spezifische Signale auszuschließen. Einmal eingestellt, ändern sich nicht, Schwellen zwischen den Bildern eine unvoreingenommene Analyse zu gewährleisten. Die colocalized Voxel (Pixel von allen Z-Stapel) wird in der Farbe in Schritt ausgewählt erscheinen 4.1.2 in allen z-Stacks simultaneously.
   4. Klicken Sie auf "coloc Kanal bauen '. Die Kolokalisation Kanal erstellt wird im Display Einstellungsfenster angezeigt.
   5. Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die '% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized' stellt die% der Iba1 Signal (Voxel zu dem 594 nm Fluorophore entspricht) kolokalisiert mit LAMP1 oder CD68-Signal (Voxel zu dem 488 nm Fluorophore entspricht). Einfacher ausgedrückt, ist dies die durch Phagolysosomen besetzten monocyte Volumen (Figuren 1C und 2C zu sehen).
      HINWEIS: '% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized' entspricht% der LAMP1 oder CD68-Signal mit Iba1 colocalized. Dies sollte zu 100% betragen, wie Phagolysosome intrazelluläre Strukturen sind. Die Werte basieren auf einem Verhältnis von Signal von allen Z-Stapel über dem Schwellenwert colocalized.
2. das coloc Modul verwenden, analysieren die coloc Kanal in Schritt 4.1 für räumliche Nähe mit OC (Ratte ti erstelltUSGABE) oder 4G8 (Mausgewebe) Aß-Signale. Dies ermöglicht die quantitative Bestimmung von A & bgr; in Phagolysosomen eingekapselt.
   1. Wählen Sie den Kanal A coloc-Datensatz (entsprechend dem Iba1 / CD68 oder Iba1 / LAMP1 coloc Kanal in Schritt 4.1 erstellt) und Cy5 für Kanal B (entsprechend OC oder 4G8-Färbung gekoppelt mit 647 nm Fluorophore).
   2. Bauen Sie ein coloc Kanal wie in den Schritten 4.1.2 bis 4.1.5 beschrieben.
   3. Klicken Sie auf den coloc Kanal Kanalstatistik zu öffnen. Die '% Volumen / Material A über dem Schwellenwert colocalized' stellt die% der Iba1 / LAMP1 oder Iba1 / CD68 colocalized mit OC oder 4G8-Signal (Voxel entsprechend dem 647 (Voxel zum coloc Kanal in Schritt 4.1.5. Gebaut entspricht) nm Fluorophore). Dies ist das phagolysosomalen Volumen von Aß besetzt (siehe 1D und 2D).
      HINWEIS: '% Volumen / Material B oberhalb der Schwelle colocalized' entspricht% der Gesamtmenge von Aß-Signal mit Phagolysosome colocalized.Dies kann dazu verwendet werden, um den Anteil des gesamten Aß Ablagerungen innerhalb Phagolysosome eingekapselt zu bewerten (nicht in den vorliegenden repräsentativen Ergebnisse gezeigt).
3. Verwenden Sie das Modul übertreffen die konfokale Bildstapel und erzeugen 3D-Modelle von Aß in Monozyten Phagolysosome eingekapselt zu rekonstruieren.
   1. Im Fenster "Anzeige Einstellung", wählen Sie TRITC (nur Iba1 Färbung zeigen). Im Fenster "Volume-Eigenschaften", klicken Sie auf "Hinzufügen neuer Oberfläche '.
   2. In Schritt '1/5 Algorithmus' in 'Einstellungen' wählen 'Oberfläche.' Auch in "Farbe" Farbtyp in der Palette oder RGB auszuwählen und anzupassen Transparenz (rot bei 60% Transparenz in den 1B und 2B eingestellt ist). Kontrollkästchen "wählen Region von Interesse". Klicken Sie auf Weiter.
   3. In Schritt '2/5 Region von Interesse " , ein Fenster um die Zelle von Interesse ziehen durch x Einstellung, y und z - Koordinaten (siehe weiße Kästchen in den 1A und 2A). Klicken Sie auf Weiter.
   4. In Step '3/5 Quellkanal ", wählen Sie den TRITC Quellkanal. Markieren Sie das Kästchen "glatt" und setzen Oberfläche Detailebene bis 0,4 um. Für "Thresholding" absolute Intensität auswählen. Klicken Sie auf Weiter.
   5. In Step '4/5 Schwelle "einstellen Schwelle, so dass das erzeugte Volumen perfekt mit dem Signal TRITC Kanal überlappt. Klicken Sie auf Weiter.
   6. In Step '5/5 Oberflächen klassifizieren, "in Abschnitt" Filtertyp "die Option Objekte in Abhängigkeit von ihrer Größe von den Volumina eingeschlossen oder ausgeschlossen werden, geschaffen werden. Klicken Sie auf Fertig, führen alle erforderlichen Schritten und den Assistenten zu beenden.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die FITC - Kanal (LAMP1 ⁺ oder CD68 ⁺ Phagolysosome) zu erstellen.
   8. Wiederholen Sie die Schritte 4.3.1 bis 4.3.6 eine 3D - Oberfläche für die Cy5 Kanal (OC ⁺ oder 4G8 ⁺ Aß Ablagerungen) zu erstellen.

Ergebnisse

Mit dem mehrstufigen Methodik für q3DISM oben beschrieben, sind wir in der Lage Aß - Aufnahme in Monozyten Phagolysosome im Gehirn von APP / PS1 - Mäuse (Abbildung 1) und TgF344-AD - Ratten (Abbildung 2) zu quantifizieren. Daher hat die q3DISM Methodik Analyse von mononukleären Phagozyten in Maus- und Rattenmodellen von AD aktiviert. Interessanterweise wird das Volumen besetzt durch CD68 ⁺ Phagolysosomen signifikant erhöht in Iba1 ^+<...

Diskussion

Das Protokoll , das wir in diesem Bericht für echte 3D - Quantifizierung von Aß Phagozytose in vivo durch mononukleäre Phagozyten beschreiben beruht auf einer spezifischen Kennzeichnung von zellulärer und subzellulärer Kompartimente sowie Aß Ablagerungen. Insbesondere verwenden wir Iba1 (ionisiertes-Calcium - Bindungs Adaptor - Molekül 1), ein Protein , das in ¹⁸ - Membran Kräuseln und Phagozytose bei Zellaktivierung beteiligt ^{ist, 19,} zerebrale mononukleären Phagozyten...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane	Abbott	NDC 0044-5260-05
Dissecting scissors	VWR	82027-582
Dissecting scissors Blunt tip	VWR	82027-588
Tweezers	VWR	94024-408
23 G needle	VWR	BD305145
peristaltic pump FH10	Thermo Scientific	72-310-010
PBS 10x	Bioland Scientific	PBS01-02	Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm	Kent Scientific	RBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm	Kent Scientific	RBMS-305C
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)	EMS	15714-S	Caution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
Ethanol	VWR	89125-188	Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes Sakura	VWR	25608-774
Embedding and Infiltration Paraffin	VWR	15147-839
Microtome Leica RM2125	Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades	VWR	25608-964
Water bath Leica HI 1210	Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plus	VWR	48311-703
Xylene	Sigma-Aldrich	534056-4X4L	Caution: Toxic
Target Retrieval Solution 10x	DAKO	S1699	Working concentration 1x
KimWipes	VWR	21905-026
Hydrophobic PAP pen	VWR	95025-252
Triton X-100	VWR	97062-208
Normal Donkey Serum (NDS)	Jackson Immuno	017-000-121
Coverslips	VWR	48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPI	Life Technologies	P36935
Glass Slide Rack	VWR	100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)	Wako	019-19741	Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat)	LifeSpan Bioscience	LS-B2645	Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)	Abcam	ab955	Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)	Abcam	ab53444	Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)	Affymetrix	14-1071	Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)	Covance	SIG-39220	Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)	Covance	SIG-39320	Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit)	Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)	Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibody	Invitrogen	A-11001	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibody	Invitrogen	A-11006	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11037	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibody	Invitrogen	A-11080	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibody	Invitrogen	A-21235	Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-21443	Working concentration 1:1,000
Immersion oil	Nikon
A1 Confocal microscope	Nikon
NIS Elements Advanced Research software	Nikon
Imaris:Bitplane software version 7.6	Bitplane		"coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.