El uso de andamios liposomas para reconstituir las interacciones proteína-proteína-lípidos proximal<em&gt; In Vitro</em

Resumen

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Resumen

Los estudios de proteínas integrales de membrana in vitro con frecuencia se complica por la presencia de un dominio transmembrana hidrófobo. Para complicar aún más estos estudios, la reincorporación de proteínas de membrana solubilizada con detergente en los liposomas es un proceso estocástico donde topología de la proteína es imposible de aplicar. Este trabajo ofrece un método alternativo para estas técnicas desafiantes que utiliza un andamio a base de liposomas. solubilidad de la proteína se ve reforzada por la supresión del dominio transmembrana, y estos aminoácidos se sustituyen con un resto de anclaje, tal como una etiqueta de His. Esta correa de sujeción interactúa con un grupo de anclaje (Ni ²⁺ coordinado por ácido nitrilotriacético (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ para marcado con His proteínas), que hace cumplir una topología de proteína uniforme en la superficie del liposoma. Se presenta un ejemplo en el que la interacción entre la proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) con una proteína de membrana, la fisión mitocondrial Factor (MFP), fue investigated utilizando este método andamio liposoma. En este trabajo, hemos demostrado la capacidad de reclutar Mff eficiente Drp1 solubles a la superficie de los liposomas, que estimuló su actividad GTPasa. Por otra parte, Drp1 pudo tubulate la plantilla de lípidos decorados a Mff en presencia de lípidos específicos. Este ejemplo demuestra la eficacia de los liposomas de andamio usando ensayos estructurales y funcionales y destaca el papel de Mff en la regulación de la actividad Drp1.

Introducción

El estudio de las interacciones proteína-proteína de membrana proximal es una tarea difícil debido a la dificultad para recapitular el entorno natural de las proteínas integrales de membrana que participan ^1. Esto es debido a la necesidad de solubilización de detergente y la orientación inconsistente de proteínas en proteoliposomas. Con el fin de evitar estos problemas, se ha empleado una estrategia en la que dominios solubles de proteínas integrales de membrana se expresan como proteínas de fusión His-tag, y estos fragmentos solubles están anclados a los liposomas de andamio a través de interacciones con NTA (Ni ²⁺⁾ grupos de cabeza en el lípido superficie. El uso de estos andamios, las interacciones proteína-lípido proximal pueden ser investigados en un rango de composiciones de lípidos y proteínas.

Hemos aplicado con eficacia este método para investigar las interacciones proteína-proteína críticos que rigen el ensamblaje del complejo de la fisión mitocondrial y examinar las interacciones de lípidos que modulan este proceso ^2. Durante la fisión mitocondrial, una proteína de la remodelación de membrana conservada, denominado proteína relacionada con dynamin 1 (Drp1) ^3, es reclutado para la superficie de la externa mitocondrial membrana (OMM) en respuesta a señales celulares que regulan la homeostasis de la energía, la señalización de apoptosis, y varias otras procesos mitocondriales integrales. Este GTPasa grande, citosólica es reclutado a la superficie de la mitocondria a través de interacciones con proteínas integrales de OMM ^{4 - 8.} El papel de una de tales proteínas, Fisión mitocondrial Factor (MFP), ha sido difícil de dilucidar debido a una débil interacción aparente con Drp1 in vitro. Sin embargo, los estudios genéticos han demostrado claramente que Mff es esencial para el éxito de ^7,8 fisión mitocondrial. El método descrito en este manuscrito fue capaz de superar las deficiencias anteriores mediante la introducción de lípidos interacciones simultáneas que promueven interacciones Drp1-MFP. En general, este novedoso ensayo REVEAconducido interacciones fundamentales ensamblaje del complejo de fisión mitocondrial de guía y proporcionó una nueva etapa para estudios estructurales y funcionales en curso de esta máquina molecular esencial.

Hasta la fecha, el examen de las interacciones entre Drp1 y Mff se han complicado por la flexibilidad inherente de Mff ^9, la heterogeneidad de Drp1 Polímeros ^2,10, y la dificultad en la purificación y reconstitución de longitud completa Mff con un dominio transmembrana intactas ^11. Hemos abordado estos problemas mediante el uso de liposomas NTA (Ni2 ⁺⁾ de andamios para reconstituir His-Mff que carece de su dominio transmembrana (MffΔTM-Su _6). Esta estrategia fue una ventaja, ya MffΔTM era extremadamente soluble cuando se sobre-expresan en E. coli, y esta proteína aislada se reconstituyó fácilmente en liposomas de andamios. Cuando atado a estas plantillas de lípidos, Mff asumió una, la orientación hacia el exterior idéntica en la superficie de la membrana.Además de estas ventajas, los lípidos mitocondriales, tales como cardiolipina, se añadieron a estabilizar Mff plegado y la asociación con la membrana ^11. La cardiolipina también interactúa con el dominio variable de Drp1 ^2,12 que puede estabilizar esta región desordenada y facilitar el montaje de la maquinaria de fisión.

Este método robusto es ampliamente aplicable para futuros estudios que pretenden evaluar las interacciones proteína-membrana proximal. Mediante el uso de interacciones adicionales tethering / afinidad, la sofisticación de estos estudios de reconstitución de membrana se puede mejorar para imitar la complejidad adicional que se encuentra en la superficie de las membranas dentro de las células. Al mismo tiempo, las composiciones lipídicas se pueden modificar para imitar con mayor precisión los ambientes nativos de estos complejos macromoleculares. En resumen, este método proporciona un medio para examinar las contribuciones relativas de las proteínas y lípidos de membrana en la configuración de morfologías que durante proc celulares críticaseses.

Protocolo

1. Preparación de liposomas Andamios

NOTA: Idealmente, los experimentos iniciales se debe utilizar un andamio relativamente simple y sin rasgos (compuesto por DOPC (1,2-sn dioleoyl- glicero-3-fosfocolina o PC) y DGS-NTA (Ni2 ⁺⁾ (1,2-dioleoil - sn -glicero-3 - [(N - (5-amino-1-carboxipentil) iminodiacético) succinil]. (sal de níquel)) Building fuera de estos experimentos, la carga de los lípidos, la flexibilidad, y la curvatura puede introducirse como factores individuales con el potencial de alterar las interacciones de membrana proximal. Estos cambios se pueden lograr mediante la adición de cantidades definidas de los constituyentes lipídicos específicos, incluyendo fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolamina (DOPE o PE), o galactosil ceramida (β).

1. Combinar los lípidos disueltos en cloroformo en un tubo de ensayo de vidrio limpio. Se evapora el disolvente con gas nitrógeno seco mientras se gira el tubo para formar una película lipídica delgada. Eliminar el disolvente residual con una centrifugal evaporador durante 1 hora a 37 ° C.
   NOTA: Varias formulaciones de liposomas se utilizan en los protocolos descritos a continuación: liposomas de andamio (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 96,7% en moles de DOPC), liposomas de andamio con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10% en moles cardiolipina / 86,7% en moles de DOPC), liposomas andamio flexibles con cardiolipina (3,3% en moles DGS-NTA (Ni2 ⁺⁾ / 10% en moles cardiolipina / 35% en moles de DOPE / DOPC 51,7% en moles), y el andamio enriquecido liposomas (10% en moles DGS-NTA (Ni2 ⁺⁾ / 15% en moles cardiolipina / 35% mol DOPE / DOPC 40% en moles).
2. Añadir Tampón A (HEPES 25 mM (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico), KCl 150 mM, pH ajustado a 7,5 con KOH) precalentado a 37 ° C tal que la concentración final de lípidos es de 1 - 2 mM. Incubar 30 min a 37 ° C con agitación ocasional para resuspender completamente la mezcla de lípidos (Figura 1a).
3. Transferir a un tubo de ensayo de plástico, colocar el tubo en nitrógeno líquido hasta que esté completamente congelado (rougHly 30 s), y el lugar en un baño de agua a 37 ° hasta que esté completamente descongelado (aproximadamente 1 - 2 min). Repita para un total de 4 ciclos de congelación-descongelación (Figura 1b).
4. Preparar una extrusora de lípidos por remojo 4 soportes de filtro y un filtro de policarbonato en tampón y montaje de la máquina de extrusión de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Extruir la solución de lípidos a través del filtro 21 veces. Use una presión suave y constante para asegurar una distribución homogénea de tamaño (Figura 1c).
   NOTA: Para todos los experimentos descritos en este protocolo, se utilizó un filtro de 1,0 micras de policarbonato para la extrusión. Interacción Drp1 con los lípidos aniónicos se puede observar con una variedad de diámetros de liposomas que van de 50 nm a 400 nm ¹² o más grande ^13. Por lo tanto, el tamaño del filtro de 1 m se elige para que sea ideal para la actividad GTPasa y de microscopía electrónica. Si se desean otros diámetros de liposomas, la preparación de vesículas unilamelares gigantes ^(14,15) o GUVs pequeña unilamellar vesículas ¹⁶ (SUVs) se puede utilizar. Dispersión dinámica de luz se puede utilizar para evaluar la heterogeneidad de liposomas de tamaño ^13.
5. Almacenar los liposomas extruidos a 4 ° C y descartar después de 3 - 5 de d.

2. Uso de Andamios liposomas para análisis de unión de proteínas

1. Preparación de la muestra
   1. Incubar Su-etiquetados MffΔTM (5 mM final) con liposomas de andamio (40% mol PC / 35% mol de PE / 15% mol CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni ^2+); 50 mM final) durante al menos 15 min a TA en tampón a + BME (HEPES 25 mM, KCl 150 mM, 10 mM β-mercaptoetanol (BME), pH ajustado a 7,5 con KOH). Para un control Mff libre, incubar liposomas con una marcada His proteína de control (tal como GFP) para atar y blindaje expuesto NTA (Ni2 ^+).
      NOTA: MffΔTM se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo ^2. GFP se purificó de una manera similar, pero se omitió la etapa de intercambio iónico. BME se requiere para estos experiments porque Drp1 es sensible a la oxidación, lo que puede alterar sus propiedades de actividad y de montaje.
   2. Añadir Drp1 (2 mM final) y se incuba durante 1 h a TA.
      NOTA: Drp1 se expresó y se purificó como se describe en un estudio previo ^2. Después de la incubación con Drp1, el efecto de la unión en la deformación de la membrana de nucleótidos puede ser investigado mediante la incubación de una hora más con 2 mM MgCl ₂ y, o bien GTP 1 mM, 1 mM GMP-PCP, o tampón A + BME.
2. Negativo a las manchas Microscopía Electrónica de Transmisión (EM) Análisis
   1. Transferencia de 5 l de muestra a una hoja de película de laboratorio y colocar una rejilla de Cu / Rh revestida de carbono en la muestra. Incubar la cuadrícula 1 min de la muestra, seque el exceso de líquido en el papel de filtro, y la transferencia a una gota de acetato de uranilo al 2%. Incubar 1 min, secar el exceso de tinta sobre papel de filtro, y la transfiere a una celda de la malla. Tienda al vacío O / N para asegurar la desecación completa.
   2. muestras de imagen utilizando un microsc electrónica de transmisiónOPE en 18.500 - 30,000X magnificación para observar los cambios ultraestructurales en proteínas y liposomas morfologías ^17.
      Nota: los cambios ultraestructurales pueden ser cuantificados usando el software de análisis de imágenes, tales como ImageJ ¹³ (http://imagej.nih.gov/ij/). decoración de proteína se puede medir cuando se compara con las plantillas de lípidos desnudos. Además, los diámetros de los segmentos tubulares se pueden medir desde la parte más externa de los conjuntos de ^13. Un análisis más detallado se puede realizar utilizando crio-microscopía electrónica ^17. Este método se puede utilizar para conjuntos de proteína-lípido nativas de la imagen en el disolvente sin el uso de manchas de metal pesado que la capa de la muestra. De esta forma, las características estructurales detallados no aparentes en tinción negativa, incluyendo cambios en la morfología de lípidos subyacente, pueden ser examinados y cuantificados.

3. El uso de liposomas para Andamios Ensayo enzimático

Nota: Un coloriensayo de GTPasa métrica ¹⁸ se utilizó para medir la liberación de fosfato a través de la hidrólisis de GTP. Ensayos de GTPasa alternativos están disponibles ¹⁹ y se pueden implementar según sea necesario.

1. Incubar Su-etiquetados MffΔTM (MFP), Fis1ΔTM (Fis1) o GFP (5 mM final para todos) con liposomas de andamio (150 mM final) durante 15 min a TA en tampón A + BME (volumen = 30 l). Añadir Drp1 (500 nM final) y se incuba 15 minutos más a temperatura ambiente (volumen = 80 l).
   NOTA: Fis1 se purificó de una manera similar a Mff ^2, pero se omitió la etapa de cromatografía de intercambio iónico. El propósito de His-GFP es para proteger a la NTA grupos de cabeza (Ni2 ⁺⁾ y evitar interacciones de carga no específicos con otras proteínas. Si no se observa efecto en ausencia de GFP, a continuación, este control puede no ser necesaria. proteínas de bloqueo alternativos (de tamaño comparable al de la proteína de interés) se pueden utilizar también, pero GFP permite la visualización directa de las interacciones con SCAFdoblar liposomas.
2. Tubos de transferencia a un termociclador establece en 37 ° C, e inician las reacciones por adición de GTP y _MgCl2 (1 mM y final 2 mM, respectivamente; volumen = 120 l).
3. En los puntos de tiempo deseados (es decir, t = 5, 10, 20, 40, 60 min), la transferencia de 20 l de reacción a los pocillos de una placa de microtitulación que contiene 5 l de 0,5 M EDTA para quelar Mg ²⁺ y detener la reacción.
4. Preparar un conjunto de normas de fosfato mediante la dilución de KH ₂ PO ₄ en tampón A + BME para calibrar los resultados. Una serie de normas útiles es de 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 y 0 M. Añadir 20 l de cada uno para los pocillos que contenían 5 l de 0,5 M EDTA.
5. Añadir 150 l de reactivo de la malaquita verde (verde carbinol 1 mM malaquita, 10 mM de molibdato de amonio tetrahidratado, y HCl 1 N) a cada pocillo, y leer OD ₆₅₀ 5 min después de la adición.
   NOTA: GTP es ácido lábil, y se hidrolizará en presencia de reactivo de verde de malaquita. Asegúrese de que tque el tiempo entre la adición del reactivo de malaquita y la lectura es constante para asegurar resultados reproducibles.
6. Generar una curva estándar trazando OD ₆₅₀ de las normas en función de la concentración de fosfato. Utilizar la regresión lineal para determinar la relación entre OD ₆₅₀ y la concentración de fosfato en una muestra.
7. Uso de la regresión lineal, convertir el OD ₆₅₀ de las muestras de reacción proteína a fosfato M. Determinar la velocidad de generación de fosfato para cada mezcla de reacción mediante el trazado de la concentración de fosfato como una función del tiempo, y convertir a k _gato dividiendo la tasa por la concentración Drp1 (0,5 M).
   NOTA: Sólo la tasa lineal inicial se debe utilizar para determinar la velocidad de generación de fosfato, y un mínimo de 3 puntos de datos debe ser utilizado. Si la velocidad de reacción es suficientemente rápida que los primeros tres puntos de datos no son lineales (es decir, el r ² del ajuste lineal es inferior a 0,9) un signoificantly más corto transcurso de tiempo con al menos 3 puntos de tiempo debe ser realizada.

Resultados

Mientras que la interacción entre Drp1 y Mff ha demostrado ser importante para la fisión mitocondrial, esta interacción ha sido difícil de recapitular in vitro. Nuestro objetivo era emular mejor el entorno celular en el que Drp1 y Mff interactúan. Con este fin, los liposomas que contienen concentraciones limitantes de NTA (Ni ²⁺⁾ grupos de cabeza se prepararon mediante rehidratación de una película de lípidos como se describió anteriormente. La solución de l...

Discusión

Este protocolo ofrece un método para la investigación de las interacciones proteína-proteína que participa en proteínas integrales de membrana. Mediante la utilización de un andamio modular de liposomas, los investigadores son capaces de evaluar la actividad de una o más proteínas en un entorno de lípidos proximal. Estudios anteriores han demostrado un método similar para las enzimas de los receptores de la membrana plasmática ^24-26. Hemos ampliado este método para incorporar...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices