Estudiar mitocondrial Estructura y función en<em&gt; Drosophila</em&gt; Los ovarios

Resumen

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Resumen

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Introducción

Las mitocondrias se describen clásicamente como el centro energético celular, ya que son los principales asientos de la producción de energía en las células diferenciadas. Por otra parte, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el metabolismo, la generación de calor, la modificación de los lípidos, calcio y homeostasis redox, la orquestación de los procesos de señalización celular, etc ^1. Las mitocondrias juegan también un papel activo en la inducción de muerte celular ^2, así como en la regulación del ciclo celular ^3. Tal multifuncionalidad plantea las siguientes cuestiones fundamentales: a) ¿cómo mitocondrias realizan todas estas funciones simultáneamente y b) hay piscinas mitocondriales específicos o subzonas que están especializados para funciones distintas? En este contexto, es importante observar que las mitocondrias multifuncionales son dinámicas en su forma, tamaño, y la estructura dentro de las células individuales y que la forma de estado estacionario de las mitocondrias pueden variar entre los tipos de células. Décadas de investigación de diversos laboratoriosoratorios sugieren que la alteración de la forma mitocondrial, tamaño y estructura, colectivamente llamados dinámica mitocondrial, es crucial para el mantenimiento de varias funciones mitocondriales _^4,5,6. Estos resultados plantean la posibilidad de que las mitocondrias pueden cumplir con su multifuncionalidad en virtud de su dinamismo estructural.

Extensas se están realizando esfuerzos para comprender la relación estructura-función mitocondrial. El dinamismo de la estructura mitocondrial se mantiene principalmente por su capacidad para someterse a eventos de fisión y de fusión entre sí. La fisión de grandes mitocondrias los convierte en elementos mitocondriales más pequeños, mientras que la fusión entre dos pequeñas mitocondrias y los integra en un elemento más grande mitocondrial ^7. Por otra parte, la fusión transitoria de dos mitocondria puede ocurrir para permitir la mezcla de su contenido. Los sucesos de fisión y la fusión de las membranas mitocondriales interna y externa son cuidadosamente rigen por specIFIC conjuntos de proteínas. La maquinaria núcleo de fisión se compone de la proteína relacionada con dynamin-1 (Drp1), que se reclutó desde el citosol a las mitocondrias por su interacción con cierto bona proteínas mitocondriales fide (por ejemplo, fis1 o Mff1), mientras que la función Drp1 también puede ser regulada por otras proteínas en la superficie mitocondrial ^4. Aunque Drp1 opera en la membrana externa, sus capacidades de fisión impacto de la membrana interna, así. La orquestación de la fisión de las membranas mitocondriales externas e internas no se entiende bien. Por otra parte, la fusión de la membrana interna se rige en el núcleo por las actividades de OPA1, mientras mitofusins gobiernan la fusión de la membrana externa ^5. El resto de los eventos que contrarrestan de fisión y de fusión de mitocondrias dictan la forma mitocondrial de estado estable en una célula. Por ejemplo, la represión de la fisión mitocondrial daría lugar a una fusión completa y sin oposición, mientras que el exceso de actividad de las mitocondriasl fisión daría lugar a la fragmentación de las mitocondrias ^3.

El estudio de la relación estructura-función mitocondrial implica principalmente dos enfoques complementarios: a) análisis de los fenotipos celulares de Organismos y después de la manipulación genética de las proteínas de la fisión / fusión mitocondrial y b) las evaluaciones directas de la estructura y la función mitocondrial. Es digno de mención que los análisis genéticos no siempre pueden revelar la funcionalidad directa de la molécula en cuestión (en este caso, las proteínas de fisión / fusión mitocondrial), como pueden surgir los fenotipos debido a los efectos secundarios. Por lo tanto, es de suma importancia para el desarrollo y el uso de herramientas para estudiar la estructura y la función mitocondrial directamente. Cualquier evaluación de la estructura mitocondrial implica varias herramientas de microscopía. El uso de microscopía de fluorescencia de células vivas ha avanzado mucho los estudios de dinámica mitocondrial, ya que el dinamismo mitocondrial se puede monitorizar tanto cualitativa como cuantitatIVELY utilizando las herramientas y técnicas de microscopía de fluorescencia ⁸ apropiadas. Herramientas basadas en la microscopía de fluorescencia se han desarrollado para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los tejidos vivos melanogaster y Drosophila fijos, elucidar la importancia de dinamismo mitocondrial in vivo ^9. Estos y métodos relacionados se describen aquí, con el objetivo de estudiar la estructura y la función mitocondrial en el ovario Drosophila.

