Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen<em&gt; In Vitro</em

Zusammenfassung

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

Zusammenfassung

Studien von integralen Membranproteinen in vitro sind durch die Anwesenheit einer hydrophoben Transmembrandomäne häufig kompliziert. Weitere diese Studien zu verkomplizieren, reincorporation von Waschmittel-solubilisierte Membranproteine ​​in Liposomen ist ein stochastischer Prozess, in dem Protein-Topologie zur Durchsetzung unmöglich ist. Dieses Papier bietet eine alternative Methode, um diese anspruchsvollen Techniken, die ein Liposom-basierten Gerüst verwendet. Protein Löslichkeit wird durch die Deletion der Transmembrandomäne erhöht und diese Aminosäuren sind mit einem Anbinden Einheit ersetzt, wie beispielsweise ein His-Tag. Dieser Haltegurt wirkt mit einer Ankergruppe (Ni ²⁺ koordiniert von Nitrilotriessigsäure (NTA (Ni ²⁺⁾⁾ für His-markierte Proteine), die an der Oberfläche des Liposoms eine einheitliche Protein - Topologie erzwingt. Ein Beispiel präsentiert wird, wobei die Wechselwirkung zwischen Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) mit einem integralen Membranprotein, Mitochondrial Fission Factor (MFF) wurde investigated dieses Gerüst Liposom-Verfahren. In dieser Arbeit haben wir die Fähigkeit von Mff demonstriert effizient löslich DRP1 an die Oberfläche von Liposomen zu rekrutieren, die ihre GTPase-Aktivität stimuliert. Darüber hinaus war DRP1 der Lage, die MFF-dekorierten Lipid-Vorlage in Gegenwart von spezifischen Lipiden tubulate. Dieses Beispiel zeigt die Wirksamkeit der Gerüst Liposomen strukturellen und funktionellen Assays und unterstreicht die Rolle von Mff Aktivitäts DRP1 regulieren.

Einleitung

Studium membran proximal Protein-Protein - Wechselwirkungen ist eine herausfordernde Fangen wegen der Schwierigkeit in der natürlichen Umgebung der integralen Membranproteine beteiligt rekapituliert ^1. Dies ist aufgrund der Notwendigkeit des Waschmittels Solubilisierung und der inkonsistenten Orientierung von Proteinen in Proteoliposomen. Um diese Probleme zu vermeiden, haben wir eine Strategie eingesetzt , wobei lösliche Membrandomänen integraler Membranproteine exprimiert werden als His-Tag - Fusionsproteine, und diese löslichen Fragmente werden auf Gerüst Liposomen über Wechselwirkungen mit NTA (Ni ²⁺⁾ Kopfgruppen am Lipid verankert Oberfläche. Unter Verwendung dieser Gerüste, lipid-proximale Protein-Wechselwirkungen können über einen Bereich von Lipid- und Proteinzusammensetzungen untersucht werden.

Wir haben effektiv diese Methode angewandt, um die kritische Protein-Protein-Wechselwirkungen zu untersuchen, die Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer regieren und Lipid-Wechselwirkungen zu untersuchen, die diese pr modulierenocess ^2. Während mitochondrialen Spaltung, eine konservierte Membran - Remodeling - Protein, Dynamin-verwandtes Protein 1 (DRP1) ³ genannt, wird auf die Oberfläche der äußeren Mitochondrienmembran (OMM) in Reaktion auf zelluläre Signale eingestellt , die Energie - Homöostase, apoptotische Signal regulieren, und mehrere andere Integral mitochondrialen Prozesse. ^{8 -} Dieses große wird zytosolische GTPase an die Oberfläche der Mitochondrien durch Wechselwirkungen mit Proteinen integral OMM ⁴ eingestellt. Die Rolle eines solchen Proteins, Mitochondrial Fission Factor (MFF), ist schwierig gewesen , aufgrund einer scheinbaren schwache Wechselwirkung mit DRP1 in vitro zu untersuchen. Dennoch haben genetische Studien eindeutig gezeigt , dass Mff für eine erfolgreiche mitochondrialen Spaltung ^7,8 wesentlich ist. Das Verfahren in diesem Manuskript beschrieben konnte früheren Mängel zu überwinden, indem die gleichzeitige Lipid-Wechselwirkungen, die Einführung von DRP1-Mff Wechselwirkungen fördern. Insgesamt ist dieses neuen Assay REVEAführte fundamentalen Wechselwirkungen der Montage der mitochondrialen Spaltung komplexer Führung und eine neue Etappe für die laufende strukturelle und funktionelle Untersuchungen dieser wesentlichen molekularen Maschine zur Verfügung gestellt.

Bislang Untersuchung von Wechselwirkungen zwischen DRP1 und Mff haben durch die inhärente Flexibilität der Mff ^9, die Heterogenität der DRP1 Polymeren ^2,10, und die Schwierigkeit bei der Reinigung und Rekonstitution von voller Länge Mff mit einer intakten Transmembran- Domäne ¹¹ kompliziert. Wir adressiert diese Herausforderungen mithilfe von NTA (Ni ²⁺⁾ Gerüst Liposomen His-markierte Mff fehlt seine Transmembran - Domäne (MffΔTM-His ₆₎ zu rekonstruieren. Diese Strategie war vorteilhaft , da MffΔTM extrem gut löslich war , als überexprimiert in E. coli, und das isolierte Protein wurde auf Gerüst Liposomen leicht wiederhergestellt. Wenn auf diese Lipid templates gebunden, angenommen Mff eine identische, nach außen weisende Orientierung an der Oberfläche der Membran.Zusätzlich zu diesen Vorteilen wurden mitochondrialen Lipiden, wie Cardiolipin, hinzugefügt Mff Faltung und Assoziation mit der Membran ¹¹ zu stabilisieren. Cardiolipin interagiert auch mit der variablen Domäne der DRP1 ^2,12 welche diese ungeordneten Bereich stabilisieren kann und die Montage der Spaltmaschinen erleichtern.

Diese robuste Methode ist allgemein anwendbar für zukünftige Studien, die Membran-proximalen Protein-Wechselwirkungen zu bewerten suchen. Durch den Einsatz von zusätzlichen Anbinden / affine Wechselwirkungen kann die Komplexität dieser Membran Rekonstitution Untersuchungen verbessert werden zusätzliche Komplexität an der Oberfläche der Membranen in Zellen zu imitieren. Zur gleichen Zeit, Lipidzusammensetzungen können modifiziert werden, um mehr, um genau die nativen Umgebungen dieser makromolekularen Komplexen nachahmen. Zusammenfassend stellt dieses Verfahren ein Mittel, um die relativen Beiträge von Proteinen und Lipiden in der Gestaltung Membranmorphologien bei kritischen zellulären proc zu untersuchenzesse.

Protokoll

1. Scaffold Liposome Vorbereitung

HINWEIS: eine relativ einfache und featureless Gerüst (bestehend aus DOPC (1,2-Dioleoyl - sn - glycero-3-phosphocholin oder PC) und DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ (1,2-Dioleoyl, anfänglichen Experimenten sollte Idealer verwenden - sn - glycero-3 - [(N - (5-Amino-1-carboxypentyl) iminodiessigsäure) succinyl]. (Nickelsalz)) , das weg von diesen Experimenten Lipidladung, Flexibilität und Krümmung kann als einzelne Faktoren eingeführt werden , mit dem Potential Membran-proximalen Wechselwirkungen zu ändern. Diese Änderung kann durch Zugabe definierter Mengen spezifischer Lipidbestand erreicht werden, einschließlich Phosphatidylserin oder Cardiolipin (CL), Phosphatidylethanolamin (DOPE oder PE) oder Galactosyl (β) Ceramid.

1. Kombinieren Sie in Chloroform in einem sauberen Glas Reagenzglas gelöst Lipide. Dampfe das Lösungsmittel unter trockenem Stickstoffgas, während das Rohr Drehen eines dünnen Lipidfilm zu bilden. Entfernen Restlösungsmittel mit einem centrifugal Verdampfer für 1 h bei 37 ° C.
   HINWEIS: Verschiedene Liposomenformulierungen werden in den Protokollen beschrieben: Gerüst Liposomen (3,3 Mol-% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 96,7 Mol-% DOPC), Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10 mol% Cardiolipin / 86,7 mol% DOPC), flexible Gerüst Liposomen mit Cardiolipin (3,3 mol% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 10 mol% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC) und angereichertem Gerüst Liposomen (10 Mol-% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾ / 15 Mol-% Cardiolipin / 35 mol% DOPE / 40 Mol-% DOPC).
2. Hinzufügen Puffer A (25 mM HEPES (4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure), 150 mM KCl, pH eingestellt auf 7,5 mit KOH), vorerhitzt auf 37 ° C, so dass die endgültige Lipidkonzentration von 1 bis 2 mM. Inkubieren 30 min bei 37 ° C unter gelegentlichem Vortexen vollständig das Lipidgemisch (Abbildung 1a) resuspendieren.
3. Transfer zu einem Kunststoff-Teströhrchen, das Reagenzglas in flüssigem Stickstoff bis vollständig gefroren (roughly 30 s), und in einem 37 ° C Wasserbad °, bis sie vollständig aufgetaut (ca. 1-2 min). Wiederholen Sie dies für insgesamt 4 Gefrier-Auftau - Zyklen (Abbildung 1b).
4. Vorbereiten eines Lipids Extruder durch Einweichen 4 Filterträger und einen Polycarbonatfilter in Puffer und Zusammenbauen des Extruders nach Herstelleranweisungen. Extrudieren der Lipidlösung durch den Filter 21-mal. Verwenden Sie sanft, mit konstantem Druck eine homogene Größenverteilung (Abbildung 1c) zu gewährleisten.
   HINWEIS: Für alle in diesem Protokoll beschriebenen Experimenten wurde eine 1,0 um Polycarbonatfilter wurde für die Extrusion verwendet. DRP1 Wechselwirkung mit anionischen Lipide können mit einer Vielzahl von Liposomendurchmessern beobachtet werden , im Bereich von 50 nm bis 400 nm ¹² oder größer ^13. Daher wurde die Filtergröße von 1 um als ideal sowohl GTPase-Aktivität ausgewählt und für die Elektronenmikroskopie. Wenn andere Liposoms Durchmesser gewünscht sind, Herstellung von riesigen unilamellaren Vesikeln ^14,15 (GUVs) oder kleine unilamellar Vesikel ¹⁶ (SUVs) verwendet werden. Dynamische Lichtstreuung verwendet werden , um Liposomengrößenheterogenität ¹³ beurteilen.
5. Lagerung von extrudierten Liposomen bei 4 ° C und entsorgen Sie nach 3 bis 5 d.

2. Verwendung von Scaffold Liposome für die Proteinbindungsanalyse

1. Probenvorbereitung
   1. Für mindestens 15 min; inkubieren MffΔTM (5 & mgr; M final) mit Gerüst Liposomen (50 uM final 40 Mol-% PC / 35 Mol-% PE / 15 Mol-% CL / 10 Mol-% DGS-NTA (Ni ²⁺⁾⁾ His-tagged bei RT in Puffer A + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-Mercaptoethanol (BME), pH auf 7,5 mit KOH eingestellt). Für eine Mff freie Steuerung, bebrüten Liposomen mit einem His-markierten Kontrollprotein (wie GFP) zu binden und Schirm ausgesetzt NTA (Ni ^2+).
      HINWEIS: MffΔTM wurde exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie ² beschrieben. GFP wurde in ähnlicher Weise gereinigt, aber die Ionenaustauschschritt weggelassen wurde. BME wurde für diese experimen erforderlichts da ist DRP1 oxidationsempfindlich, die ihre Aktivität und Montageeigenschaften verändern kann.
   2. In DRP1 (2 uM final) und Inkubation für 1 h bei RT.
      HINWEIS: Es wurde DRP1 exprimiert und gereinigt , wie in einer früheren Studie ² beschrieben. Nach Inkubation mit DRP1, kann die Wirkung der Nukleotid - Bindungs auf Membranverformung durch Inkubation eine weitere Stunde mit 2 mM MgCl ₂ und entweder 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, oder Puffer A + BME sucht werden.
2. Negative Stain Transmissions-Elektronenmikroskopie (EM) Analyse
   1. Transfer 5 ul der Probe auf ein Blatt Laborfolie und legen eine kohlenstoffbeschichteten Cu / Rh Gitter auf der Probe. Inkubieren Sie die Gitter 1 min auf der Probe, auslöschen überschüssige Flüssigkeit auf Filterpapier entfernt und übertragen zu einem Rückgang von 2% Uranylacetat. Inkubieren 1 min, auslöschen Überschuss Fleck auf Filterpapier und übertragen auf eine Gitterbox. Shop unter Vakuum O / N Vollaustrocknungs zu gewährleisten.
   2. Bild Proben mit einem Transmissions-Elektronen-Microsc mitope bei 18.500 - 30.000 - facher Vergrößerung ultrastrukturelle Veränderungen in Protein und Liposom - Morphologien ¹⁷ zu beachten.
      Hinweis: Elektronenmikroskopische Veränderungen quantifiziert werden können Bildanalyse - Software, wie ImageJ ¹³ (http://imagej.nih.gov/ij/). Protein Dekoration kann gemessen werden, wenn im Vergleich mit nackten Lipid-Vorlagen. Außerdem können die Durchmesser der rohrförmigen Segmente aus dem äußersten Abschnitt der ¹³ Baugruppen gemessen werden. Eine genauere Analyse kann Kryo-Elektronenmikroskopie ¹⁷ durchgeführt werden. Dieses Verfahren kann ohne den Einsatz von Schwermetall Flecken, die Beschichtung der Probe in Lösungsmittel native Protein-Lipid-Baugruppen Bild verwendet werden. Auf diese Weise können detaillierte strukturelle Merkmale nicht in Negativfärbung erkennbar, einschließlich Änderungen in der darunter liegenden Lipid Morphologie kann untersucht und quantifiziert werden.

3. Verwendung von Scaffold Liposome für enzymatische Assay

Hinweis: A Colorimetrische GTPase - Test ¹⁸ wurde verwendet , Phosphat Befreiung über die GTP - Hydrolyse zu messen. Alternative GTPase - Assays sind ¹⁹ verfügbar und können je nach Bedarf umgesetzt werden.

1. Inkubieren His-tagged MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1) oder GFP (5 uM final für alle) mit Gerüst Liposomen (150 & mgr; M final) für 15 min bei RT in Puffer A + BME (Volumen = 30 & mgr; l). In DRP1 (500 nM endgültige) und Inkubation weitere 15 min bei RT (Volumen = 80 & mgr; l).
   HINWEIS: Fis1 wurde in ähnlicher Weise wie Mff ^2, aber der Ionenaustausch - Chromatographie - Schritt weggelassen wurde gereinigt. Der Zweck His-Tag GFP ist es, die NTA (Ni ²⁺⁾ Kopfgruppen zu schützen und nicht - spezifische Ladungs Wechselwirkungen mit anderen Proteinen zu verhindern. Wenn keine Wirkung in Abwesenheit von GFP beobachtet wird, dann kann diese Steuerung nicht erforderlich. Alternative blockieren Proteine ​​(von vergleichbarer Größe wie das Protein von Interesse) können auch verwendet werden, aber GFP ermöglicht die direkte Visualisierung der Wechselwirkungen mit scaffalten Liposomen.
2. Übertragungsrohre zu einem Thermocycler auf 37 ° C eingestellt und initiieren Reaktionen durch Zugabe von GTP und MgCl ₂ (1 mM und 2 mM final sind; Volumen = 120 ul).
3. Zu gewünschten Zeitpunkten (dh T = 5, 10, 20, 40, 60 min), Transfer 20 ul Reaktion auf Vertiefungen einer Mikrotiterplatte , enthaltend 5 & mgr; l 0,5 M EDTA Mg ²⁺ zu chelatisieren und die Reaktion zu stoppen.
4. Einen Satz von Phosphat - Standards von KH ₂ PO ₄ in Puffer A + BME Verdünnung Ergebnisse zu kalibrieren. Ein nützlicher Satz von Standards ist 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 und 0 & mgr; M. Geben Sie 20 & mgr; l von jedem zu den Vertiefungen, enthaltend 5 & mgr; l von 0,5 M EDTA.
5. Fügen Sie 150 ul von Malachitgrün - Reagenz (1 mM Malachitgrün Carbinol, 10 mM Ammoniummolybdattetrahydrat und 1 N HCl) in jede Vertiefung und lesen OD ₆₅₀ 5 min nach der Zugabe.
   HINWEIS: GTP ist säurelabil und wird in Gegenwart von Malachitgrün-Reagenz hydrolysieren. Stellen Sie sicher, dass ter Zeit zwischen Zugabe von Malachit-Reagenz und das Lesen ist konstant reproduzierbare Ergebnisse zu gewährleisten.
6. Generieren Sie eine Standardkurve von OD ₆₅₀ der Standards als Funktion der Phosphatkonzentration aufgetragen ist . Verwenden der linearen Regression , die die Beziehung zwischen OD ₆₅₀ und Phosphatkonzentration in einer Probe zu bestimmen.
7. Mit Hilfe der linearen Regression, wandeln die OD ₆₅₀ der Proteinreaktionsproben zu uM Phosphat. Bestimmen die Rate der Phosphat - Generierung für jedes Reaktionsgemisch durch Phosphatkonzentration als Funktion der Zeit aufgetragen, und konvertieren _cat k durch die Rate der Konzentrations DRP1 Dividieren (0,5 uM).
   HINWEIS: Nur der linearen Anfangsgeschwindigkeit sollte die Rate der Phosphaterzeugung und mindestens 3 Datenpunkte, um zu bestimmen, verwendet werden müssen, verwendet werden. Wenn die Reaktionsgeschwindigkeit ausreichend schnell ist , dass die ersten drei Datenpunkte nicht linear sind (dh der r ² der linearen Anpassung kleiner als 0,9) ein Zeichenificantly kürzere Zeitverlauf mit mindestens 3 Zeitpunkten durchgeführt werden.

Ergebnisse

Während die Interaktion zwischen DRP1 und Mff nachgewiesen wurde für mitochondriale Spaltung wichtig zu sein, hat diese Interaktion schwierig gewesen , in vitro zu rekapitulieren. Unser Ziel war es besser, die zelluläre Umgebung emulieren, wobei DRP1 und Mff interagieren. Zu diesem Zweck Liposomen , die Grenzkonzentrationen von NTA (Ni ²⁺⁾ Kopfgruppen wurden durch Rehydratisieren ein Lipidfilm hergestellt , wie oben beschrieben. Die Lipidlösung besteht zunächst a...

Diskussion

Dieses Protokoll bietet ein Verfahren zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen integralen Membranproteinen. Durch ein modulares Gerüst Liposom verwendet wird, sind Forscher, die die Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​in einer Lipid-Umgebung proximal zu beurteilen. ^{26 -} Frühere Studien haben eine ähnliche Methode für die Rezeptorenzyme der Plasmamembran ²⁴ gezeigt. Wir haben dieses Verfahren erweitert, um Lipid-Cofaktoren integrieren und zu erforschen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphatidylcholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)	Avanti Polar Lipids	850725
DGS-NTA(Ni2+)	Avanti Polar Lipids	790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)	Avanti Polar Lipids	840012
Chloroform	Acros Organics	268320010
Liposome Extruder	Avanti Polar Lipids	610023
Cu/Rh Negative Stain Grids	Ted Pella	79712
Microfuge Tube	Beckman	357448
GTP	Jena Biosciences	NU-1012
GMP-PCP	Sigma Aldrich	M3509
Microtiter Plate strips	Thermo Scientific	469949
EDTA	Acros Organics	40993-0010
Instant Blue Coomassie Dye	Expedeon	ISB1L
HEPES	Fisher Scientific	BP310
BME	Sigma Aldrich	M6250
KCl	Fisher Scientific	P330
KOH	Fisher Scientific	P250
Magnesium Chloride	Acros Organics	223211000
4 - 20% SDS-PAGE Gel	Bio Rad	456-1096
4x Laemmli Loading Dye	Bio Rad	161-0747
HCL	Fisher Scientific	A144S
Malachite Green Carbinol	Sigma Aldrich	229105
Ammonium Molybdate Tetrahydrate	Sigma Aldrich	A7302
Laboratory Film	Parafilm	PM-996
Uranyl Acetate	Polysciences	21447
Tecnai T12 100 keV Microscope	FEI
Optima MAX	Beckman
TLA-55 Rotor	Beckman
Refrigerated CentriVap Concentrator	Labconico
Mastercycler Pro Thermocycler	Eppendorf
VersaMax Microplate reader	Molecular Devices