에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구<em&gt; 초파리</em&gt; 난소

요약

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.

초록

Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.

서문

분화 된 세포들은 에너지 생산의 주요 시트이기 때문에 미토콘드리아 고전 셀룰러 최강으로 설명한다. 또한, 미토콘드리아 대사 발열 지질 변형, 칼슘 환원 항상성에 중요한 역할 셀 시그널링 프로세스 편성 등 ^{일을 담당한다.} 미토콘드리아는 활성 세포 ^사멸이 유도의 역할뿐만 아니라, 세포주기 조절 ^3을한다. 이러한 멀티 기능은 다음과 같은 근본적인 질문을 제기한다 : a) 방법 미토콘드리아 동시에 모든 기능을 수행하고 독특한 기능에 전문화되어 특정 미토콘드리아 풀 또는 서브 존의 b)가 무엇입니까? 이러한 맥락에서, 상기 다기능 미토콘드리아 개별 셀 내에서의 형상, 크기 및 구조를 동적 있음과 미토콘드리아의 정상 모양 세포 유형에 따라 다를 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 여러 실험실에서 연구의 수십 년oratories는 미토콘드리아의 모양, 크기, 구조, 총칭 미토콘드리아 역학의 변화는 다양한 미토콘드리아 기능 ^{4,5,6을 유지하기위한} _중요하는 것이 _{좋습니다.} 이러한 연구 결과는 미토콘드리아가 구조적 역 동성 덕분에 자신의 멀티 기능을 수행 할 수있는 가능성을 올립니다.

광범위한 노력은 미토콘드리아의 구조 - 기능 관계를 이해하기 진행되고있다. 미토콘드리아 구조의 동력은 주로 서로 분열 및 융합 이벤트를 받아야하는 능력에 의해 유지된다. 두 개의 작은 미토콘드리아 사이의 융합이 큰 미토콘드리아 요소 ^(7)로 병합하는 동안 큰 미토콘드리아의 분열은 작은 미토콘드리아 요소로 변환합니다. 또한,이 미토콘드리아의 과도 융합은 그 내용의 혼합을 허용하도록 발생할 수 있습니다. 내부 및 외부 미토콘드리아 막의 분열 및 융합 이벤트는 조심스럽게 사양이 적용됩니다IFIC는 단백질로 설정합니다. 핵심 분열 기계는 Drp1 기능도에 의해 조절 될 수있는 반면, 어떤 선의의 미토콘드리아 단백질 (예를 들어, Fis1 또는 Mff1)과의 상호 작용에 의해 미토콘드리아에 세포질에서 모집한다 dynamin 관련 단백질 1 (Drp1)로 구성되어있다 미토콘드리아면 ^(4)에 다른 단백질. Drp1은 외막에서 작동되지만, 그 분열 능력뿐만 아니라 내막 영향을 미친다. 외부 및 내부 미토콘드리아 막의 분열의 오케스트레이션은 잘 이해되지 않습니다. mitofusins는 외부 막 ^(5)의 융합을 제어하면서 한편, 내막의 융합은 OPA1의 활동에 의해 코어에 적용된다. 미토콘드리아의 반작용 핵분열 융합 이벤트의 균형은 셀의 정상 미토콘드리아 형상을 지시. 예를 들어, 미토콘드리아 분열의 억압은 완전하고 반대가 융합 될 것이다 미토콘드리아의 이상 활동하면서리터의 분열은 미토콘드리아 ^3의 분열을 초래할 것입니다.

미토콘드리아 구조 - 기능 관계의 연구는 주로 무료 두 접근법을 포함한다 : a) 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질의 유전자 조작 후에 세포 및 생명체의 표현형 분석 b) 미토콘드리아의 구조와 기능을 직접 평가. 이 표현형은 차 효과로 인해 발생할 수있는 유전 적 분석은 항상 (이 경우, 미토콘드리아 분열 / 융합 단백질)의 손에서 분자의 직접적인 기능을 표시하지 않을 수 있음은 주목할 만하다. 따라서, 개발 및 직접 미토콘드리아 구조 및 기능을 연구하기위한 도구를 사용하는 것은 아주 중요하다. 미토콘드리아 구조의 상관 평가 현미경 각종 도구를 포함한다. 미토콘드리아 동성이 양 성적 및 quantitat 모니터링 할 수 있기 때문에 생균의 형광 현미경의 사용은 크게 미토콘드리아 역학 연구를 진행했다적절한 형광 현미경 툴과 ^기술을 사용하여 ⁸ ively. 형광 현미경 기반 도구 생체 ⁹ 미토콘드리아 동력의 중요성을 해명 라이브 고정 초파리 조직에서 미토콘드리아의 구조 및 기능을 연구하기 위해 개발되었다. 이들 및 관련 방법은 초파리의 난소에서 미토콘드리아의 구조와 기능을 연구 목표로, 여기에 설명되어 있습니다.

초파리의 난소는 germarium ^{10, 11에있는} 각각의 성체 줄기 세포에서 발생하는 생식 세포와 체세포 계보로 구성되어 있습니다. 여섯 포체 배아 세포 GCS ()는 germarium (도 1)로부터 나오는 개별 계란 챔버를 형성하는 체세포 여포 세포 (FCS)에 의해 캡슐화 얻는다. 16 GC를 하나의 난자되고 커밋 얻고, 나머지 15은 GC를 난자 챔버의 성장을 지원 간호사 세포로 발달,이 마련되기 전에 난자의 성숙을 촉진. 그들은 말단 전방 여포 세포 (AFCS) 후방 여포 세포 (PFC를) 및 본체 세포 구성된 패터닝 상피 세포층으로 분화하는 유사 분열 세포주기를 종료하기 전에 FCS의 대부분은 유사 분열의 분할 9 원을 겪는다 (MBCS) . 연속 달걀 챔버는 초기 개발에서의 FC에서 파생 된 세포를 분화 줄기 세포에 의해 연결되어있다. 미토콘드리아 분열 단백질 Drp1 의해 조절 미토콘드리아 형상 적극적 초파리 난소 FC 층 ^9,12- 정상적인 발달 동안 분화 과정에 관여한다. 초파리 여포 세포층 개발 Drp1의 관련을 식별하기 위해이 연구에서 사용되는 방법이 여기에 설명된다.

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프로토콜

초파리의 1. 준비 (그림 2A에 묘사되어 필요한 도구)

1. 설명 실험의 경우, 초파리를 수집 우화 5 일 이내 (상온, 25 ºC로 유지), 5로 채워진 유리 병에 배치 - 더 이상 25 이상으로, 7 mL의 초파리의 음식 (재료 표 참조) 각 유리 병에 파리; 이 남성 비율 : 여성을 유지 하나.
2. 초파리 산란율을 자극하는 과립 효모 소량 뿌린다. 4 일 - (2) 내에 실험 조작을 수행합니다.

초파리의 난소 2. 해부 (그림 2A에 묘사되어 필요한 도구)

1. 따뜻한 곤충 해부 매체, 실내 온도 25 ° C를 (재료 표 참조). 여덟 잘 유리 해부 요리의 세 개의 우물을 작성, 각 매체의 200 μL 잘.
2. CO와 초파리를 마취 _{이 유리 병 플러그 아래에있는 블로우 건 바늘을 배치하여. 파리 패드에 배치. 정렬 5 점 만점 여성을 해부 현미경을 사용하고 해부 접시의 제 1 웰에 배치합니다. 라이브 현미경을 수행 할 때 한 번에 하나의 초파리를 처리합니다.}
3. 해부 현미경의 접안 렌즈를 통해보고 있지만, 포셉 두 쌍을 사용하여 복부에서 가슴을 절단. 집게를 사용하여 조심스럽게 접시의 제 2 웰에 복부를 전송합니다.
4. 포셉의 다른 쌍 (다른 복부 내용과 함께) 난소를 밀어 천천히 후방 끝의 복부를 개최 포셉 한 쌍을 사용합니다. 이 시도가 실패 할 경우,주의 깊게 난소를 해제 앞쪽 끝 부분에 집게를 삽입하여 복부 외골격을 제거합니다.
5. 집게를 사용하면 (즉, 노른자 가득, 늦게 단계 계란), 불투명 후방 말까지 개별 난소를 잡고 접시의 세 번째 우물을주의 깊게 이동라이브 현미경 (3 단계)을 위해 그것을 처리하기 위해 괴롭 히고 또는 면역 염색 (7 단계)를 수행하기 위해 고정.
6. 조심스럽게 포셉 한 쌍의 후방 끝을 잡고있는 동안 각 난소의 앞쪽 끝으로 후방에서 가볍게 놀리는 바늘을 청소하여 난소 주위에서 보호 덮개를 애타게.
   참고 : 놀리는 동안 피해를 최소화 바늘 끝을 구부려 현미경 (그림 2A)의 배율을 증가시켜 각각의 난소를 확대합니다. 놀림은 시스 중단 할 정도로 효과적이어야하지만, 또한 신중 ovarioles의 무결성을 유지하기 위해 수행되어야한다.

라이브 조직 현미경 3. 준비

참고 : 그림 2A에 묘사되어 필요한 도구를 제공합니다.

1. 초파리 해부하기 전에 polyL - 라이신 코팅 챔버를 준비합니다. 이를 위해, covergl에 polyL 리진 (0.1 ㎎ / ㎖)을 20 μL 두 방울을 배치엉덩이 방울의 병합을 방지하기 위하여 서로로부터 적당한 거리에 바닥이 유리 페트리 접시 (35mm)의 (14mm, 0 번). 37 ºC에서 1 시간 동안 플레이트를 공기 - 건조 소거 마커 플레이트의 밑면에 흰색 polyL 라이신 막의 가장자리를 표시한다.
   참고 : polyL - 라이신 코팅 챔버는 일주일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다. 이전 코팅 챔버를 사용하는 경우, 초파리 절개를 시작하기 전에 실온으로 가져.
2. 샘플은 다음과 같이, 해부 및 장착 완료 후 즉시 이미징 될 수 있는지 확인하기 위해 공 초점 현미경 스캐닝 매개 변수를 설정합니다.
3. 하나의 해부 및 난소 조롱 (다음 2 단계와 5 단계에 따라 필요한 경우, 염색)을 표시 polyL - 라이신 코팅 된 지역에 배치하고 ovarioles를 분리하기 위해 놀리는 바늘로 난소를 확산. t을 포함해야하고, 난소의 상단에 곤충 해부 매체의 10 μL 드롭 배치그 전체 영역 polyL 라이신 코팅. 페트리 접시를 커버.
4. 즉시 실온에서 장착 시료의 공 초점 현미경을 수행한다.
   주 : 하나 초파리는 절개 가공하고, 동시에 촬상한다. 또한, 현미경은 초파리 조직에 대한 열 쇼크 환경을 모방 한 것이다 37 ℃에서 수행 될 것이다.

광표백 (FLIP) 분석 4. 형광 손실 미토콘드리아 매트릭스의 연속성을 평가하는

참고 : 융합 미토콘드리아 구조 미토콘드리아 매트릭스 연속성 중간 단계를 통해 진행을 다음과 미토콘드리아 내부 및 외부 세포막의 완전한 융합 후 설정됩니다. 미토콘드리아의 분열은 동일한 단계를 수행하지만, 반대 방향으로 (그림 3A) 할 수 있습니다. FLIP는 미토콘드리아 매트릭스 연속성을 평가하기 위해 사용될 수있는 타임 랩스 현미경 계 반 정량 방법라이브 초파리의 난소 ⁹ 생체 미토콘드리아의 최종 용융 상태 (그림 3a에 3, 4 단계). 플립 분석은 일정한 간격 (그림 3A에서 플립 ROI)에 광 퇴색되는 미토콘드리아 매트릭스에서 형광 분자를 발현하는 미토콘드리아의 관심 (ROI)의 작은 영역으로 수행된다. 그 결과, (그림 3A에서 실험 ROI) 플립 ROI 연속 어떤 주변 미토콘드리아 영역으로 인해 연속 미토콘드리아 매트릭스 분자의 교환에 신호를 잃게됩니다. 여기에 보여 플립 실험은 자유롭게 확산 형태로 미토콘드리아 매트릭스를 대상으로 YFP 태그 인간 시토크롬 산화 효소 VIII 서브 유닛의 미토콘드리아 타겟팅 시퀀스를 포함 mitoYFP를 발현하는 형질 전환 초파리에서 수행됩니다. 이전에보고 된 유사한 실험은 또한, 미토 pUASP 미토-GFP 형질 전환 유전자로 수행 될 수있다 ^{9. 유사한 FLIP 프로토콜은 외부의 융합에 기인하는 도통을 감지 할 수 있도록 미토콘드리아 층간 막 공간 표적 프로브로 이용 될 수 있지만,하지 내부 미토콘드리아 막 (도 3a의 단계 2).이}

1. 공 초점 현미경의 이미지 수집 소프트웨어를 열고 "취득"탭 (표 1)에서 적절한 검색 매개 변수를 설정합니다. 각각의 탭을 열고 "시간 시리즈", "표백"및 "지역"확인란을 선택합니다. 각 탭 (표 1)에 해당하는 획득 매개 변수 값을 넣는다.
   참고 :이 실험은 개별 셀의 전체 미토콘드리아 인구에서 전체 신호를 모니터하도록 설계로 핀홀이 개방되어야한다.
2. 신속하게 장착 살아있는 조직에서 관심있는 분야를 찾기 위해 접안 렌즈를 사용합니다.
   참고 : 잘 유리 bottome에 확산되는 ovarioles를 선택D 요리, 이후 공 초점 현미경 부동 ovarioles을 수행 할 수 없습니다.
3. "라이브"를 클릭하여 관심있는 선택한 필드의 라이브 영상을 획득한다. 클릭 라이브 검색을 중지하려면 "중지".
4. 필요하다면, 오프셋 값을 조정함으로써 설정 같이 정의 배경 (이하 "범위 표시기"옵션을 선택하면 적색 화소의 유무에 의해 표시된) 상기 검출 된 형광 신호는 포화 수준 이하가되도록 상기 취득 파라미터를 조정한다.
5. 라이브 스캔에 의해 획득 된 이미지에 광표백 영역을 구별하기 위해 "지역"탭에서 베 지어 그리기 도구를 사용하여 작은 투자 수익 (ROI)을 그립니다.
   참고 : ROI의 크기는 약 20해야 - 셀 내 총 형광 미토콘드리아 신호의 50 %.
6. 클릭하여 이미지 수집을 수행합니다 "실험을 시작합니다."
7. 자료를 참조하십시오 (형광 강도 독점 또는 오픈 소스 소프트웨어를 사용하여 정량화표). 반복 표백 대상으로 투자 수익 (ROI)에서 평균 신호 (FLIP)을 기록; 표백은 동일한 셀에서 실시되지 않은 로아 (실험); 보기 같은 분야의 다른 표백 세포에서 투자 수익 (ROI), 실험 기간 (표백) 동안 전체 표백을 평가; 백그라운드 영역 (백그라운드)의 ROI. 다른 로아의 평균 신호로부터 구한 평균 배경 신호를 뺀다. 각 셀에 대한 초기 사전 표백제 신호, 형광 신호를 정규화.
8. 플로팅 표준 소프트웨어를 사용하여 정규화 된 데이터를 플롯.

형광 미토콘드리아 염료 5. 라이브 염색

노트 : 정상 상태 미토콘드리아 구조 전위 특별히 생균 및 조직의 미토콘드리아에 통합 염료를 사용하여 평가 될 수있다. 라이브 초파리의 난소는 형광 미토콘드리아와 생체 염색 할 수있다얼룩 (미토 ROS) 생산 미토콘드리아 활성 산소 종을 평가하기 위해, 미토콘드리아를 시각화하고, 단위 질량 당 미토콘드리아 잠재력을 평가. 이것은 미토콘드리아 전위차 염료 테트라 메틸 에틸 에스테르 (TMRE)과 미토콘드리아의 질량을 나타내는 호환 라이브 미토콘드리아 얼룩 공동 염색에 의해 달성 될 수있다 (구체적인 염료 재료 표 참조).

1. 최종 작업 농도 매체를 해부 따뜻한 곤충의 얼룩의 주식 희석 : 미토콘드리아 얼룩, 250 nm의; TMRE, 50 nM의; 및 미토 ROS 얼룩, 5 μM.
2. 해부 및 2 단계 다음의 난소를 괴롭 히고 후, 해부 접시의 우물에서 특정 염색 액 200 μL에 난소를 놓습니다. 빛으로부터 보호하기 위해 알루미늄 호일로 싸서 적절한 상자에 의해 커버되는 접시 10 분 동안이를 부화. containin 3 연속 우물에 집게로 조심스럽게 이동하여 염색 난소을 씻으십시오얼룩없이 g 매체.
3. TMRE와 호환 전체 미토콘드리아 얼룩과 공동 염색의 경우, (그 사이의 모든 세척 단계없이) 전체 미토콘드리아 얼룩 즉시 첫 번째 TMRE와 다음 염색 할 수있는 위의 프로토콜을 따르십시오.
4. 다음하는 polyL - 라이신 코팅 유리 바닥 접시 다음과 같은 3 단계의 난소를 탑재하고 적절한 검색 매개 변수 (표 1)와 공 초점 현미경 준비는 4.2-4.4 단계를 반복합니다.
   주 : 매체를 장착에 스테인드 샘플을 장착 할 때 통합 된 염료로부터의 신호가 지속되지 않았다.
5. 탭을 열 수있는 Z-절편 확인란을 선택합니다. 이 라이브 스캔하는 동안 시료의 아래쪽을 향해 초점 휠을 돌려 맨 아래 Z-섹션을 정의하기 위해 "먼저 설정"을 클릭합니다. 최상위 부분을 정의하기 위해 다른 방향으로 포커스 휠을 이동하면서 동일한 기능을 수행.
6. 클릭하여 이미지 수집을 수행합니다 "실험을 시작합니다."
7. (단계 4.7에서와 같이) 배경 신호에 대한 ROI 영역 및 각 셀에서 백그라운드 보정 된 형광 강도를 정량화하는 묘화 소프트웨어를 사용하여 데이터를 플롯.

Drp1 널 모자이크의 6 세대

참고 : 여기에 사용 된 클론 전략은 Drp1 널 (null) 돌연변이 ⁹ 유전자형 이형 인 GFP 양성, 표현형 야생형 배경의 배경에 녹색 형광 단백질 (GFP) - 제외 어 Drp1 널 (null) 클론을 소개합니다. 열 충격에 의한 flippase - flippase 인식 대상 (FLP-FRT) - 매개 사이트 별 유사 분열 재조합는 기능적으로 널 drpKG03815 대립 유전자의 동형 접합 클론을 생성합니다. Drp1 돌연변이를 들고 초파리의 유전자형은 drpKG03815 FRT40A / CYO 인 열 충격에 의한 FLP (hsFLP) 및 UbiGFP 클론 마커 hsflp이다 운반 유전자형 반면, 유비퀴틴 NLS-GFP (UbiGFP) FRT의 40A / CYO. 선생의 유전자형위의 유전자형 사이의 십자가의 택된 자손 hsFLP / +입니다; drpKG03815 FRT40A / UbiGFPFRT40A.

1. 신선한 음식의 새로운 유리 병 매 2 ~ 3 일에 이동하여 처녀 수집을 위해 초파리를 동기화합니다. 신흥 처녀 암컷을 수집하기 위해 매일 pupariating 튜브를 모니터링합니다.
2. 저녁에 한번 아침에 한번, 매일 Drp1 돌연변이 유전자형에서 붉은 눈, 곱슬 날개 처녀 여성을 수집하고 별도의 유리 병에 배치합니다. 병렬로, 남성 초파리는 어두운 붉은 눈과 우화 5 일 이내에 hsflp 및 UbiGFP를 들고 직선 날개를 수집합니다.
3. (2) 남성 비율 : 여성과 처녀 암컷에 수컷을 추가하여 십자가를 설정 한.
4. 계란의 생산을 자극하는 과립 효모 소량 뿌린다.
   주 : 조심 자손의 양을 증가시키는 매 2 ~ 3 일 미디어의 새로운 바이알 초파리를 이동 바이알 밀집을 감소.
5. esthetize, 정렬 및 수집 직선 날개, 우화 5 일 이내에 빨간색 여성 자손.
6. 열 충격 (열 쇼크 동안 흡습) 닦아 부드러운 과립 효모 소량의 작은 빈 튜브에 수집 된 초파리를 배치했다. 주로 모낭 세포 클론을 생성하기 위해, 1 시간 동안 38 ºC에서 물을 욕조에 초파리와 유리 병을 놓고 두 번 1 시간 37 ºC 하루에 2 일 연속 (2 열 충격 사이에 적어도 5 시간을 허용) , 생식 세포와 모낭 세포 클론을 모두 생성합니다.
   참고 : 유리 병이 완전히 플러그의 수준으로 물 위로에 빠져들되어 있는지 확인합니다.
7. 열 충격은 초파리 움직이지를 할 수 있습니다. 그들은 다시 이동 될 때 열 충격 초파리 실온에서 1 시간 동안 회복 할 수있다.
8. 십자가에서와 동일한 비율로 여성에 다시 남성을 추가하고 mediu 신선한 튜브로 이동m은 과립 효모의 소량 뿌려. 적어도 5 일 동안 초파리를 유지한다.
9. 라이브 또는 고정 실험을 위해 필요에 따라 난소를 해부하다.
   참고 : 부모의 초파리 표현 UbiGFP에서 분리 된 난소는 열 충격에 의한 GFP 음성 클론의 효율적인 유도를 확인하기 위해 음성 대조군으로 사용되어야한다.

7. 사이클린 E와 미토콘드리아에 대한 공동-면역 염색

참고 : 초파리 사이클린 E (dCyclinE)를 검출하기 위해, 우리는 구체적으로 dCyclinE ^(9)에 대해 제기 시중에서 얻은 항체를 사용했다 (자료 표 참조). 미토콘드리아 마커로서, 우리는 ATP-B에 대한 항체 (미토콘드리아 ATP 합성 효소 복합체의 서브 유닛)를 ^구 사용.

1. 따뜻한 4 % 파라 포름 알데히드 실온 (PFA), 25 ° C. 주의! 파라 포름 알데히드는 독성이있다.
   참고 : 개방 후앰플은, PFA는 4 ° C에 저장하고 7 일 이내에 사용되어야한다. PFA 저장 극적 정착시 미토콘드리아 막을 변화시키는 메탄올을 산화 할 수 있기 때문에이 경우에도, 미량으로 존재한다.
2. 즉시 절개 후 (놀리는없이) 유리 해부 요리의 잘 신선한 PFA 200 μL에 배치하여 해부 난소를 해결. 15 분 동안 흄 후드에서 요리를 유지합니다. 3 연속 우물에 집게로 조심스럽게 이동 1X 인산염 완충 식염수 각각 포함 200 μL (PBS)에 의해 고정 난소을 씻으십시오.
   주 : 여기에서 실험을 중지 할 수 있고, 샘플을 1 일 4 ºC에서 방치 될 수있다.
3. 조심스럽게 항체에 의한 항원 액세스를 방해 할 수있는 보호 섬유 피복을 제거하기 위해 (비슷한 2.6 단계합니다) PBS에 더 철저 난소를 애타게.
4. 0 만든 갓의 500 μL와의 microfuge 튜브에 배치하여 조롱 난소를 Permeabilize 하시려면.25 rpm으로 흔들 동안 5 % PBS - 트리톤 - X100 (PBS-TX)와 30 분 동안 그것을 품어.
   참고 : 요동 동안, 튜브가 요동 운동에 평행하게 배치; 따라서 조직 손실의 결과로, 조직 관의 뚜껑에 충실 할 수있다 수직으로 그들을 배치.
5. PBS를-TX를 제거하려면 조직은 튜브의 바닥에 정착 할 수 있도록 랙에의 microfuge 튜브를 배치합니다. 필요한 경우 아래로 아래로 부동 조직을 가지고, 시각적으로 검사하고 튜브를 누릅니다. 관의 아래쪽의 조직이 흐트러 유지 확인한 위에서주의 용액 대기음.
6. 0.5 % TX-PBS에 용해 된 2 % 소 혈청 알부민의 200 μL (BSA)을 첨가하여 난소를 차단하고 실온에서 1 시간 동안 로커에 부화. 단계 7.5에 따라 차단 에이전트를 제거합니다.
7. 신선한 블로킹 제 200 μL에 일차 항체를 추가 항 - 토끼 dCyclinE 항체 (1 : 100) 및 항 - 마우스 ATP-B 항체(1 : 100). 실온에서 2 시간 동안 로커의 조직을 인큐베이션.
8. 단계 7.5 다음, 15 분 각각 PBS-TX로 3 회 난소을 씻으십시오.
9. 신선한 PBS-TX의 적절한 이차 항체의 200 μL를 추가 항 - 마우스 - CY3 (1 : 1000) 및 항 - 토끼 - CY5 (1 : 500). 실온에서 1 시간 동안 로커에서 인큐베이션.
10. 단계 7.5 다음, 15 분 각각 PBS-TX로 3 회 난소을 씻으십시오.
11. 최종 PBS-TX 세척 행 (1,000 희석 1) DNA를 염색하기, 훽스트 (Hoechst)를 추가합니다.
12. 마지막으로, 1X PBS 500 μL에 조직을 둡니다.
13. 1 mL의 마이크로 피펫을 사용하여 PBS 200 μL를 포함하는 유리 접시 해부 신선한 웰에 미세 원심 분리 튜브로부터의 면역 염색의 난소를 제거한다.
14. 유리 슬라이드에 글리세롤 기반 설치 매체의 한 방울을 추가하고 설치 매체에 하나를 사용하여 면역 염색 난소 하나를 추가합니다.
    참고 : 난소가 실제로 설치 매체에 전송되어 있는지 확인하십시오. 의 작업을 수행 실패오 조직의 손실로 이어질 것입니다.
15. 해부 현미경을 통해 찾고 있지만, 부드럽게 집게로 난소의 불투명 한 부분을 누른 상태에서 괴롭 히고 바늘을 사용하여 불투명 성숙한 계란 챔버에서 투명 ovarioles (이하 단계)을 뽑아. 설치 매체에서 성숙한 난자 챔버를 제거합니다.
16. 설치 매체가 균일하게 아래에 확산 될 수 있도록 슬라이드 가볍게 누르십시오에 커브 글라스 (22mm, 1 위)을 놓습니다.
    주 : 커브 글라스에 누르면 또한 커브 글라스 따라 조직의 적절한 정렬을 보장합니다. 그래서 최적의 수행 실패하면 그 조직의 최적의 현미경을 방지, 작은 단계는 설치 매체에 부유 할 수있다.
17. 15 분 동안 샘플을 공기 - 건조 조심스럽게 매니큐어와 커브 글라스의 가장자리를 밀봉.
18. 실험의 필요성 (표 1)에 따라 공 초점 현미경을 수행합니다.

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결과

설명 된 방법은 실시간 고정 초파리 난소 (도 2B)에서 미토콘드리아의 구조 및 기능을 연구하는데 사용될 수있다. 기술 된 방법으로 얻은 예상 결과의 예이 개시된다.

초파리 난소 절제술 : 상기 해부하면 전체 초파리 (도 3A)에서 절단 복부 (도 3b)은 각각의 초?...

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토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

광표백 : 형광 샘플의 과도한 광표백을 방지하는 효율적인 공 초점 현미경을 수행에 절대적으로 필요하다. 따라서 접안 렌즈를 통해 샘플을 찾기 위해 또는 라이브 스캐닝 모드를 통해 영상 획득 파라미터를 설정하는 데 사용되는 시간은 광표백을 최소화하기 위해 최소화되어야한다.

조직 손상 : 미토콘?...

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Grace's Media (Insect Dissecting Medium)	Fisher Scientific	30611031-2
41 Paraformaldehyde AQ	Electronic Microscopy Sciences	50-259-99
Mitotracker Green (overall mitochondrial stain)	Life Technologies	m7514	Reconstitute and Aliquot
Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate	Sigma Aldrich	87917-25MG	Reconstitute and Aliquot
MitoSox (Mito-Ros stain)	Life Technologies	m36008	Reconstitute and Aliquot
PolyLysine	MP Biomedicals	ICN15017625
Fly Vials	Fisher Scientific	AS-515
Fly Conicals	Fisher Scientific	AS-355
Fly Vial Flugs	Fisher Scientific	AS273
Fly Conical Flugs	Fisher Scientific	AS 277
Jazzmix Drosophila food (Drosophila food)	Fisher Scientific	AS153
Bovine Serum Albumin	Sigma Aldrich	A9647-50G
Cyclin E Antibody (d-300)	Santa Cruz	sc- 33748
ATPB antibody [3D5] - Mitochondrial Marker	AbCam	ab14730
Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-165-146
Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	111-175-144
Hoechst	Fisher Scientific	H3570
VectaShield	Fisher Scientific	H100
Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides	Fisher Scientific	22-026-252
Microscope Cover Glass	Fisher Scientific	12-542-B
Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish	Fisher Scientific	P35G-0-14-C
Active Dried Yeast	Fisher Scientific	ICN10140001
Confocal Microscope	Carl Zeiss	LSM 700
Dumont #5 Forceps	Fine Science Technologies	11251-20
Moria Nickel Plated Pin Holder	Fine Science Technologies	26016-12
Minutien Pins	Fine Science Technologies	26002-15
MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 )	Bloomington Stock Center	7194
Fly Pad	Fly stuff	59-118
Blowgun	Fly stuff	54-104
Blowgun needle	Flystuff	54-119
Dissecting Microscope	Carl Zeiss	Stemi 2000
Analyses software	Carl Zeiss	Zen
Analyses software	Open source	Image J
Research Macro Zoom Microscope	Olympus	MVX10
QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono	QImaging	QIC-F-M-12-C
QCapture Pro 5.1	QImaging