El ovario de Drosophila consiste en la línea germinal y somática linajes, que surgen de sus respectivas células madre adultas que residen en el germarium ^10,11. Dieciséis células germinales sincitial (GCS) quedan encapsulados por las células del folículo somáticas (FCS) para formar cámaras de huevos individuales que emergen de la germarium (Figura 1). Uno de los 16 GC se confirmen a convertirse en un ovocito, y los restantes 15 GC se desarrollan en células enfermeras que apoyan el crecimiento de la cámara de ovocitos, Facilitando la maduración del huevo antes de que sea puesto a nadie. La mayoría de las FCs se someten a 9 rondas de divisiones mitóticas antes de que salgan del ciclo celular mitótico para diferenciar terminales en una capa de células epiteliales modelado que consiste en células anterior del folículo (AFCS), las células del folículo posterior (PFC), y las células del cuerpo principal (MBC) . Las cámaras de huevos consecutivos están conectados por las células tallo, que son las células que también se derivan de los bloques FC temprano en el desarrollo diferenciados. Mitocondrial forma regulada por la proteína mitocondrial Drp1 fisión participa activamente en el proceso de diferenciación durante el desarrollo normal de la capa de FC ovario de Drosophila ^9,12. Aquí se describen los métodos usados en estos estudios para identificar la participación de Drp1 en el desarrollo de la capa de células del folículo Drosophila.

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Protocolo

1. Preparación de Drosophila (las herramientas necesarias se representan en la figura 2A)

1. Para cualquiera de los experimentos descritos, recoger Drosophila (mantenida a temperatura ambiente, o 25 ° C) dentro de los 5 días de la eclosión y colocarlos en un vial lleno con 5-7 ml de Drosophila alimentos (ver Materiales Tabla), con no más de 25 moscas en cada vial; mantener una relación mujer: hombre de 2: 1.
2. Se espolvorea con una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos de Drosophila. Realizar la manipulación experimental dentro de 2 - 4 días.

2. Disección de Drosophila ovarios (las herramientas necesarias se representan en la figura 2A)

1. Insectos disección medio caliente (véase la Tabla de Materiales) a temperatura ambiente, 25 ° C. Llenar tres pozos de un plato de disección vaso de ocho pocillos, con 200 l de medio en cada pozo.
2. Anestesiar Drosophila con CO _{2 mediante la colocación de la aguja de la escopeta de aire comprimido debajo del tapón del vial. Colocarlos en una almohadilla de mosca. El uso de un microscopio de disección, ordenar a cabo 5 hembras y colocarlos en el primer pocillo de la placa de disección. Manejar uno de Drosophila en una época en la realización de la microscopía en vivo.}
3. Mientras mira por el ocular del microscopio de disección, cortar el tórax del abdomen usando dos pares de pinzas. Usando las pinzas, transferir cuidadosamente los abdómenes al segundo compartimiento del plato.
4. Utilice un par de pinzas para sujetar el abdomen en el extremo posterior, y lentamente empujar los ovarios (junto con los otros contenidos abdominales) con el otro par de pinzas. Si este intento falla, retire con cuidado el exoesqueleto abdominal mediante la inserción de la pinza en el extremo anterior de liberar a los ovarios.
5. Usando las pinzas, mantenga un ovario individuo por el extremo posterior opaco (es decir, los huevos rellenos de yema, de la última etapa) y mover con cuidado para el tercer compartimiento del platopara burlarse de procesarla para microscopia en directo (paso 3) o para la fijación de realizar la inmunotinción (paso 7).
6. burlan con cuidado la vaina protectora alrededor de los ovarios mediante el barrido de una aguja burlas ligeramente desde la parte posterior hasta el extremo anterior de cada ovario mientras que lo sostiene por el extremo posterior con un par de fórceps.
   NOTA: Para reducir al mínimo los daños durante las burlas, doblar la punta de la aguja y un zoom en cada ovario al aumentar el aumento del microscopio (Figura 2A). Las burlas debería ser suficiente para romper la vaina eficaz, sino que también debe hacerse con cuidado para preservar la integridad de la ovarioles.

3. Preparación de Microscopía de tejido vivo

NOTA: Las herramientas necesarias se representan en la figura 2A.

1. Antes de la disección de Drosophila, preparar cámaras recubiertas polyl-lisina. Con este fin, colocar dos gotas 20-l de polyl-lisina (0,1 mg / ml) en el coverglculo (14 mm, No. 0) de una placa de Petri con fondo de vidrio (35 mm) a una distancia razonable de la otra a fin de evitar la fusión de las gotas. El aire seco de las placas durante 1 hora a 37 ºC y marcar los bordes de la película en blanco polyl-lisina en la parte inferior de la placa con un marcador borrable.
   NOTA: El polyl-lisina cámaras se pueden almacenar a 4 ° C durante una semana. Si se utiliza una cámara previamente recubiertos, llevarlo a la temperatura ambiente antes de comenzar la disección Drosophila.
2. Ajuste los parámetros de análisis bajo el microscopio confocal para asegurarse de que la muestra se pueden obtener imágenes inmediatamente después de la finalización de la disección y de montaje, como a continuación.
3. El lugar de uno disecados y objeto de burlas ovario (siguiendo el paso 2 y se tiñeron, si es necesario, después del paso 5) en una región con recubrimiento de polyl-lisina marcada y se extendió el ovario con la aguja de las burlas de separar la ovarioles. Coloque una gota de 10 l de medio de disección de insectos en la parte superior del ovario, asegurándose de cubrir tél área completa polyl-lisina. Cubrir la placa de Petri.
4. Inmediatamente realizar microscopía confocal de la muestra montada a temperatura ambiente.
   NOTA: Sólo uno de Drosophila debe ser disecado, procesa y la imagen a la vez. Además, la microscopía no debe realizarse a 37 ° C, que imitar un ambiente de choque térmico para el tejido de Drosophila.

4. Pérdida de fluorescencia En Photobleaching (FLIP) Ensayo para evaluar la matriz mitocondrial Continuidad

NOTA: la continuidad de la matriz mitocondrial en una estructura mitocondrial fusionado se establece después de la fusión completa de las membranas mitocondriales internas y externas después de una progresión a través de los pasos intermedios. La fisión de las mitocondrias puede seguir los mismos pasos, pero en la dirección inversa (Figura 3A). FLIP es un método semi-cuantitativo basado en microscopía de lapso de tiempo que se puede utilizar para evaluar la continuidad matriz mitocondrial en elestado fundido final del mitocondrias ex vivo (pasos 3 y 4 en la Figura 3A) en los ovarios de Drosophila vivas ^9. El ensayo de FLIP se realiza como una pequeña región de interés (ROI) de las mitocondrias que expresan una molécula fluorescente en la matriz mitocondrial que se photobleached a intervalos regulares (ROI FLIP en la Figura 3A). Como resultado, cualquier región mitocondrial circundante que es continua con la ROI FLIP (ROI experimental en la Figura 3A) perderá la señal debido al intercambio de las moléculas en la matriz mitocondrial continua. Los experimentos FLIP demostrado aquí se realizan en Drosophila transgénica que expresa mitoYFP, que contiene la secuencia de direccionamiento mitocondrial de la citocromo oxidasa subunidad VIII humano etiquetado con YFP para apuntar a la matriz mitocondrial en una forma libremente difusible. Un experimento similar también se puede realizar con el transgén mito UPAEP-mito-GFP, como se informó anteriormente ^{9. Un protocolo FLIP similar puede utilizarse con una sonda específica para el espacio entre la membrana mitocondrial para ser capaz de detectar la continuidad resultante de la fusión de la exterior, pero no las membranas mitocondriales interna (paso 2 en la Figura 3A).}

1. Abra el software de adquisición de imágenes en el microscopio confocal y establecer los parámetros de análisis correspondientes en la pestaña "Adquisición" (Tabla 1). Compruebe la "Serie de tiempo", "Blanqueo" y "cajas" Regiones para abrir las pestañas individuales. Ponga los valores de los parámetros de adquisición apropiados en cada pestaña (Tabla 1).
   NOTA: El agujero de alfiler debe dejarse abierta, ya que este experimento está diseñado para monitorear la señal global del conjunto de la población mitocondrial en las células individuales.
2. Utilice el ocular para localizar rápidamente el campo de interés en el tejido vivo montado.
   NOTA: Seleccionar la ovarioles que están bien distribuidos en el cristal-bottomed plato, ya que la microscopía confocal no se puede realizar en ovariolas flotantes.
3. Haga clic en "vivo" para adquirir una imagen en directo del campo de interés seleccionada. Haga clic en "stop" para detener la exploración en vivo.
4. Si es necesario, ajuste los parámetros de adquisición de tal manera que la señal fluorescente detectada está por debajo de los niveles de saturación (indicados por la ausencia de píxeles rojos cuando se encuentra activa la opción "indicador de rango"), con el fondo definido según lo establecido por el ajuste de los valores de desplazamiento.
5. Dibuje un pequeño retorno de la inversión mediante la herramienta de dibujo de curva desde la pestaña "Regiones" para demarcar la zona photobleaching en la imagen adquirida por el escaneo en vivo.
   NOTA: El tamaño de la ROI debe estar alrededor de 20 - 50% de la señal fluorescente mitocondrial total dentro de la célula.
6. Realizar la adquisición de la imagen haciendo clic en "iniciar el experimento."
7. Cuantificar la intensidad de fluorescencia utilizando la propiedad o el software de código abierto (ver MaterialesTabla). Grabar la señal media desde el retorno de la inversión cuando el objetivo sea el blanqueo repetitivo (FLIP); el rendimiento de la inversión en el blanqueo no se ha realizado en la misma célula (Experimental); el retorno de la inversión de otra célula sin blanquear en el mismo campo de vista, para la evaluación de blanqueo global durante el período experimental (blanqueo); y el retorno de la inversión en el área de fondo (fondo). Restar la señal de fondo media obtenida a partir de la media de la señal en el otro ROI. Normalizar la señal fluorescente con la señal de pre-blanqueador inicial de la celda respectiva.
8. Representar gráficamente los datos normalizados utilizando cualquier software de trazado estándar.

5. La tinción fluorescente mitocondrial Vivo con tintes

NOTA: estructura mitocondrial en estado estacionario y el potencial se pueden evaluar usando colorantes que incorporan específicamente en las mitocondrias en las células vivas y tejidos. Ovarios vivo Drosophila se pueden teñir ex vivo con mitocondrial fluorescentemanchas para visualizar la mitocondria, para evaluar especies reactivas del oxígeno mitocondrial (mito-ROS), y para evaluar el potencial mitocondrial por unidad de masa. Esto se puede lograr por la co-tinción con el éster mitocondrial potenciométrica colorante tetrametilrodamina de etilo (TMRE) y una mancha mitocondrial vivo compatible que representa la masa mitocondrial (véase Materiales Tabla para los colorantes específicos).

1. Diluir el stock de las manchas de insectos caliente de disección medio a las concentraciones finales de trabajo: tinción mitocondrial, 250 nM; TMRE, 50 nM; y mito-ROS mancha, 5 mM.
2. Después de la disección y las burlas los ovarios siguiente paso 2, coloque los ovarios en 200 l de cualquier solución de tinción particular en un pocillo de una placa de disección. Incubarlos durante 10 minutos con el plato cubierto por una caja adecuada envuelto con papel de aluminio para protegerlo de la luz. Lavar los ovarios manchadas moviendo cuidadosamente con unas pinzas en 3 pozos consecutivos containinmedio g sin mancha.
3. Para co-tinción con TMRE y la mancha mitocondrial global que sea compatible, siga el protocolo anterior para teñir primero con TMRE e inmediatamente con la tinción mitocondrial global (sin pasos de lavado en el medio).
4. Montar los ovarios en un plato con fondo de cristal polyl-lisina recubierto tras el paso 3 y prepararse para la microscopía confocal de barrido con los parámetros apropiados (Tabla 1), siguiendo los pasos 4.2-4.4.
   NOTA: La señal de los colorantes incorporados no duró al intentar montar las muestras teñidas en medio de montaje.
5. Marque la casilla seccionamiento Z para abrir la pestaña. Gire la rueda de enfoque hacia el fondo de la muestra mientras se está escaneando-vivo y hacer clic en "establecer en primer lugar" para definir la sección Z situado más abajo. Hacer lo mismo mientras se mueve la rueda de enfoque hacia la otra dirección para definir la sección superior.
6. Realizar la adquisición de la imagen haciendo clic en "iniciar el experimento."
7. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de fondo con corrección de las regiones de interés para la señal de fondo y las células individuales (como en el paso 4.7) y representar los datos utilizando cualquier software de trazado.

6. Generación de Drp1 Null Mosaicos

NOTA: La estrategia clonal utilizado aquí introduce proteína fluorescente (GFP) clones negativos al nulos verdes Drp1 en el fondo de una, fenotípicamente fondo de tipo salvaje GFP-positivo que es heterocigoto para la mutación genotípicamente nula Drp1 ^9. Inducida por choque de calor diana reconocimiento flipasa-flipasa (FLP-FRT) mediada por sitio específico mitótico recombinación crea clones homocigotos del alelo nulo drpKG03815 funcionalmente. El genotipo de Drosophila que lleva el mutante Drp1 es drpKG03815 FRT40A / CYO, mientras que el genotipo que lleva el FLP inducida por choque térmico (hsFLP) y UbiGFP marcador clonal es hsflp; nls-GFP ubiquitina (UbiGFP) FRT 40A / CyO. El genotipo de la SEdescendencia seleccionada del cruce entre los genotipos anteriores es hsFLP / +; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Sincronizar la Drosophila para la recolección virgen moviéndolos en nuevos frascos de alimentos frescos cada 2 a 3 días. Monitorear los viales pupariating diaria con el fin de recoger las hembras vírgenes emergentes.
2. Recoger, rizado-ala hembras vírgenes con los ojos rojos del genotipo mutante Drp1 todos los días, una vez por la mañana y otra por la noche, y colocarlos en un vial separado. Al mismo tiempo, recoger macho de Drosophila con los ojos de color rojo oscuro y alas rectas que llevan hsflp y UbiGFP dentro de los 5 días de la eclosión.
3. Configurar una cruz mediante la adición de los machos a las hembras vírgenes con una relación mujer: hombre de 2: 1.
4. Se espolvorea con una pequeña cantidad de levadura granulada para estimular la producción de huevos.
   NOTA: mover con cuidado la Drosophila a un vial fresco de los medios cada 2 a 3 días para aumentar la cantidad de progenie y para reducir el hacinamiento vial.
5. Unesthetize, ordenar y recoger directamente de alas, la progenie femenina de ojos rojos dentro de los 5 días de la eclosión.
6. Para el choque térmico, coloque la Drosophila recogida en viales vacíos con una pequeña cantidad de levadura granulada y una pequeña, suave limpie (para absorber la humedad durante el choque térmico). Colocar el vial con la Drosophila en un baño de agua a 38 ºC durante 1 h, para generar clones de células principalmente del folículo, y a 37 ºC durante 1 h dos veces al día (que permite al menos 5 h entre los choques 2 de calor) durante 2 días consecutivos , para generar tanto los clones de células de la línea germinal del folículo y.
   NOTA: Asegúrese de que el vial está completamente sumergido en el agua hasta el nivel del tapón.
7. El golpe de calor puede hacer que la inmovilidad de Drosophila. Deje que la Drosophila-shock de calor para recuperar durante 1 hora a temperatura ambiente cuando se convierten en móvil nuevo.
8. Añadir los machos de nuevo a las hembras en la misma proporción que en la cruz, y moverlos a viales frescas con medium roció con una pequeña cantidad de levadura granulada. Mantener la Drosophila durante al menos 5 días.
9. Diseccionar los ovarios, según sea necesario para un experimento en vivo o fijo.
   NOTA: Los ovarios aislados del parental Drosophila expresando UbiGFP deben utilizarse como controles negativos para confirmar la inducción eficiente de los clones GFP-negativos por el choque térmico.

7. Co-inmunotinción para ciclina E y mitocondrias

NOTA: Para detectar Drosophila Ciclina E (dCyclinE), hemos utilizado un anticuerpo obtenido comercialmente planteado específicamente contra dCyclinE ⁹ (ver Tabla de Materiales). Como marcador mitocondrial, se utilizó un anticuerpo contra ATP-B (una subunidad del complejo de ATP sintasa mitocondrial) ^9.

1. Cálido 4% de paraformaldehído (PFA) a temperatura ambiente, 25 ° C. ¡Precaución! Paraformaldehído es tóxico.
   NOTA: Después de la aperturala ampolla, PFA debe ser almacenado a 4 ° C y utilizarse dentro de los 7 días. Esto es porque el almacenamiento de PFA puede permitir la oxidación de metanol que pudieran alterar dramáticamente las membranas mitocondriales durante la fijación, incluso si está presente en cantidades traza.
2. Inmediatamente después de la disección, fijar los ovarios disecados, colocándolos en 200 l de PFA fresco en un pocillo de una placa de disección de vidrio (sin broma). Mantener el plato en una campana de humos durante 15 minutos. Lavar los ovarios fijos moviendo con cuidado con las pinzas en 3 pozos consecutivos, cada uno con 200 l de solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS).
   NOTA: El experimento se puede parar aquí y las muestras se puede dejar a 4 ºC durante 1 día.
3. Tease los ovarios más a fondo en PBS (similar al paso 2.6) para quitar cuidadosamente la vaina fibrosa protectora que pueden dificultar el acceso del antígeno por el anticuerpo.
4. Permeabilizar los ovarios molestado por su inclusión en un tubo de microfuga con 500 l de recién hechos 0.5% de PBS-Triton-X100 (PBS-TX) y se incuba durante 30 minutos mientras se balancea a 25 rpm.
   NOTA: Durante el balanceo, se colocan los tubos en paralelo al movimiento de balanceo; colocándolos perpendicularmente puede permitir que el tejido se pegue a la tapa de los tubos, lo que resulta en la pérdida de tejido.
5. Para retirar el PBS-TX, coloque los tubos de microcentrífuga en un bastidor para permitir que el tejido se asiente en la parte inferior de los tubos. Inspeccionar visualmente y toque los tubos, si es necesario, para que cualquier tejido que flotan hacia la parte inferior. Aspirar la solución cuidadosamente de la parte superior, asegurándose de que el tejido en la parte inferior de los tubos permanece inalterado.
6. Bloquear los ovarios mediante la adición de 200 l de 2% de albúmina de suero bovino (BSA) disuelto en 0,5% PBS-TX, y se incuba en el eje de balancín a temperatura ambiente durante 1 h. Quitar el agente de bloqueo siguiendo el paso 7.5.
7. Añadir anticuerpos primarios en 200 l de agente de bloqueo fresco: anticuerpo anti-conejo dCyclinE (1: 100) y anti-ratón de anticuerpo ATP-B(1: 100). Incubar los tejidos en la mecedora durante 2 horas a temperatura ambiente.
8. Lavar los ovarios con PBS-TX 3 veces durante 15 minutos cada uno, después del paso 7.5.
9. Añadir 200 l de los anticuerpos secundarios apropiados en fresco PBS-TX: anti-ratón-CY3 (1: 1000) y anti-conejo con Cy5 (1: 500). Incubar en el eje de balancín por 1 h a temperatura ambiente.
10. Lavar los ovarios con PBS-TX 3 veces durante 15 minutos cada uno, después del paso 7.5.
11. Para teñir el ADN, añadir Hoechst (dilución 1: 1000) a la final de lavado PBS-TX.
12. Por último, dejando los tejidos en 500 l de PBS 1x.
13. Usando una micropipeta de 1 ml, quitar los ovarios immunostained desde el tubo de microcentrífuga en un pozo fresco de un plato de disección de vidrio que contiene 200 l de PBS.
14. Añadir una gota de medio de montaje basado en glicerol a un portaobjetos de vidrio y añadir el ovarios inmunote~nido uno por uno para el medio de montaje.
    NOTA: Asegúrese de que los ovarios están efectivamente transferidos al medio de montaje. El no poder hacer so dará lugar a la pérdida de tejido.
15. Mientras mira a través del microscopio de disección, arrancar suavemente la ovarioles transparentes (etapas más jóvenes) de los opacos cámaras de huevos maduros utilizando la aguja de las burlas mientras sujeta la parte opaca del ovario con las pinzas. Retire las cámaras de huevos maduros desde el medio de montaje.
16. Colocar un cubreobjetos (22 mm, N ° 1) en la diapositiva y presione ligeramente para asegurarse de que el medio de montaje se extiende uniformemente por debajo.
    NOTA: Al pulsar sobre el cubre también asegura la alineación correcta del tejido a lo largo del cubreobjetos. Si no lo hace de manera óptima puede permitir que las etapas más pequeñas que flotan en el medio de montaje, evitando la microscopía óptimo de esos tejidos.
17. El aire seco de las muestras durante 15 minutos y sellar los bordes del cubreobjetos con cuidado con esmalte de uñas.
18. Realizar microscopía confocal según la necesidad experimental (Tabla 1).

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Resultados

Los métodos descritos se pueden utilizar para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los ovarios de Drosophila vivas y fijos (Figura 2B). Se proporcionan algunos ejemplos de los resultados anticipados obtenidos con los métodos descritos.

Disección del ovario Drosophila: Cuando diseccionado adicional, los abdómenes cortadas (Figura 3B) de la totalidad ...

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Discusión

Los pasos críticos dentro del Protocolo

Photobleaching: Prevención de photobleaching indebida de muestras fluorescentes es absolutamente necesario para la realización de la microscopía confocal eficiente. Por lo tanto, el tiempo utilizado para localizar muestras a través del ocular o para establecer los parámetros de adquisición de imágenes a través del modo de escaneado directo debe reducirse al mínimo para reducir al mínimo photobleaching.

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging