Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em&gt; Drosophila</em&gt; Yumurtalıklar

Özet

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

Özet

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

Giriş

Onlar farklılaşmış hücrelerin enerji üretiminin ana koltuklar beri Mitokondri klasik, hücresel güç merkezi olarak tarif edilmektedir. Ayrıca, mitokondri metabolizma, ısı üretimi, lipit modifikasyonu, kalsiyum ve redoks homeostazı kritik bir rol, hücre sinyal süreçlerinin orkestrasyon, vb ¹ oynarlar. Mitokondri aktif bir hücre ölümü ² indüklenmesinde rolü hem de hücre döngüsünün düzenlenmesi ³ görüntülemektedir. Böyle çok işlevsellik şu temel soruları gündeme getiriyor: a) nasıl mitokondri aynı anda tüm bu işlevleri yerine ve farklı fonksiyonlar için özel olan belirli mitokondriyal havuzları veya alt bölgeler b) vardır mı? Bu bağlamda, çok fonksiyonlu mitokondri tek tek hücrelerin içindeki şekil, boyut ve yapıda dinamik olduğu ve mitokondri kararlı durum şekil hücre tipleri arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir. Çeşitli laboratuvardan yıllarca araştırmaOratories mitokondriyal şekil, boyut, yapı ve toplu olarak adlandırılan mitokondriyal dinamiklerin değiştirilmesi, çeşitli mitokondriyal fonksiyonları ^4,5,6 muhafaza etmek için çok önemli olduğunu _{düşündürmektedir.} Bu bulgular, mitokondrinin kendi yapısal dinamizm sayesinde onların çok işlevi yerine getirmek ihtimalini yükseltmek.

Kapsamlı çalışmalar mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak için çalışmalar devam etmektedir. mitokondriyal yapının hareketlilik esas olarak birbirleri ile füzyon füzyon olayları geçmesi kabiliyetleri ile muhafaza edilmektedir. Iki küçük mitokondri arasındaki füzyon daha büyük bir mitokondriyal eleman ⁷ içine birleştirir ise büyük mitokondri Bölünme, küçük mitokondriyal elemanları dönüştürür. Ayrıca, iki mitokondri geçici füzyon içerikleri karışmasını sağlamak için oluşabilir. İç ve dış mitokondriyal membran fizyon ve füzyon olayları dikkatle spec tarafından yönetilirIFIC proteinlerinin ayarlar. Çekirdek fisyon makine Drp1 türünü de kontrol edilebilir olsa da, belirli niyetli mitokondriyal protein (ör Fis1 ya Mff1) ile etkileşim yoluyla mitokondri sitoplazmada katılım olur Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) oluşmaktadır mitokondriyal yüzeyi ⁴ üzerine diğer proteinler bulunmaktadır. Drp1 dış membran üzerinde çalışmasına rağmen, onun fizyon yetenekleri yanı sıra iç zarı etkiler. dış ve iç mitokondriyal membran fisyon düzenleme tam olarak anlaşılamamıştır. Mitofusins dış zar ⁵ füzyon yöneten Diğer taraftan, iç membran füzyon, OPA1 faaliyetleri ile özünde yönetilir. mitokondri mücadele fizyon ve füzyon olayları dengesi bir hücrede kararlı durum mitokondriyal şeklini belirler. Örneğin, mitokondriyal fisyon bastırılması, tam ve rakipsiz füzyon neden olur mitokondri aşırı aktivitesi sırasındal fisyon mitokondri ³ parçalanmasına neden olur.

mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin incelenmesi öncelikle iki ücretsiz yaklaşımları içerir: a) mitokondriyal fisyon / füzyon proteinlerinin genetik manipülasyon sonra hücresel ve organizma fenotip analizi ve b) mitokondriyal yapı ve fonksiyonunun doğrudan değerlendirmeler. Fenotipleri ikincil etkileri nedeniyle ortaya çıkabilecek genetik analizler hep, (bu durumda, mitokondriyal fisyon / füzyon proteinleri olarak) eldeki molekülün doğrudan işlevselliğini ortaya olmayabilir dikkat çekicidir. Bu nedenle, geliştirmek ve doğrudan mitokondriyal yapı ve işlevlerini incelemek için araçları kullanmak için büyük önem taşımaktadır. mitokondriyal yapının herhangi bir değerlendirme çeşitli mikroskopi araçları içerir. mitokondriyal dinamizm hem nitel hem Quantität izlenebilir beri canlı hücre floresan mikroskobu kullanımı büyük ölçüde, mitokondriyal dinamikleri çalışmalar ilerlemiştirUygun floresan mikroskopi araçları ve teknikleri ⁸ kullanarak ively. Floresan mikroskopi tabanlı araç vivo ⁹ mitokondriyal dinamizm önemini açıklık, canlı ve sabit Drosophila melanogaster dokularında mitokondriyal yapısını ve işlevini incelemek için geliştirilmiştir. Bu ve ilgili yöntemler Drosophila yumurtalık mitokondriyal yapı ve fonksiyona okuyan amacı ile, burada açıklanmıştır.

Drosophila yumurtalık germarium ^10,11 bulunan ilgili yetişkin kök hücrelerden ortaya çıkan tohum çizgisi ve somatik soy oluşur. Onaltı sinsityal germ hücreleri (KR) germarium (Şekil 1) ortaya çıktığını bireysel yumurta odaları oluşturmak için somatik folikül hücreleri (FC) tarafından kapsüle olsun. 16 GClerin biri bir oosit olmaya kararlıdır olsun ve kalan 15 GC'ler oosit odasının büyümesini destekleyen hemşire hücrelerine dönüşebilirBu serilir önce yumurtanın olgunlaşmasını kolaylaştırmak. onlar ölümcül ön folikül hücreleri (AFCS), arka folikül hücreleri (PFC) ve ana gövde hücrelerinden oluşan bir desenli epitel hücre katmanı içine ayırt etmek için mitotik hücre döngüsü çıkmadan önce FC'lerin çoğunluğu mitotik bölünmeleri 9 mermi tabi (MBCS) . birbirini takip eden yumurta odaları aynı zamanda erken gelişme FCS türetilen hücreler ayrılır sap hücreleri tarafından bağlanır. Mitokondriyal fisyon protein Drp1 tarafından düzenlenen mitokondriyal şekil aktif Drosophila over FC tabakasının ^9,12 normal gelişimi sırasında farklılaşma sürecine dahil edilmektedir. Drosophila folikül hücre katmanı gelişiminde Drp1 katılımını tanımlamak için bu çalışmalarda kullanılan yöntemler burada açıklanmaktadır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Drosophila 1. Hazırlama (Şekil 2A'da tasvir edilmiştir gerekli araçlar)

1. Tarif edilen deneylerin herhangi biri için, Drosophila toplama eclosion 5 gün içinde (oda sıcaklığına ya da 25 ° C 'de muhafaza) ve 5 ile doldurulmuş bir şişeye koyun - en fazla 25 olan 7 mL Drosophila gıda (Malzeme Tablo) her flakon uçar; 2 erkek oranı: bir kadın korumak 1.
2. Drosophila yumurta üretimini uyarmak için granül maya az miktarda serpin. 4 gün - 2 içinde deneysel manipülasyon gerçekleştirin.

Drosophila Yumurtalıkların 2. Diseksiyon (Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları)

1. Sıcak böcek kesme ortamı oda sıcaklığına 25 ° C (Malzeme Tablo). Sekiz oyuklu cam kesme çanak üç kuyu doldurmak her ortamın 200 uL de.
2. CO ile Drosophila uyutmak _{2 flakon fiş altında darbe silahın iğne koyarak. Bir sinek pad üzerinde yerleştirin. , Sıralamak 5 kadın Diseksiyon mikroskop kullanarak ve diseksiyon çanak ilk kuyuda koyun. Canlı mikroskopisi yaparken her seferinde bir Drosophila anlaştım.}
3. Diseksiyon mikroskop mercek aracılığıyla bakarken, forseps iki çift kullanarak karın göğüs kafesi sever. forseps kullanarak, dikkatli bir çanak ikinci kuyusuna karınlarını aktarın.
4. forseps diğer çifti ile (diğer karın içeriği ile birlikte) yumurtalıkların dışarı itmek yavaşça arka sonunda karın tutmak için forseps bir çift kullanın ve. Bu girişim başarısız olursa, dikkatle yumurtalıkların serbest bırakmak için ön ucunu forseps takarak karın dış iskelet kaldırın.
5. Forseps kullanarak, (yani, sarısı dolu, ileri evre yumurta) opak arka sonuna kadar tek bir yumurtalığı tutun ve çanak üçüncü kuyunun dikkatle taşımakCanlı mikroskobu (adım 3) için işlemek için alay veya immün (adım 7) gerçekleştirmek sabitlemek için.
6. Dikkatle forseps bir çift ile arka sonuna tutarken her yumurtalık ön ucuna posteriorundan hafifçe alay iğne süpürülerek yumurtalıkların etrafında koruyucu kılıfı alay.
   NOT: alay sırasında zararı en aza indirmek iğne ucu bükün ve mikroskop (Şekil 2A) büyütme artırarak her yumurtalık yakınlaştırmak için. Alay kılıf kırmak için yeterli etkili olmalıdır, ama aynı zamanda dikkatli ovaryolden bütünlüğünü korumak için gerçekleştirilmelidir.

Canlı doku Mikroskopi 3. Hazırlık

NOT: Şekil 2A tasvir edilmektedir gerekli araçları.

1. Drosophila diseksiyonu önce, poli-I-Lizin kaplı odaları hazırlamak. Bu amaçla, covergl ilgili poli-I-lisin (0.1 mg / mL), iki adet 20-uL damla yerleştirmekeşek damla birleştirme önlemek amacıyla birbirinden uygun bir uzaklıkta bulunan bir cam tabanlı bir petri (35 mm) (14 mm, No. 0). 37 ° C'de 1 saat boyunca levhalar hava kuru ve silinebilir marker ile plakanın alt beyaz poli-I-Lizin filmin kenarları işaretleyin.
   Not: poli-I-lisin ile kaplanmış oda, bir hafta boyunca 4 ° C'de saklanabilir. Daha önce kaplanmış odacığı kullanılarak durumunda, Drosophila diseksiyon başlamadan önce, oda sıcaklığına kadar getir.
2. Örnek olarak aşağıda, diseksiyon ve montaj tamamlandıktan sonra hemen görüntülü olabilir emin olmak için konfokal mikroskop tarama parametrelerini ayarlayın.
3. bir disseke ve yumurtalık alay (aşağıdaki adım 2 ve adım 5 Aşağıdaki gerekirse, lekeli) belirgin bir poli-I-Lizin kaplı bölgeye yerleştirin ve ovaryolden ayırmak için alay iğne ile yumurtalık yayıldı. t karşılamak için emin olun, yumurtalık üstünde böcek diseksiyon orta 10 ul damla yerleştirinO tüm alanı poli-I-Lizin kaplı. petri örtün.
4. Hemen oda sıcaklığında monte numunenin konfokal mikroskopi gerçekleştirin.
   Not: Sadece bir Drosophila, parçalara işlenir ve her seferinde görüntülü olmalıdır. Ayrıca, mikroskopi Drosophila doku için bir ısı şoku ortamı taklit eden 37 ° C de yapılan bir işlem değildir.

Photobleaching (FLIP) Tahlili 4. Floresan Kaybı Mitokondriyal Matrix Süreklilik değerlendirin

NOT: kaynaşmış mitokondriyal yapıda Mitokondriyal matriks süreklilik ara adımlarda bir ilerleme aşağıdaki mitokondriyal iç ve dış membran tam füzyon sonra kurulmuştur. Mitokondri fisyon aynı adımları uygulayın ancak ters yönde (Şekil 3A) olabilir. FLIP mitokondriyal matris sürekliliği değerlendirmek için kullanılabilen bir zaman atlamalı mikroskopi-bazlı yarı-kantitatif bir yöntemdirCanlı Drosophila yumurtalıklarda ⁹ ex vivo mitokondri nihai sigortalı durumu (Şekil 3A 3. ve 4. adımları). FLIP deneyi düzenli aralıklarla (Şekil 3A FLIP ROI) de photobleached mitokondrial matriks bir floresan molekülü ifade mitokondri ilgi alanları (ROI) küçük bir bölge olarak yapılır. Bunun bir sonucu olarak, (Şekil 3A'da deney ROI) FLIP ROI ile süreklidir herhangi bir çevre mitokondriyal bölgesi nedeniyle, sürekli mitokondrial matris moleküllerin değişimi sinyali kaybeder. Burada gösterilen FLIP deneyleri, bir serbest difüze biçimde mitokondrial matris için hedef YFP ile etiketlenmiş, insan sitokrom oksidaz VIII alt biriminin mitokondriyal hedefleme sekansı ihtiva mitoYFP ifade eden Drosophila üzerinde gerçekleştirilir. Daha önce rapor edildiği gibi benzer bir deney, Mito pUASP-mito-GFP transgen ile gerçekleştirilebilir ^{9. Benzer bir FLIP protokolü dış füzyonundan elde edilen süreklilik tespit edebilmek için mitokondriyal arası zar alanı hedefleyen bir prob ile kullanılabilir ancak değil, iç mitokondriyal membranlar (Şekil 3A'da aşama 2) hazırlandı.}

1. Konfokal mikroskop görüntü elde etme yazılımı açın ve "Toplama" sekmesinde (Tablo 1) uygun tarama parametrelerini ayarlamak. Bireysel sekmeleri açmak için "Zaman serisi", "Bleaching" ve "Bölgeler" kutuları işaretleyin. Her sekmede (Tablo 1) uygun satın alma parametre değerleri koyun.
   NOT: Bu deney, tek tek hücrelerin bütün mitokondriyal halktan genel sinyali izlemek için tasarlanmıştır olarak iğne deliği, açık bırakılmalıdır.
2. Hızlı monte eden canlı dokuda ilgi alanını bulmak için mercek kullanın.
   NOT: iyi cam bottome yayılır ovaryolden seçind çanak beri konfokal mikroskopi yüzen ovaryolden üzerinde gerçekleştirilemez.
3. "Canlı" seçeneğini tıklayın ilgi seçilen alanın canlı bir görüntü elde etmek için. Click canlı taramayı durdurmak için "stop".
4. Gerekirse offset değerlerini ayarlayarak tarafından belirlenen, tanımlanan arka plan ile ( "menzil göstergesi" seçenek işaretlendiğinde kırmızı piksel yokluğu ile gösterilir) tespit floresan sinyal doyma seviyelerinin altında olacak şekilde toplama parametreleri, ayarlayın.
5. canlı tarama ile elde edilen görüntü üzerinde photobleaching bölgesini ayırmak için "Bölgeler" sekmesinden Bezier çizim aracını kullanarak küçük bir ROI çizin.
   NOT: ROI boyutu yaklaşık 20 olmalıdır - hücre içinde toplam floresan mitokondriyal sinyal% 50.
6. üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin "deney başlar."
7. Malzemeler (bkz floresan özel veya açık kaynak yazılımı kullanarak ölçmekTablo). tekrarlayan ağartma hedeflenen ROI ortalama sinyalini (FLIP) kaydedin; ağartma aynı hücrede gerçekleştirilmemiş ROI (Deneysel); aynı görüş alanında başka ağartılmamış hücreden YG, deney süresi (Bleaching) sırasında genel beyazlatma değerlendirmek için; ve arka plan alanı (arka) üzerine YG. Diğer ROI ortalama sinyalinden elde edilen ortalama arka plan sinyalini çıkartın. İlgili hücre için ilk ön-ağartma sinyali ile flüoresan sinyal normalize.
8. herhangi bir standart çizim yazılımı kullanarak normalleştirilmiş verileri çizilir.

Floresan Mitokondriyal Boyalar 5. Canlı Boyama

NOT: Kararlı durum mitokondriyal yapı ve potansiyel özellikle canlı hücrelerde ve dokularda mitokondri içine dahil boyalar kullanılarak değerlendirilebilir. Canlı Drosophila yumurtalıklar floresan mitokondriyal ile ex vivo olarak boyanabilirlekeleri (mito-ROS) üretimi mitokondriyal reaktif oksijen türlerini değerlendirmek için, mitokondri görselleştirmek için, ve birim kütle başına mitokondriyal potansiyelini değerlendirmek için. Bu mitokondriyal potansiyometrik boya tetrametilrodamin etil ester (TMRE) ve mitokondriyal kütle temsil uyumlu canlı mitokondriyal leke ile birlikte boyama ile gerçekleştirilebilir (spesifik boyalar için malzemeler Tablo).

1. son çalışma konsantrasyonları orta diseksiyon sıcak böcek lekeleri stokunu: mitokondriyal leke, 250 nM; TMRE, 50 nM; ve mito-ROS leke, 5 mcM.
2. diseksiyon ve Aşama 2'ye göre yumurtalık alay sonra, diseksiyon kabına herhangi bir özel boyama çözeltisi 200 uL olarak yumurtalıkların yerleştirin. ışıktan korumak için alüminyum folyo ile sarılmış uygun bir kutu ile kapalı bir çanak ile 10 dakika boyunca inkübe edin. containin 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatlice taşıyarak lekeli yumurtalık yıkayınleke olmadan gr orta.
3. TMRE ve uyumlu genel mitokondriyal leke ile birlikte boyama için, (aralarında herhangi bir yıkama adımları olmadan) genel mitokondriyal leke hemen ilk TMRE ile ve daha sonra leke için yukarıdaki protokol izleyin.
4. Aşağıdaki, bir poli-I-Lizin kaplı cam tabanlı çanak aşağıdaki adımı 3 yumurtalıkların monte edin ve uygun tarama parametreleri (Tablo 1) ile konfokal mikroskopi için hazırlık 4.2-4.4 adımları tekrarlayın.
   NOT: montaj orta lekeli örnekleri monte çalışırken dahil boyalar sinyal sürmedi.
5. sekmesini açmak için Z-kesit kutuyu işaretleyin. canlı-taranırken numunenin altına doğru odak tekerleğini döndürün ve en alttaki Z-bölüm tanımlamak için "İlk seti" üzerine tıklayın. üstteki bölümü tanımlamak için diğer yönünde odak tekerleğini hareket ederken aynı işlemi uygulayın.
6. üzerine tıklayarak görüntü elde etme gerçekleştirin "deney başlar."
7. (Adım 4.7 gibi) Arka plan sinyali ROI ve tek tek hücreler artalan-düzeltilmiş floresan yoğunluğunu ölçme ve bir çizim yazılımı kullanılarak veri arsa.

Drp1 Boş Mozaik 6. Nesil

Not: Burada kullanılan klonal stratejisi Drp1 hiçbir mütasyon ⁹ genotipik heterozigotik olan bir GFP pozitif, fenotipik olarak yabanıl-tip arkaplan ve arka yeşil floresan protein (GFP) negatif Drp1 boş klonlar getirmektedir. Isı şoku kaynaklı flippase-flippase tanıma hedefi (FLP-FRT) aracılı site-spesifik mitotik rekombinasyon fonksiyonel boş drpKG03815 alleli homozigot klonlar oluşturur. Drp1 mutantını taşıyan Drosophila genotip drpKG03815 FRT40A / CYO olan ısı şoku kaynaklı FLP (hsFLP) ve UbiGFP klonal markör hsflp olan taşıyan genotip ise; ubikitin nls-GFP (UbiGFP) FRT 40A / CYO. se genotipYukarıdaki genotipleri arasında çapraz seçilir ve yavrular hsFLP / + ise; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. Taze gıda yeni şişeleri her 2 ila 3 gün taşıyarak bakire koleksiyonu için Drosophila eşitleyin. Gelişmekte olan bakire kadın toplamak için günlük pupariating şişeleri izleyin.
2. akşam bir kez sabah ve bir kez, her gün Drp1 mutant genotip gelen kırmızı gözlü, kıvırcık kanat bakire kadın toplamak ve ayrı bir şişenin içine koyun. Buna paralel olarak, erkek Drosophila koyu kırmızı gözleri ve eclosion 5 gün içinde hsflp ve UbiGFP taşıyan düz kanatları ile toplamak.
3. 2 erkek oranı: Bir kadın ile bakire kadın için erkek ekleyerek bir haç kurmak 1.
4. yumurta üretimi uyarmak için granül maya az miktarda serpin.
   NOT: Dikkatle döl miktarını artırmak için her 2 ila 3 gün medyanın taze flakon için Drosophila taşımak ve flakon kalabalık azaltmak için.
5. biresthetize, sıralama ve toplamak düz kanatlı, eclosion 5 gün içinde kırmızı gözlü kadın döl.
6. Isı şoku için, (ısı şoku sırasında nemi emmek için) silin, yumuşak, granül maya az miktarda ve küçük boş şişelere toplandı Drosophila yerleştirin. Esas olarak folikül hücresi klonlarını elde etmek için, 1 saat boyunca 38 ° C'de bir su banyosunda Drosophila ile flakon yerleştirin ve iki kez 1 saat boyunca 37 ° C, günde 2 ardışık gün boyunca (2 ısı şoku arasında en az 5 saat sağlayan) , germline ve folikül hücre klonları hem üretmek için.
   NOT: Flakon tamamen fiş seviyesine kadar su batık olduğundan emin olun.
7. Isı şoku Drosophila hareketsiz hale getirebilir. Yine mobil olduğunda ısı ile şoklanmış Drosophila oda sıcaklığında 1 saat süre ile geri izin verin.
8. ortada aynı oranda kadın geri erkek ekleyin ve Mediu ile taze şişelere taşıyabilirsinizm granül maya küçük bir miktar ile serpilir. En az 5 gün süreyle Drosophila koruyun.
9. Canlı veya sabit deney için gerekli yumurtalıklar teşrih.
   Not: Ebeveyn Drosophila ifade UbiGFP izole Yumurtalık ısı şoku ile GFP-negatif klonlannın etkin indüksiyonunu teyit etmek için negatif kontroller olarak kullanılır.

7. Siklin E ve mitokondri için Co-immün

Not: Drosophila siklin E (dCyclinE) tespit etmek için, özel olarak dCyclinE ⁹ karşı ortaya çıkartılan bir ticari olarak elde antikor kullanmıştır (Malzeme Tablo). Mitokondriyal işaretleyici olarak, ATP-B'ye karşı bir antikor (mitokondrial ATP sintaz kompleksinin alt-birimi) ⁹ kullanılır.

1. Sıcak% 4 paraformaldehid, oda sıcaklığına kadar (PFA), 25 ° C. Dikkat! Paraformaldehit toksiktir.
   NOT: Açılıştan sonraampul, PFA, 4 ° C'de saklandı ve 7 gün içinde kullanılmalıdır. PFA depolama önemli ölçüde tespit sırasında mitokondrial membranlar değiştirecek metanol oksidasyonu izin verebilir, bu da, eser miktarlarda mevcuttur.
2. Hemen diseksiyonu sonrası, (alay olmadan) bir cam diseksiyon çanağı bir kuyunun taze PFA 200 uL onları yerleştirerek disseke yumurtalıklar düzeltin. 15 dakika boyunca, bir çeker ocak içinde bir çanak tutun. 3 ardışık kuyu içine forseps ile dikkatli bir şekilde hareket 1x fosfat tamponlu tuzlu su, her biri 200 uL (PBS) ile tespit yumurtalık yıkayın.
   NOT: Deney burada durdurulabilir ve numuneler için 1 gün 4 ° C'de bırakılabilir.
3. dikkatle antikor ile antijen erişimini engelleyebilir koruyucu fibröz kılıfı çıkarmak için (benzer 2.6 adıma) PBS içinde daha iyice yumurtalıkların Tease.
4. 0 yaptı taze 500 ul bir mikrofuge'de tüp yerleştirerek alay yumurtalıklar geçirgenliği.25 rpm'de sallanan ise% 5 PBS-Triton-X100 (PBS-TX) ve 30 dakika için inkübe edilir.
   NOT: sallanan sırasında tüpler sallanan harekete paralel yerleştirin; böylece doku kaybı ile sonuçlanan, doku tüpler kapağı sopa izin verebilir dik yerleştirerek.
5. PBS-TX kaldırmak için, doku tüplerin dibinde yerleşmek için izin rafa mikrofuge'de tüpleri yerleştirin. Gerekirse dibine herhangi bir kayan dokuları getirmek, görsel olarak kontrol edin ve tüpler dokunun. tüplerin alt kısmında doku bozulmamış kalır emin, üstten dikkatlice çözüm aspire.
6. % 0.5 PBS-TX içinde eritildi,% 2 sığır serum albümininin 200 uL (BSA) ilave edilerek yumurtalıklar bloke edildi ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında rocker üzerinde inkübe edin. adım 7.5 izleyerek engelleme ajanı çıkarın.
7. Taze bloke edici madde, 200 uL primer antikor ekleyin: anti-tavşan dCyclinE antikoru (1: 100) ve anti-fare ATP-B antikoru(1: 100). Oda sıcaklığında 2 saat boyunca rocker dokuları inkübe edin.
8. Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın.
9. Taze PBS TX uygun ikincil antikor 200 uL ekleyin: anti-fare-Cy3 (1: 1000) ve anti-tavşan-Cy5 (1: 500). Oda sıcaklığında 1 saat boyunca rocker üzerinde inkübe edin.
10. Aşama 7.5 ardından her biri 15 dakika için PBS-TX ile 3 kez yumurtalıkların yıkayın.
11. Nihai PBS-TX yıkama: (1000 seyreltme 1) DNA leke, Hoechst ekleyin.
12. Son olarak, 1 x 500 ul PBS doku bırakın.
13. 1 ml mikropipet kullanılarak, 200 ul PBS içeren bir cam kesme çanak taze kuyuya mikrofüj tüpü immüno yumurtalıkların alınması.
14. Bir cam slayt gliserol tabanlı montaj orta bir damla ekleme montaj ortamına tek immüno yumurtalıklar bir ekleyin.
    NOT: yumurtalıklar gerçekten montaj ortamına aktarılır emin olun. s yapamadığımızo doku kaybına yol açacaktır.
15. Diseksiyon mikroskobu ile bakarken, hafifçe forseps ile yumurtalık opak kısmını tutarken alay iğne kullanılarak opak olgun yumurta odalarından şeffaf ovaryolden (genç aşamaları) koparmak. montaj orta olgun yumurta odaları çıkarın.
16. montaj orta üniform altında yayılır emin olmak için slayt ve hafifçe basın üzerinde coverglass (22 mm, No. 1) yerleştirin.
    NOT: coverglass basılması da coverglass boyunca doku düzgün hizalama sağlar. bu yüzden en iyi şekilde yapmak, başarısız olan dokuların optimal mikroskopi önlenmesi, küçük aşamaları montaj orta float izin verebilir.
17. 15 dakika boyunca örnekleri Hava kurutun ve dikkatle oje ile coverglass kenarları mühür.
18. Deneysel ihtiyacı (Tablo 1) göre konfokal mikroskopi gerçekleştirin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Tarif edilen yöntemler, canlı ve sabit Drosophila yumurtalık (Şekil 2B) mitokondriyal yapı ve fonksiyon çalışma için kullanılabilir. tarif edilen yöntemlerle elde edilen beklenen sonuçları bazı örnekler sunulmuştur.

Drosophila over diseksiyonu: Daha fazla disseke zaman bütün Drosophila (Şekil 3A) kopmuş karnı (Şekil 3B) h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Protokol çerçevesinde kritik adımlar

Photobleaching: floresan numunelerin aşırı photobleaching önlenmesi verimli konfokal mikroskopi gerçekleştirmek için kesinlikle gereklidir. Bu nedenle, mercek aracılığıyla numune bulmak için ya da canlı tarama modu ile görüntü elde etme parametrelerini ayarlamak için kullanılan zaman photobleaching en aza indirmek için minimize edilmelidir.

Doku hasarı: mitokondri hücresel sağl?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging