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요약

This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.

초록

시험관 내에서 세포막 단백질 연구가 많이 소수성 막 횡단 도메인의 존재에 의해 복잡하게된다. 또한 이러한 연구를 복잡하게, 리포좀에 세제 - 가용화 된 막 단백질의 reincorporation 단백질 토폴로지를 적용하는 것은 불가능 확률 과정이다. 본 논문은 리포좀 기반의 발판을 이용하여 이러한 도전적인 기술에 대한 대체 방법을 제공합니다. 단백질의 용해성은 경막 도메인의 결실에 의해 강화되며, 이러한 아미노산 같은 그의 태그 같은 더링 잔기로 대체된다. 이것은 테더가 리포솜의 표면에 균일 한 단백질 토폴로지를 적용 (니트릴 로트리 아세트산 그의 태그 된 단백질 (NTA (니켈 2+))에 의해 조정 니켈 2+) 앵커링 그룹과 상호 작용한다. 필수 막 단백질 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)와 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 사이의 상호 작용이 INVE이었다 상기 예가 제시이 골격 리포솜 법을 이용 stigated. 이 작품에서 우리는 효율적으로는 GTPase 활동을 자극 리포좀의 표면에 용해 Drp1을 모집 MFF의 능력을 증명하고있다. 또한 Drp1 특정 지질의 존재 MFF 장식 지질 템플릿 관 모양 할 수 있었다. 이 예는 구조 및 기능 분석을 사용하여 골격 리포좀의 효과를 보여주고 Drp1 활성을 조절하는데 MFF의 역할을 강조한다.

서문

막 인접 단백질 - 단백질 상호 작용을 공부 인해 1 포함 된 통합 막 단백질의 기본 환경을 recapitulating 어려움에 도전적인 노력이다. 이 세제 용해 필요성 및 테오 단백질의 방향 불일치에 기인한다. 이러한 문제를 방지하기 위해, 우리는 통합 막 단백질의 가용성 도메인 그의 태그 융합 단백질로서 발현된다 전략을 채용 한 이러한 가용성 단편 지질에 NTA (니켈 2+) headgroups와의 상호 작용을 통해 지지체 리포솜에 고정되고 표면. 이러한 발판 사용 근위 지질 단백질 상호 작용은 지질 및 단백질 조성의 범위를 조사 할 수있다.

우리는 효과적으로 홍보를 조절하는 지질 상호 작용을 미토콘드리아 분열 복합체의 조립을 지배하는 중요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하고 검토하려면이 방법을 적용했습니다ocess 2. 미토콘드리아 분열 동안 Dynamin 관련 단백질 1 (Drp1) 3이라고하는 보존 막 리모델링 단백질은 에너지 항상성, 세포 사멸 신호, 및 기타 여러 가지를 조절 세포 신호에 응답하여 상기 외부 미토콘드리아 막 (OMM)의 표면에 채용되고 필수적인 미토콘드리아 처리합니다. 8 -이 큰, 세포질는 GTPase는 통합 OMM 단백질 (4)과의 상호 작용을 통해 미토콘드리아의 표면에 채용된다. 그러한 단백질의 역할 미토콘드리아 분열 인자 (MFF)에 의한 시험 관내 Drp1와 겉보기 약한 상호 작용을 해명 어려웠다. 그럼에도 불구하고, 유전자 연구는 명확하게 MFF 성공 미토콘드리아 분열 7,8에 필수적임을 증명하고있다. 이 논문에 기재된 방법은 Drp1 MFF-상호 작용을 촉진 동시 지질 상호 작용을 도입함으로써 기존의 단점을 극복 할 수 있었다. 전반적으로,이 소설 분석 revea미토콘드리아 분열 복합체의 어셈블리를 안내 근본적인 상호 작용을지도하고 필수적인 분자 기계의 지속적인 구조 및 기능 연구에 새로운 단계를 제공했다.

지금까지 Drp1과 MFF 사이의 상호 작용의 검사가 MFF (9)의 고유의 유연성에 의해 복잡하게되었습니다 Drp1의 이질성은 2,10을 중합체 및 어려움 정화 및 손상되지 횡단 도메인 (11)와 함께 전체 길이 MFF를 재구성. 우리는 막 횡단 도메인 (MffΔTM-그의 6) 부족 그의-태그 MFF를 재구성 NTA 니켈 (Ni 2+) 비계 리포좀을 사용하여 이러한 문제를 해결. E의 과발현 때 MffΔTM 매우 수용성이기 때문에이 전략은 유리했다. 콜라이,이 절연 단백질 용이 골격 리포좀에 재구성 하였다. 이러한 지질 템플릿에 닿는 경우, MFF는 멤브레인의 표면 상에 동일한 외측으로 향하는 방향을 가정한다.이러한 장점 등 리핀 등 미토콘드리아 지질 이외에, 멤브레인 (11) MFF 폴딩 및 결합을 안정화 하였다. 카디오 리핀은이 무질서 지역을 안정시키고 분열 기계의 조립을 용이하게 할 수 Drp1 2,12의 가변 도메인과 상호 작용한다.

이 방법은 강력한 막 - 근위 단백질 상호 작용을 평가하고자 미래 연구에 널리 적용 할 수있다. 추가의 테 더링 / 친 화성 상호 작용을 사용하여,이 막 재구성 연구 정교한 세포 내 멤브레인의 표면에서 발견 된 추가 복잡도를 모방하도록 향상 될 수있다. 동시에, 지질 조성물을보다 정확하게 이러한 고분자 복합체의 기본 환경을 모방하도록 수정 될 수있다. 요약하면, 이러한 방법은 중요한 세포 PROC시에 막 모폴로지 형성에 상대적 기여도 단백질과 지질을 검사하는 방법을 제공한다esses.

프로토콜

1. 비계 리포좀의 제조

참고 : 이상적으로, 초기 실험은 DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero -3- 포스 포 콜린 또는 PC)와 DGS-NTA (니켈 2 +) (1,2-dioleoyl로 구성된 비교적 간단하고 특색 발판을 (사용해야합니다 - SN -glycero -3 - [(N은 - (5- 아미노 -1- 카르복시) 이미 노디 아세트산) 숙시 닐]. (니켈 염)) 건축 실험 오프 지질 전하, 유연성 및 굴곡 개별 요소로서 도입 될 수있다 잠재적으로 막 근위 상호 작용을 변경한다. 이러한 변경 또는 포스파티딜 리핀 (CL), 포스파티딜 에탄올 아민 (DOPE 또는 PE) 또는 락토 (β) 세라미드 지질 성분을 포함한 특정의 한정된 양의 첨가에 의해 달성 될 수있다.

  1. 깨끗한 유리 시험관에 클로로포름 지질 결합. 얇은 지질막을 형성하도록 튜브를 회전시키면서 건조 질소 가스에 용제를 증발시켰다. centrifuga와 잔류 용매를 제거37 ° C에서 1 시간 동안 L 증발기.
    참고 : 다양한 리포좀 제제는 프로토콜에 사용되는 아래에 설명 : 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2 +) / 96.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀과 비계 리포좀 (3.3 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 86.7 몰 %의 DOPC), 카디오 리핀 유연한 골격 리포솜 (3.3 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 10 몰 %의 리핀 / 35 몰 %의 DOPE / 51.7 몰 %의 DOPC) 및 농축 된 지지체 리포좀 (10 몰 % DGS-NTA (니켈 2+) / 35 몰 % DOPE / 40 몰 %의 DOPC / 15 몰 %의 리핀).
  2. 37 ° C로 예열 완충액 A (25 mM의 HEPES (4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산) KOH 7.5로 조정 한 150 mM의 KCl을, 산도)를 추가, 최종 지질 농도는 1이되도록 - 2 mm이다. 완전히 지질 혼합물 (도 1a)에 재현 탁하는 비정기 텍싱 37 ° C에서 30 분 동안 인큐베이션.
  3. 완전히 냉동 (roug 때까지 액체 질소에 튜브, 플라스틱 시험관에 이동 배치hly 30 초), 완전히 해동 (약 1까지 37 ° C의 물을 욕조에 장소 - 2 분). 4 동결 해동 사이클 (그림 1b)의 총 반복합니다.
  4. 4 필터 지원 및 버퍼의 폴리 카보네이트 필터를 몸을 담글 및 제조업체 지침에 따라 압출기를 조립하여 지질 압출기를 준비합니다. 필터를 통해 21 회 지질 용액을 돌출. 균일 한 크기 분포 (그림 1C)을 보장하기 위해 부드러운, 일정한 압력을 사용합니다.
    주 :이 프로토콜에 기재된 모든 실험의 경우, 1.0 ㎛의 폴리 카보네이트 필터를 압출 하였다. 음이온 성 지질로 Drp1 개입 50 nm 내지 400 nm의 12 이상 13 범위 리포솜 다양한 직경으로 관찰 할 수있다. 따라서, 1 ㎛의 필터 사이즈 모두는 GTPase 활성 및 전자 현미경에 적합하도록 선택되었다. 다른 리포좀 직경은 원하는 경우 거대한 단일 층 소포 14, 15 (GUVs) 또는 작은 unilamell의 준비아칸소 사용할 수 있습니다 (16) (포드 SUV)을 소포. 동적 광산란 리포좀 크기 이질성 (13)을 평가하기 위해 사용될 수있다.
  5. 4 ° C에서 압출 리포좀을 저장하고 3 후 폐기 - 5 라.

단백질 바인딩 분석을위한 발판 리포좀의 2.

  1. 샘플 준비
    1. 적어도 15 분 동안, 비계 리포좀 (50 μM 최종 40 몰 %의 PC / 35 몰 %의 PE / 15 몰 % CL / 10 몰 % DGS-NTA 니켈 (Ni 2+))와 (5 μm의 최종) MffΔTM을 그의 - 태그 품어 버퍼 A + BME에 실온에서 (25 mM의 HEPES, 150 밀리미터의 KCl, 10 MM의 β-머 캅토 에탄올 (BME)는, pH는 KOH 7.5로 조정). MFF없는 제어를 위해, NTA 니켈 (Ni 2+)에 노출 된 자신의 태그가 제어 결합하는 (예 : GFP)을 단백질과 방패 리포좀을 품어.
      주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 MffΔTM은 발현시키고 정제 하였다. GFP를 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 공정을 생략 하였다. BME이 experimen 필요했다TS Drp1는 활동 및 조립 특성을 변경할 수 있습니다 산화에 민감하기 때문이다.
    2. Drp1 (최종 2 μM)를 첨가하고, 실온에서 1 시간 동안 배양.
      주 :이 이전의 연구에서 설명 된 바와 같이 Drp1은 발현시키고 정제 하였다. Drp1과 부화 후, 막 변형을 구속 염기의 효과가 2 밀리미터의 MgCl 2, 중 1 ㎜ GTP, 1 mM의 GMP-PCP, 또는 버퍼 A + BME를 하나의 추가 시간을 배양하여 조사 할 수있다.
  2. 네거티브 얼룩 투과 전자 현미경 (EM) 분석
    1. 전사 5 실험실 필름의 시트 샘플 μL, 시료에 카본 코팅 구리 / Rh를 그리드 누워. 샘플의 그리드 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 액체를 멀리 오 점, 2 %의 우라 닐 아세테이트 한 방울로 전송합니다. 1 분을 품어 필터 종이에 여분의 얼룩을 지워, 및 그리드 상자로 전송할 수 있습니다. 진공 O / N에서 스토어 전체 탈수을 보장합니다.
    2. 투과형 전자 microsc를 사용하여 이미지 샘플18,500에서 OPE - 30,000X 배율은 단백질과 리포좀 모폴로지 (17)의 미세 구조 변화를 관찰합니다.
      참고 : 미세 구조의 변화가 그러한 ImageJ에 (13), 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 정량화 할 수있다 (http://imagej.nih.gov/ij/). 단백질은 장식 벗은 지질 템플릿과 비교하여 측정 할 수있다. 또한, 관형 부분의 직경은 어셈블리 (13)의 최 외곽 부분에서 측정 할 수있다. 보다 상세한 분석은 극저온 전자 현미경 (17)을 사용하여 수행 될 수있다. 이 방법은 코팅 샘플의 중금속 오염을 사용하지 않고 용매 이미지 천연 단백질 지질 어셈블리에 사용될 수있다. 이와 같이, 기본 형태의 지질의 변화를 포함한 음극 얼룩 명백하지 상세한 구조적 특징은 검사하고 정량화 할 수있다.

효소 분석을위한 발판 리포좀의 3.

참고 : 로리를통계는 GTPase 분석 (18)는 GTP 가수 분해를 통해 인산 해방을 측정하는 데 사용되었다. 대체는 GTPase 세이 19 사용할 수 있으며, 필요에 따라 구현 될 수있다.

  1. (150 μM 최종) 비계 리포좀 버퍼 A + BME (부피 = 30 μL)에 실온에서 15 분간와 그의-태그 MffΔTM (MFF), Fis1ΔTM (Fis1), 또는 GFP가 (모두 5 μm의 최종) 품어. Drp1 (500 nM의 최종)를 추가하고 RT (부피 = 80 μL)에 추가로 15 분을 품어.
    참고 Fis1 MFF는 2와 유사한 방식으로 정제되었지만, 이온 교환 크로마토 그래피 단계는 생략 하였다. 그 태깅 된 GFP의 목적은 NTA (니켈 2+) headgroups 실드와 다른 단백질과의 비특이적 상호 작용의 전하를 방지하기위한 것이다. 효과는 GFP의 부재하에 관찰되지 않으면,이 제어가 필요하지 않을 수도있다. (관심있는 단백질에 필적하는 크기의) 대안 차단 단백질도 사용할 수 있지만, GFP는 SCAF와의 상호 작용의 직접적인 시각화를 허용리포좀을 접어주십시오.
  2. 열 순환기로 전송 튜브는 37 ° C로 설정하고, GTP와의 MgCl 2를 첨가하여 반응을 개시 (각각 1 ㎜, 2 mM의 결승전을, 부피 = 120 μL를).
  3. 목적하는 시점 (즉, T = 5, 10, 20, 40, 60 분)에서의 Mg 킬레이트 2+하고 반응을 정지 0.5 M EDTA 5 μL를 포함하는 미세 적정 플레이트의 웰에 반응 20 μL 옮긴다.
  4. 결과를 보정 버퍼 A + BME에서 KH 2 PO 4를 희석하여 인산 표준 세트를 준비합니다. 표준 유용한 집합은 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5, 0 μM이다. 0.5 M EDTA의 5 μL를 포함하는 우물에 각 20 μL를 추가합니다.
  5. 각 웰에 150 μL 말라카이트 그린 시약 (1 mM의 말라카이트 그린 카비 놀, 10 mM의 몰리브덴 산 암모늄 수화물, 1 N 염산)을 추가하고 OD를 첨가 한 후 650 5 분을 참조하십시오.
    주 : GTP는 산 불안정성이며, 말라카이트 그린 시약의 존재 하에서 가수 분해된다. 그 t 확인공작석 시약을 추가하고 읽기 사이에 그는 시간이 재현 가능한 결과를 보장하기 위해 일정하다.
  6. 인산염 농도의 함수로서 표준 OD 650 플로팅하여 표준 곡선을 생성한다. 샘플의 OD 650 인산염 농도 사이의 관계를 결정하기 위해 선형 회귀 분석을 사용한다.
  7. 선형 회귀를 이용 μM 인산염 단백질 반응 시료의 OD 650으로 변환. 시간의 함수로서 인산 농도를 플로팅하여 각각의 반응 액에 대한 포스페이트 생성 속도를 결정하고 Drp1 농도 (0.5 μM)에 의해 속도를 나누어 고양이 k로 변환한다.
    참고 : 초기 선형 속도 포스페이트 생성 속도를 결정하기 위해 사용되어야하고, (3) 데이터 포인트의 최소 사용되어야한다. 반응 속도는 처음 세 데이터 포인트가없는 선형 충분히 빠른 경우 사인 (즉, 선형 피팅의 R2는 0.9 미만이다)최소 3 시간 포인트 ificantly 짧은 시간 과정은 수행해야합니다.

결과

MFF Drp1과의 상호 작용은 미토콘드리아 분열에 중요한 것으로 입증되었지만, 이러한 상호 작용은 시험 관내에서 요점을 되풀이하기 어려웠다. 우리의 목표는 더 나은 Drp1과 MFF 상호 작용에있어서, 상기 세포 환경을 에뮬레이션하는 것이 었습니다. 이를 위해 리포좀 NTA (니켈 2+) headgroups의 제한 농도를 함유하는 전술 한 바와 같이 지질 막을 재수 화하여 제조 ...

토론

이 프로토콜은 통합 막 단백질을 포함하는 단백질 - 단백질 상호 작용을 조사하는 방법을 제공한다. 모듈 리포솜 지지체를 이용하여, 연구자들은 지질 근위 환경에서 하나 이상의 단백질의 활성을 사정 할 수있다. 26 - 이전 연구 세포막 수용체 (24)의 효소를위한 동일한 방법을 증명하고있다. 우리는 지질 보조 인자를 포함하고 미토콘드리아 분열 기계의 mechanoenzymatic 핵심?...

공개

The authors have nothing to disclose.

감사의 말

The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Phosphatidylcholine (DOPC)Avanti Polar Lipids850375
Phosphatidylethanolamine (DOPE)Avanti Polar Lipids850725
DGS-NTA(Ni2+)Avanti Polar Lipids790404
Bovine Heart Cardiolipin (CL)Avanti Polar Lipids840012
ChloroformAcros Organics268320010
Liposome ExtruderAvanti Polar Lipids610023
Cu/Rh Negative Stain GridsTed Pella79712
Microfuge TubeBeckman357448
GTPJena BiosciencesNU-1012
GMP-PCPSigma AldrichM3509
Microtiter Plate stripsThermo Scientific469949
EDTAAcros Organics40993-0010
Instant Blue Coomassie DyeExpedeonISB1L
HEPESFisher ScientificBP310
BMESigma AldrichM6250
KClFisher ScientificP330
KOHFisher ScientificP250
Magnesium ChlorideAcros Organics223211000
4 - 20% SDS-PAGE GelBio Rad456-1096
4x Laemmli Loading DyeBio Rad161-0747
HCLFisher ScientificA144S
Malachite Green CarbinolSigma Aldrich229105
Ammonium Molybdate TetrahydrateSigma AldrichA7302
Laboratory FilmParafilmPM-996
Uranyl AcetatePolysciences21447
Tecnai T12 100 keV MicroscopeFEI
Optima MAXBeckman
TLA-55 RotorBeckman
Refrigerated CentriVap ConcentratorLabconico
Mastercycler Pro ThermocyclerEppendorf
VersaMax Microplate readerMolecular Devices

참고문헌

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