JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פיתחנו מתודולוגיה 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) של-β עמילואיד מוחין (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר. שיטה זו ניתן להכליל עבור quantitation של כמעט כל אירוע phagocytic in vivo.

Abstract

Neuroinflammation מוכרת כיום כגורם אטיולוגי מרכזי למחלות ניווניות. פגוציטים mononuclear הם תאי מולד חיסוניים אחראים phagocytosis ופינוי פסול שאריות. תאים אלה כוללים מקרופאגים CNS-תושב המכונה microglia, ואת phagocytes mononuclear שחדר מהפריפריה. במיקרוסקופ אור כבר משמש בדרך כלל כדי לחזות phagocytosis ב מכרסמים או דגימות מוח אנושי. עם זאת, שיטות איכותיות לא ספקו ראיות מוחלטות של in vivo phagocytosis. כאן אנו מתארים 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM), שיטה חזקה המאפשרת לכמת 3D אמיתי של עמילואיד-β (Aβ) phagocytosis ידי פגוציטים mononuclear במחלת מכרסם אלצהיימר (AD) מודלים. השיטה כרוכה fluorescently חזותי Aβ כמוסה בתוך phagolysosomes בסעיפי מוח מכרסם. מערכי נתונים confocal z-ממדי גדולים אז 3D המשוחזר כדי לכמת את A &# 946; מרחבית colocalized בתוך phagolysosome. אנו מדגימים את היישום המוצלח של q3DISM כדי מוח עכבר וחולדה, אבל מתודולוגיה זו ניתן להרחיב כמעט כל אירוע phagocytic בכל רקמה.

Introduction

מחלת אלצהיימר (AD), דמנציה 1 הקשורה הגיל הנפוץ ביותר, מאופיין עמילואיד-β מוחין (Aβ) הצטברות כמו "סנילי" הפלאק β עמילואיד, neuroinflammation ברמה נמוכה כרונית, tauopathy, איבוד עצבי, והפרעה קוגניטיבית 2 . במוחות המטופל לספירה, neuroinflammation מיועד ידי תגובתי אסטרוציטים פגוציטים mononuclear (המכונה microglia, למרות המרכזי שלהם לעומת ממוצא הפריפריה עדיין לא ברור) שמסביב Aβ פיקדונות 3. כמו זקיפים החיסון המולדת של מערכת העצבים המרכזית, microglia ממוקמים מרכזי להצליל Aβ. עם זאת, גיוס microglial הפלאק Aβ מלווה מעט מאוד, אם בכלל, Aβ phagocytosis 4,5. אחת ההשערות היא כי microglia הם בתחילה נוירו ידי phagocytozing מכלולים קטנים של Aβ. עם זאת, בסופו של דבר תאים אלה הופכים הנוירו כמו נטל Aβ המכריע ו / או ד תפקודית כתוצאה מהזדקנותecline, מעורר microglia לתוך פנוטיפ מעודד דלקת מתפקדת, תורם לירידה ברעילות וקוגניטיביות 6.

הגנום כולו אחרונים מחקרים אגודים (GWAS) זיהו מקבץ של אללים לסיכון לחלות באלצהיימר השייכים מסלולי חיסון מולדים ליבת 7 לווסת phagocytosis 8-11. כתוצאה מכך, התגובה החיסונית בתצהיר עמילואיד מוחין הפך אזור מרכזי של עניין, הן מבחינת הבנת האטיולוגיה לספירה לפיתוח גישות טיפוליות חדשות 12-14. עם זאת, יש צורך חיוני מתודולוגיה להערכת phagocytosis Aβ in vivo. כדי לתת מענה לצורך מסופקים זה, פיתחנו 3D כמותית בדוגמנות סיליקון (q3DISM) כדי לאפשר quantitation 3D אמיתי של phagocytosis Aβ מוחין ידי פגוציטים mononuclear במודלים של מכרסמים של מחלת אלצהיימר דמוי.

מוגבל רק על ידי המידה שבה הם לשחזר מחלה, במודלים של בעלי החיים ישהוכח שלא יסולא בפז להבנה לספירה pathoetiology ולהערכה רפוי ניסיון. בשל העובדה כי מוטציות בגנים presenilin (PS) ו חלבון מקדים עמילואיד (APP) עצמאי לגרום לספירה אוטוזומלית דומיננטית, transgenes מוטציה אלה נעשה שימוש נרחב כדי ליצור מודלים מכרסם מהונדס. מהונדס APP / PS1 עכברים coexpressing זמנית "שוודית" APP האנושי מוטציה (swe APP) ו Δ אקסון 9 presenilin 1 אדם מוטציה (PS1ΔE9) הנוכחי עם עמילואידוזיס מוחין מואץ neuroinflammation 15,16. יתר על כן, יצרנו חולדות דו-מהונדס coinjected עם APP swe ובונה PS1ΔE9 (קו TgF344-AD, על רקע פישר 344). בניגוד למודלים עכבר מהונדס של עמילואידוזיס מוחין, חולדות TgF344-AD לפתח עמילואיד מוחין שמקדים tauopathy, אובדן אפופטוטיים של נוירונים, ו ליקוי התנהגותי 17.

בדו"ח זה, אנו מתארים פרוטוקול עבור IMMunostaining microglia, phagolysosomes ופיקדונות Aβ בסעיפי מוח מעכברי APP / PS1 וחולדות TgF344-AD, ורכישת תמונות confocal z-ממדי גדולות. נפרטנו בדור סיליקון וניתוח של שחזורי 3D אמיתיים ממערכות נתוני confocal המאפשרים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes microglial. באופן כללי יותר, מתודולוגיה נפרט כאן ניתן להשתמש כדי לכמת כמעט כל צורה של phagocytosis in vivo.

Protocol

הצהרה של אתיקה של מחקר: כל הניסויים מעורבים בעלי חיים המפורטים כאן אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים מוסדיים דרום קליפורניה ועדת שימוש (IACUC) וביצע בהתאם קפדנית עם National Institutes of הנחיות בריאות והמלצות מהאגודה הערכה וההסמכה של מעבדה הבינלאומי טיפול בבעלי חיים.

בידוד מוח 1. מכרסמים והכנת Immunostaining

יום 1:

  1. מניחים חולדות TgF344-AD בגילאי (14 בן חודש) או APP / עכברים PS1 (12 בן חודש) בהרדמה isoflurane עמוק רציפה (4%). להעריך את עומק ההרדמה על ידי צביטת בוהן והיעדר רפלקס נסיגה.
  2. חותך דרך משני צידי בית החזה ולהרים כדי לחשוף את הלב. הכנס מחט 23 G לתוך החדר השמאלי של הלב ולעשות חתך קטן לתוך העלייה הימנית. המשך exsanguination ידי זלוף transcardial עם פוספט שנאגרו מלוחים קר כקרח(PBS) באמצעות משאבת peristaltic (30 מ"ל לעכברים; 150 - 200 מ"ל לחולדות).
  3. ביצוע חתך קו האמצע הזנב לתוך העור ולהזיז את העור והשרירים בצד. חותך דרך החלק העליון של הגולגולת לאורך קו האמצע בין העיניים. הסר את צלחות עצם ולבודד את המוח כולו מהגולגולת.
  4. מניח את המוח לתוך מטריצת מוח מכרסם העטרה ופורס אותו לרבעים. דגירת רבעים אחוריים O / N (16 שעות) מקבע paraformaldehyde (PFA 4% PBS) ב 4 ° C.. 3x לשטוף PBS, ולאחר מכן להעביר עד 70% אתנול. זהירות: PFA הוא רעיל יש לטפל מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.

יום 2:

  1. מניח רבעים מוח לתוך קלטות הטבעה בהדרגה מייבשי רקמה באמבטיות יותר מרוכזות 1 h אתנול ברציפות (70%, 80%, 95% ו -100% x3).
  2. אתנול מנקה מהרקמה עם שלוש אמבטיות קסילן רצופות 100% (1 h כל אחד). זהירות: קסילן רעיל shולד להיות מטופלים מתחת למכסה המנוע כימי עם ציוד מיגון אישי המתאים.
  3. הטמע רקמה בבלוקי פרפין לאחר שתי אמבטיות מותכות פרפין שעווה (56 - 58 ° C, 90 דקות כל אחד).

יום 3:

  1. חותכים 10 סעיפים מיקרומטר בעובי של המוח פרפין מוטבע באמצעות microtome. סעיפים לטבול באמבט מים (50 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות) ולמרוח על שקופיות מיקרוסקופ. השאירו את השקופיות להתייבש O / N, הבטחת הידבקות רקמות לשקופית.

2. Immunostaining

הערה: שילובים שונים של נוגדנים יכולים להיות מנוצלים עבור ההליך המכתים המתואר להלן. קוקטיילים נוגדן תואם רקמות המוח מפני חולדות ועכברים מפורטים בטבלה 1.

יום 4:

  1. Deparaffinize החלק במוח באמצעות אמבטיות קסילן 2x 100% (12 דקות כל אחד).
  2. רעננותם חלקים במוח באמבטיות אתנול רצופות - 100% במשך 10 דקות, 95% במשך 5 דקות, 80% במשך 10 דקות, ולבסוף 70% במשך 15 דקות - followeד על ידי שטיפות 3x PBS [5 דקות ב RT, עם תסיסה אור]. בינתיים, פתרון יחזור אנטיגן חום עד 95 - 97 ° C על פלטה חשמלית עם ערבוב בר מגנטי.
  3. דגירה חלקה במוח בתמיסה יחזור אנטיגן ב 95 - C ° 97 למשך 30 דקות. לאחר מכן, לשטוף 3x ב PBS (5 דקות ב RT, עם תסיסה אור).
  4. מגלשות יבשות במהירות באמצעות מגבי משימה עדינים כדי למנוע התייבשות רקמה, ולהסיק מחסום הידרופובי מסביב לאזור הרקמה עם עט מחסום הידרופובי. מלא את אזור הרקמה הקיף עם חסימת חיץ [PBS המכיל 0.3% Triton X-100 ו -10% סרום דונקי רגיל (NDS)], לדגור על RT עבור 1 שעות בתא humidified.
  5. חלף חיץ חסימה עם נוגדן ראשוני Iba1 (מדולל במאגר חסימה) לתייג פגוציטים mononuclear, דגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס בתא humidified. עבור המארחים נוגדן דילולים עובדים, ראה טבלה 1 טבלה של חומרים.

יום 5:

  1. לִשְׁטוֹףנוגדן ראשוני עם אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). דגירה עם נוגדנים משני ניאון (מצומדות עם fluorophore פליטה 594 ננומטר) עבור H 1 (בחסימת המאגר ב RT בחושך) ואחריו אמבטיות 3x PBS (5 דקות ב RT עם תסיסה אור). בשלב זה, לשמור על סעיפים בחושך כדי למנוע הלבנת אות ניאון.

יום 6 - 7:

  1. חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם CD68 (מוח עכברוש) או LAMP1 (רקמות עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (בשילוב עם fluorophore פליטה 488 ננומטר) לתייג phagolysosomes.

יום 7 - 8:

  1. חזור על שלבי 2.5 & 2.6 עם OC (רקמות חולדה) או 4G8 (מוח עכבר) נוגדנים ונוגדנים משני מתאימים (מצמיד את fluorophore 647 ננומטר) לתייג פיקדונות Aβ.
    הערה: לחלופין, נוגדני 6E10 יכול לשמש היא בהצלחה על רקמות עכבר וחולדה. עבור שילובים נוגדנים מתאימים, ראה טבלה של חומרים .
  2. אפשר סעיפים לגמרי יבש O / N ב RT בחושך. לאחר מכן, לכסות דגימות עם תלוש כיסוי האטום על ידי תקשורת הרכבת קרינה המכילה DAPI.

3. רכישת מערכי נתונים גדולים Confocal Z- מחסנית

הערה: פרוטוקול זה דורש מיקרוסקופ confocal סריקת לייזר אוטומטי לחלוטין מצויד מטרה 60X ו 405 ננומטר, 488 ננומטר, 594 ננומטר, ו 647 nm לייזרים. כל הציוד הוא מחשב בשליטת תוכנות שליטה הדמיה לייזר. לפני תחילת פרוטוקול ההדמיה, כוח על מנורת המחשב, epifluorescent, מיקרוסקופ, לייזרי מצלמה.

יום 9:

  1. בחר את מטרת מיקרוסקופ 60X. מוסיפים שמן טבילה העדשה, ומניחים את המדגם על מחזיק השקופיות הבמה מיקרוסקופ. הרם את המטרה עד שהשמן יוצר קשר עם השקופיות. התאם את מישור המוקד לאיתור פלאק עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת המוח באמצעות תאורה epifluorescent דרך oculars.
  2. רוכשת im confocalהגילאים של פגוציטים mononuclear מופעל שמסביב פיקדונות עמילואיד בהיפוקמפוס או קליפת מכרסמים על ידי מיקרוסקופ confocal (בהגדלה 60X, צעדים Z- מחסנית: 0.25 מיקרומטר

4. q3DISM

הערה: על מנת להניב תוצאות משמעותיות, אנו ממליצים לנתח מינימום של 3 תמונות לכל חיה / אזור של עניין. עבור כל תמונה, השפע של תאים לנתח עשוי להשתנות תלוי פרדיגמות ניסוי. בתוצאות נציג שהוכח בדו"ח זה, ניתחנו מצב 3 תאים / (למשל, mononuclear פגוציטים רחוקים או הקשורים הפלאק; לראות 1C דמויות - D ו- 2C - D).

יום 10:

  1. לנתח מערכי נתונים confocal עם colocalization תוכנת ניתוח עיבוד תמונה 3D מדעית (coloc) מודול בקרבה מרחבית של Iba1 / CD68 (רקמות חולדה) או Iba1 / LAMP1 (רקמות העכבר) מכתים בכל z-מטוסים בו זמנית.צור איבא + / CD68 + או איבא + / LAMP1 + colocalization הערוצים מתאימות phagolysosomes בתוך פגוציטים mononuclear מופעל.
    1. בחר TRITC עבור ערוץ A (המקביל ל מכתים Iba1 יחד עם 594 fluorophore ננומטר) FITC עבור B ערוץ (המקביל ל CD68 או מכתים LAMP1 יחד עם 488 fluorophore ננומטר). בצד הימני של חלון התוכנה עבור 'בדיקת מצב, בחר' סף 'ועבור' עוצמות coloc 'בחר' ערוצי מקור '.
    2. לחץ על 'ערוך' כדי לבחור 'צבע coloc' בצד הימני של חלון התוכנה.
    3. עבור כל ערוץ בנפרד, להתאים ספים לכלול מכתים ספציפי ואינו כולל אותות רקע / הלא ספציפיים. לאחר מותאם, לא לשנות ספים בין תמונות על מנת להבטיח ניתוח משוחד. ווקסלים colocalized (פיקסלים מכל Z- ערימות) יופיעו בצבע שנבחר בשלב 4.1.2 בכל Z- ערימות SIMultaneously.
    4. לחץ על 'לבנות ערוץ coloc'. ערוץ colocalization נוצר יופיע בחלון התאמת תצוגה.
    5. הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% ממסר Iba1 (ווקסלים המתאימים fluorophore 594 ננומטר) colocalized עם LAMP1 או אות CD68 (ווקסלים המתאימים fluorophore 488 ננומטר). יותר פשוט, זה הוא נפח מונוציטים שנכבשו על ידי phagolysosomes (ראה איורים 1 ג ו 2C).
      הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' תואמת% ממסר LAMP1 או CD68 colocalized עם Iba1. זה צריך להיות קרוב ל -100%, כפי phagolysosomes הם מבנים תאיים. הערכים מבוססים על יחס של אות מכל Z- ערימות מעל לסף colocalized.
  2. באמצעות מודול coloc, לנתח את ערוץ coloc שנוצרה בשלב 4.1 בקרבה מרחבית עם OC (עכברוש tissue) או 4G8 (רקמות העכבר) אותות Aβ. זה מאפשר לכמת Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes.
    1. בחרו בערוץ מערך נתונים coloc (המקביל ל Iba1 / CD68 או Iba1 / LAMP1 coloc ערוץ שנוצרה בשלב 4.1) ו Cy5 עבור B ערוץ (fluorophore המתאים OC או 4G8 מכתים יחד עם 647 ננומטר).
    2. בניית ערוץ coloc כמתואר 4.1.2 צעדים 4.1.5.
    3. הקישו על ערוץ coloc לפתוח סטטיסטיקת הערוץ. ערך '% נפח / חומר מעל לסף colocalized' מייצגים את% של Iba1 / LAMP1 או Iba1 / CD68 (ווקסלים מקבילים לערוץ coloc נבנה בשלב 4.1.5.) Colocalized עם OC או אות 4G8 (ווקסלים מתאימים 647 fluorophore ננומטר). זהו נפח phagolysosomal שנכבשו על ידי Aβ (ראו תרשימים 1D ו 2 ד).
      הערה: '% של נפח / חומר B מעל לסף colocalized' מתכתב עם% ממסר Aβ הכולל colocalized עם phagolysosomes.זה יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי של פיקדונות Aβ הכוללים כמוסות בתוך phagolysosomes (לא מוצג בתוצאות הנציג הנוכחיות).
  3. השתמש מודול לעלות לשחזר את ערימות תמונת confocal וליצור מודלי 3D של Aβ הכמוס בתוך phagolysosomes מונוציטים.
    1. בחלון 'תצוגת ההתאמה', בחר TRITC (כדי להציג רק מכתים Iba1). בחלון 'מאפייני נפח', לחץ על 'הוסף שטח חדש'.
    2. בשלב '1/5 אלגוריתם', ב 'הגדרות', בחר 'משטח'. כמו כן, ב 'צבע', בחר סוג צבע צבעים או RGB ולהתאים שקיפות (אדום מוגדר ב 60% שקיפות איורים 1B ו -2). סמן תיבה 'בחר אזור של אינטרס ". לחץ הבא.
    3. בשלב '2/5 האזור של עניין, "לצייר חלון סביב תא העניין על ידי התאמת x, y ו- z קואורדינטות (ראו תיבות לבנות איורי 1A ו 2 א). לחץ הבא.
    4. בשלב 'ערוץ מקור 3/5', בחרו בערוץ מקור TRITC. סמן את התיבה 'חלקה' ורמת פירוט שטח מוגדר 0.4 מיקרומטר. עבור 'thresholding,' לבחור עוצמת מוחלטת. לחץ הבא.
    5. בשלב '4/5 סף, "להתאים סף כך הנפח נוצר חופף באופן מושלם עם אות ערוץ TRITC. לחץ הבא.
    6. בשלב '5/5 לסווג משטחים, "בסעיף" סוג מסנן, "בחר אובייקטים בהתאם לגודלם להיכלל או מחוץ כרכים להיווצר. לחץ על סיום, לבצע את כל שלבי היצירה, וצא האשף.
    7. חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ FITC (LAMP1 + או CD68 + phagolysosomes).
    8. חזור על שלבים 4.3.1 עד 4.3.6 כדי ליצור משטח 3D עבור הערוץ Cy5 (OC + או 4G8 + Aβ פיקדונות).

תוצאות

באמצעות מתודולוגיה רב שלבית עבור q3DISM שפורטו לעיל, אנו מסוגלים לכמת ספיגת Aβ לתוך phagolysosomes מונוציטים במוחם של עכברים APP / PS1 (איור 1) וחולדות TgF344-AD (איור 2). לכן, המתודולוגיה q3DISM אפשרה ניתוח פגוציטים mononuclear במודלים של עכברים וחולדה של AD. מ?...

Discussion

הפרוטוקול זה אנו מתארים בדוח זה כדי לכמת 3D אמיתי של phagocytosis Aβ in vivo על ידי פגוציטים mononuclear מסתמך על תיוג ספציפי של תאים סלולריים ו subcellular וכן פיקדונות Aβ. באופן ספציפי, אנו משתמשים Iba1 (מיונן בסידן כריכה מתאם המולקולה 1), חלבון כי הוא מעורב עלעול קרום phagocytosis על תא הפעלה ...

Disclosures

החוקרים אין לי מה לחשוף.

Acknowledgements

M-V.G-S. is supported by a BrightFocus Foundation Alzheimer's Disease Research Fellowship Award (A2015309F) and an Alzheimer's Association, California Southland Chapter Young Investigator Award. T.M.W. is supported by an ARCS Foundation and John Douglas French Alzheimer's Foundation Maggie McKnight Russell-JDFAF Memorial Postdoctoral Fellowship. This work was supported by the National Institute on Neurologic Disorders and Stroke (1R01NS076794-01, to T.T.), an Alzheimer's Association Zenith Fellows Award (ZEN-10-174633, to T.T.), and an American Federation of Aging Research/Ellison Medical Foundation Julie Martin Mid-Career Award in Aging Research (M11472, to T.T.). We are grateful for startup funds from the Zilkha Neurogenetic Institute, which helped to make this work possible.  

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
IsofluraneAbbottNDC 0044-5260-05
Dissecting scissorsVWR82027-582
Dissecting scissors Blunt tipVWR82027-588
TweezersVWR94024-408
23 G needleVWRBD305145
peristaltic pump FH10Thermo Scientific72-310-010
PBS 10xBioland ScientificPBS01-02Phosphate-buffered Saline; Working concentration 1x
Adult Mouse Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm Kent ScientificRBMS-200C
Adult Rat Brain Matrix, Coronal slices, Stainless Steel 1 mm Kent ScientificRBMS-305C 
32% Paraformaldehyde aqueous solution (PFA)EMS15714-SCaution: Toxic. Working concentration: 4% in PBS
EthanolVWR89125-188Various concentrations, see protocol
Tissue-Tek Uni-cassettes SakuraVWR25608-774
Embedding and Infiltration ParaffinVWR15147-839
Microtome Leica RM2125Leica Biosystems
Disposable Microtome Blades VWR25608-964
Water bath Leica HI 1210Leica Biosystems
Micro slide Superfrost plusVWR48311-703
XyleneSigma-Aldrich534056-4X4LCaution: Toxic 
Target Retrieval Solution 10xDAKOS1699Working concentration 1x
KimWipesVWR21905-026
Hydrophobic PAP penVWR95025-252
Triton X-100VWR97062-208
Normal Donkey Serum (NDS)Jackson Immuno017-000-121
CoverslipsVWR48393081
Prolong Gold antifade reagent with DAPILife TechnologiesP36935
Glass Slide RackVWR100492-942
Iba1 antibody (polyclonal, rabbit)Wako019-19741 Working concentration 1:200
Iba1 antibody (polyclonal, goat)LifeSpan BioscienceLS-B2645Working concentration 1:200
rat CD68 [KP1] antibody (monoclonal, mouse)Abcamab955Working concentration 1:200
mouse CD68 [FA-11] antibody (monoclonal, rat)Abcamab53444Working concentration 1:200
mouse CD107a (LAMP1) antibody (monoclonal, rat)Affymetrix14-1071Working concentration 1:100
Beta-Amyloid, 17 - 24 (4G8) antibody (monoclonal, mouse)CovanceSIG-39220Working concentration 1:200
Beta-Amyloid, 1 - 16 (6E10) antibody (monoclonal, mouse)CovanceSIG-39320Working concentration 1:200
OC antibody (polyclonal, rabbit)Gifted by D. H. Cribbs and C. G. Glabe (UC Irvine)Working concentration 1:200
Alexa Fluor 488 mouse secondary antibodyInvitrogenA-11001Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 488 rat secondary antibodyInvitrogenA-11006Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 rabbit secondary antibodyInvitrogenA-11037Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 594 goat secondary antibodyInvitrogenA-11080Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 mouse secondary antibodyInvitrogenA-21235Working concentration 1:1,000
Alexa Fluor 647 rabbit secondary antibodyInvitrogenA-21443Working concentration 1:1,000
Immersion oilNikon 
A1 Confocal microscopeNikon 
NIS Elements Advanced Research softwareNikon 
Imaris:Bitplane software version 7.6Bitplane"coloc" and "supass" modules are used. Alternatively, the open-source freeware ImageJ can be used for colocalization analysis of confocal z-stacks datasets.

References

  1. Brookmeyer, R., et al. National estimates of the prevalence of Alzheimer's disease in the United States. Alzheimers Dement. 7 (1), 61-73 (2011).
  2. Selkoe, D. J. Alzheimer's disease. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (7), (2011).
  3. Heneka, M. T., Golenbock, D. T., Latz, E. Innate immunity in Alzheimer's disease. Nat Immunol. 16 (3), 229-236 (2015).
  4. Mawuenyega, , et al. Decreased clearance of CNS beta-amyloid in Alzheimer's disease. Science. 330 (6012), 1774 (2010).
  5. Hickman, S. E., Allison, E. K., El Khoury, J. Microglial dysfunction and defective beta-amyloid clearance pathways in aging Alzheimer's disease mice. J Neurosci. 28 (33), 8354-8360 (2008).
  6. Johnston, H., Boutin, H., Allan, S. M. Assessing the contribution of inflammation in models of Alzheimer's disease. Biochem Soc Trans. 39 (4), 886-890 (2011).
  7. Gjoneska, E., et al. Conserved epigenomic signals in mice and humans reveal immune basis of Alzheimer's disease. Nature. 518 (7539), 365-369 (2015).
  8. Reitz, C., Mayeux, R. Alzheimer disease: epidemiology, diagnostic criteria, risk factors and biomarkers. Biochem Pharmacol. 88 (4), 640-651 (2014).
  9. Hazrati, L. -. N., et al. Genetic association of CR1 with Alzheimer's disease: a tentative disease mechanism. Neurobiol Aging. 33 (12), 2949 (2012).
  10. Griciuc, A., et al. Alzheimer's Disease Risk Gene CD33 Inhibits Microglial Uptake of Amyloid Beta. Neuron. , 1-13 (2013).
  11. Li, X., Long, J., He, T., Belshaw, R., Scott, J. Integrated genomic approaches identify major pathways and upstream regulators in late onset Alzheimer's disease. Scientific reports. 5, 12393 (2015).
  12. Weitz, T. M., Town, T. Microglia in Alzheimers Disease: "Its All About Context". Int J Alzheimers Dis. , 314185 (2012).
  13. Guillot-Sestier, M. -. V., Doty, K. R., Town, T. Innate Immunity Fights Alzheimer's Disease. Trends Neurosci. 38 (11), 674-681 (2015).
  14. Guillot-Sestier, M. -. V., Town, T. Innate immunity in Alzheimer's disease: a complex affair. CNS Neurol Disord Drug Targets. 12 (5), 593-607 (2013).
  15. Jankowsky, J. L., Slunt, H. H., Ratovitski, T., Jenkins, N. A., Copeland, N. G., Borchelt, D. R. Co-expression of multiple transgenes in mouse CNS: a comparison of strategies. Biomol Eng. 17 (6), 157-165 (2001).
  16. Guillot-Sestier, M. -. V., et al. Il10 deficiency rebalances innate immunity to mitigate Alzheimer-like pathology. Neuron. 85 (3), 534-548 (2015).
  17. Cohen, R. M., et al. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric aβ, and frank neuronal loss. J Neurosci. 33 (15), 6245-6256 (2013).
  18. Imai, Y., Ibata, I., Ito, D., Ohsawa, K., Kohsaka, S. A novel gene iba1 in the major histocompatibility complex class III region encoding an EF hand protein expressed in a monocytic lineage. Biochem. Biophys. Res. Commun. 224 (3), 855-862 (1996).
  19. Ohsawa, K., Imai, Y., Sasaki, Y., Kohsaka, S. Microglia/macrophage-specific protein Iba1 binds to fimbrin and enhances its actin-bundling activity. J Neurochem. 88 (4), 844-856 (2004).
  20. Bandyopadhyay, U., Nagy, M., Fenton, W. A., Horwich, A. L. Absence of lipofuscin in motor neurons of SOD1-linked ALS mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (30), 11055-11060 (2014).
  21. Holness, C. L., Simmons, D. L. Molecular cloning of CD68, a human macrophage marker related to lysosomal glycoproteins. Blood. 81 (6), 1607-1613 (1993).
  22. Connor, T., et al. Phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha increases BACE1 levels and promotes amyloidogenesis. Neuron. 60 (6), 988-1009 (2008).
  23. Cai, D., et al. Phospholipase D1 corrects impaired betaAPP trafficking and neurite outgrowth in familial Alzheimer's disease-linked presenilin-1 mutant neurons. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (6), 1936-1940 (2006).
  24. Marsh, S. E., et al. The adaptive immune system restrains Alzheimer's disease pathogenesis by modulating microglial function. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (9), 1316-1325 (2016).
  25. Lefterov, I., et al. Apolipoprotein A-I deficiency increases cerebral amyloid angiopathy and cognitive deficits in APP/PS1DeltaE9 mice. J Biol. Chem. 285 (47), 36945-36957 (2010).
  26. Blurton-Jones, M., et al. Neural stem cells improve cognition via BDNF in a transgenic model of Alzheimer disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (32), 13594-13599 (2009).
  27. Stalder, M., Deller, T., Staufenbiel, M., Jucker, M. 3D-Reconstruction of microglia and amyloid in APP23 transgenic mice: no evidence of intracellular amyloid. Neurobiol Aging. 22 (3), 427-434 (2001).
  28. Leinenga, G., Götz, J. Scanning ultrasound removes amyloid-β and restores memory in an Alzheimer's disease mouse model. Sci Transl Med. 7 (278), 33 (2015).
  29. Liarski, V. M., et al. Cell distance mapping identifies functional T follicular helper cells in inflamed human renal tissue. Sci Transl Med. 6 (230), 46 (2014).
  30. Nichols, L., Pike, V. W., Cai, L., Innis, R. B. Imaging and in vivo quantitation of beta-amyloid: an exemplary biomarker for Alzheimer's disease. Biol Psychiatry. 59 (10), 940-947 (2006).
  31. Skovronsky, D. M., Zhang, B., Kung, M. P., Kung, H. F., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. In vivo detection of amyloid plaques in a mouse model of Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (13), 7609-7614 (2000).
  32. Lian, H., Litvinchuk, A., Chiang, A. C. -. A., Aithmitti, N., Jankowsky, J. L., Zheng, H. Astrocyte-Microglia Cross Talk through Complement Activation Modulates Amyloid Pathology in Mouse Models of Alzheimer's Disease. J Neurosci. 36 (2), 577-589 (2016).
  33. Novotny, R., et al. Conversion of Synthetic Aβ to In Vivo Active Seeds and Amyloid Plaque Formation in a Hippocampal Slice Culture Model. J Neurosci. 36 (18), 5084-5093 (2016).
  34. Tartaro, K., et al. Development of a fluorescence-based in vivo phagocytosis assay to measure mononuclear phagocyte system function in the rat. J Immunotoxicol. 12 (3), 239-246 (2015).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

118q3DISMTgF344 ADAPP PS1phagocytosismicrogliaphagolysosome

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved