Transplante de islotes en el cojín de grasa epididimal de ratones diabéticos

Resumen

Este protocolo demuestra el aislamiento de los islotes murinos y la siembra en un andamio decelularizado. Los islotes soportados por el andamio fueron trasplantados en la almohadilla de grasa epididimal de ratones diabéticos inducidos por estreptozotocina (STZ). Los islotes sobrevivieron en el sitio del trasplante e invirtieron la condición hiperglucémica.

Resumen

El trasplante de islotes ha demostrado clínicamente ser eficaz en el tratamiento de la diabetes tipo 1. Sin embargo, la actual estrategia de trasplante intrahepático puede incurrir en reacciones agudas de sangre entera y resultar en inseminación de islotes pobres. En este trabajo se presenta un protocolo robusto para el trasplante de islotes en el sitio de trasplante extrahepático -la almohadilla de grasa epididimal (EFP) - en un modelo de ratón diabético. Se describe un protocolo para aislar y purificar islotes con altos rendimientos de ratones C57BL / 6J, así como un método de trasplante realizado mediante la siembra de islotes sobre un andamio decelularizado (DCS) y su implantación en el sitio EFP en ratones C57BL / 6J singénicos rendidos diabéticos Por la estreptozotocina. El injerto DCS que contenía 500 islotes invirtió la condición hiperglucémica en 10 días, mientras que los islotes libres sin DCS requirieron al menos 30 días. La normoglucemia se mantuvo hasta 3 meses hasta que se explantó el injerto. En conclusión, DCS mejoró el injerto de islotes en tEl sitio extrahepático de la EFP, que podría ser fácilmente recuperado y podría proporcionar una plataforma reproducible y útil para investigar los materiales del andamio, así como otros parámetros de trasplante requeridos para un inseminación exitosa de islotes.

Introducción

La diabetes mellitus tipo 1 (T1D) es un trastorno endocrino autoinmune en el que las células de los islotes son ablacionadas por el sistema inmunitario, haciendo que los pacientes dependan de la inyección de insulina exógena durante toda su vida. El protocolo de Edmonton representa un hito en los estudios clínicos del trasplante de islotes; Los islotes fueron infundidos a través de la vena porta y trasplantados en el sitio intrahepático [ ^1] . Sin embargo, dos obstáculos principales-fuentes inadecuadas de islotes donantes y insectos de islotes pobres-impiden el gran éxito del trasplante de islotes ² . Por lo general, los islotes necesitan ser recogidos de tres donantes cadáveres para revertir la condición hiperglucémica de un paciente; Esto se debe al bajo rendimiento de los procedimientos de aislamiento de islotes ya la pérdida de islotes tras el trasplante. En particular, aunque los islotes posteriores al trasplante se bañaban en sangre rica en oxígeno, el contacto directo con la sangre evocaba a menudo la inflamación mediada por la sangre instantánea(IBMIR), que podría causar la pérdida aguda de los islotes. A largo plazo, se piensa que la pérdida gradual de islotes en los pacientes explicó la caída de las tasas de reversión de la diabetes en los grupos clínicos, que podría llegar al 90% en el primer año y disminuir a 30% y 10% a 2 y 5 Años después del trasplante, respectivamente ³ .

El trasplante de islote en los sitios extrahepáticos ha sido una estrategia atractiva para reducir el contacto directo de los islotes con la sangre mientras se confina los trasplantes a lugares más definibles en comparación con la infusión intrahepática. Se han realizado estudios en la cápsula renal, ojos, músculos, almohadillas de grasa y espacios subcutáneos en los últimos años, mostrando que los islotes en estos sitios son capaces de sobrevivir y funcionan para restaurar la normoglucemia ⁴ . Además, los islotes en estos sitios son recuperables, lo que hace posible la biopsia o incluso para procedimientos de reemplazo adicionales. ExtrahepáticoItes por lo tanto, muestran un gran potencial para el trasplante clínico [ ^5] .

Los andamios basados ​​en biomateriales han sido intensamente investigados para el trasplante de células y la ingeniería de tejidos. Los andamios tridimensionales (3D) generalmente contienen estructuras porosas y pueden servir como plantillas celulares para generar estructura espacial / organización de células o como reservorios para proporcionar la liberación controlada de señales bioactivas. Los andamios también se han fabricado a partir de materiales poliméricos, tales como poli (glicolida-L-lactida) ⁶ , poli (dimetilsiloxano) ⁷ y poli (uretano) termoplástico ⁸ , para transplantar islotes en la EFP. En comparación con el trasplante directo de islotes, se encontró que el uso de andamios reduce la pérdida de islotes al prevenir la fuga de islotes en la cavidad intraperitoneal ^{9 , 10} , proporcionando protección mecánica y moduLa reacción inflamatoria local. Los andamios pueden así desarrollarse para promover el injerto de islotes en los sitios de trasplante ⁷ .

En este estudio, pretendemos demostrar un paradigma de trasplante de islotes en la EFP, llevado a cabo en modelos de ratones utilizando un DCS. Los andamios derivados de matrices extracelulares han atraído gran interés en los últimos años debido a la biocompatibilidad superior ya estructuras naturales porosas más comparadas con productos sintéticos. Aquí, describimos un robusto protocolo de aislamiento para obtener los islotes pancreáticos con altos rendimientos de ratones C57BL / 6J. Los DCSs procesados ​​a partir del pericardio bovino fueron entonces sembrados con islotes, y los injertos fueron trasplantados a la EFP en modelos diabéticos singénicos. La normoglucemia en ratones se logró en 10 días y se mantuvo hasta 100 días, hasta la eliminación de los injertos.

Protocolo

Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pekín (IACUC, IACUC no COE-LuoY-1).

1. Aislamiento de islotes

1. Preparación de reactivos y equipos.
   1. Reconstituir colagenasa P en polvo (2 U / mg) en HBSS para hacer una solución de 5 mg / mL y filtrar a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las bacterias. Preparar soluciones alícuotas de 0,6 ml de colagenasa P en tubos cónicos de 15 ml y almacenar a -20 ° C.
      NOTA: Durante el uso, cada alícuota se diluye con HBSS para dar soluciones de trabajo de 6 ml con concentraciones finales de 0,5 mg / ml, o 1 U / ml (suficiente para tratar 3 ratones). La solución de trabajo se mantiene en hielo para su uso inmediato en 1 h. La solución de trabajo no se debe restaurar o volver a congelar para uso adicional.
   2. Preparar la solución de neutralización añadiendo FBS (2,5%) y P / S (1%) en HBSS; Mantener la solución sobre hielo. Preparar 60 ml de solución de neutralización a treaT 6.
   3. Para el medio de cultivo de islotes, añadir D-glucosa (7 mM), FBS (10%) y P / S (1%) a medio RPMI 1640.
   4. Autoclave los instrumentos quirúrgicos a 115 ° C durante 30 min y 15 psi de presión.
2. Inflación del páncreas.
   1. Preparar 12 ml de solución de trabajo de colagenasa, como se especifica en el paso 1.1.1, para 6 ratones (12 semanas de edad). Llene la jeringa de 10 ml con 9 ml de solución de trabajo y conecte la jeringa a la aguja intravenosa de 27 G. Guarde la jeringa en hielo y utilice la solución en 1 h.
   2. Eutanasia del ratón por dislocación cervical. Coloque el ratón en posición supina sobre una toalla de papel, con la cola apuntando hacia el operador. Rocíe el cuerpo entero con etanol al 70%, haciéndolo completamente mojado.
   3. Haga una incisión en V, comenzando desde el área genital y extendiéndose hasta el diafragma, usando tijeras de disección y fórceps. Doble la piel sobre el pecho para revelar completamente la cavidad abdominal.
   4. MovimientoEl intestino al lado derecho del ratón y exponer el páncreas y el conducto biliar común. Coge el duodeno cuidadosamente con pinzas y tire de él hasta que el conducto biliar esté tenso ( Figura 1A -1 y A-2 ).
   5. Encuentre la vena porta y el conducto biliar que conduce al hígado. Sujete la vena porta y el conducto biliar con una pinza hemostática microscópica.
      NOTA: La sujeción previene el sangrado excesivo y la entrada de la colagenasa en el hígado.
   6. Mientras todavía mantiene el intestino con la pinza, encontrar la ubicación de la ampolla que conecta el conducto biliar y el duodeno. Insertar la aguja intravenosa 27G en el conducto biliar común a través de la ampolla ( Figura 1B -1 y B-2 ).
   7. Dispensar unos 200 μl de colagenasa solución de trabajo para comprobar si la canulación es todo el camino a través del conducto biliar. Si la solución de colagenasa comienza a llenar el conducto ( 1 y C2 ), la aguja está en el lumen del conducto; Sujetar el segmento del conducto que contiene la aguja usando una pinza hemostática de la arteria y dispensar el resto de los 2 ml de solución a una velocidad lenta y constante dentro de 1 minuto ( Figura 2A -1 , A-2 y B-1 ).
      NOTA: Si el tejido que rodea el conducto comienza a inflar ( Figura 2B- 2 ), la aguja ha atravesado la pared del conducto biliar, haciendo necesario volver a colocar la aguja e intentar volver a canular el conducto biliar. De manera similar, si el duodeno comienza a inflar ( Figura 2C -1 y C-2 ), la pinza hemostática de la arteria necesita ser ajustada y el conducto biliar puede volver a canularse. A medida que la solución de colagenasa llena el páncreas, el tejido cerca del duodeno se infla primero, seguido por el regioN cerca de la cola pancreática. La perfusión de la cola pancreática (el lóbulo esplénico) es importante para maximizar el rendimiento del islote.
   8. Después del inflado completo del páncreas ( Figura 2C -1 ), empuje el intestino hacia el lado izquierdo del ratón y retire el páncreas comenzando en el colon descendente. Use la pinza para levantar el intestino y separarla del páncreas con otro par de pinzas. Continúe quitando el páncreas hasta que no quede suelto de la parte superior del estómago. Finalmente, levante el páncreas fuera del abdomen y corte libre del bazo restante.
      NOTA: La separación completa debe realizarse rápidamente, ya que la digestión continúa durante el proceso de extracción.
   9. Coloque el páncreas en un tubo cónico vacío de 15 mL y déjelo sobre hielo. Repita el procedimiento anterior para los ratones restantes. Todos los páncreas deben procesarse en 1 h siguiendo el paso 1.3 para evitar la sobre-digestión de la colagenasa P.

   
   Figura 1: Fotografías que muestran la canulación del conducto biliar y la perfusión del páncreas con soluciones de colagenasa. ( A1 ) Tirar del duodeno hasta que el conducto biliar esté tenso. (Ampolla: el área triangular, lechosa en la superficie del duodeno, conducto biliar: la estructura lechosa similar a la cuerda en la superficie). ( B1 ) Inserción de la aguja en el conducto biliar de la ampolla. ( C1 ) Inflación del páncreas con la inyección de enzima. ( A2, B2 y C2 ) Imágenes de dibujos animados de los procedimientos mostrados en A1, B1 y C1, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

   
   Figura 2: Solución de problemas para la canulación. ( A1 ) La punta de la aguja se inserta en el lumen del conducto biliar. ( A2 ) El conducto se llena de soluciones enzimáticas. ( B1 ) La aguja se inserta en el lumen del conducto biliar y el conducto se llena con un colorante azul. ( B2 ) Debido a una canulación inapropiada, la aguja se encuentra por debajo del conducto biliar y sólo se observa una cápsula inflada después de dispensar el colorante azul. ( C1 ) Una canulación exitosa se evidencia por la distensión del páncreas. ( C2 ) Debido al pinzamiento inapropiado, el colorante azul entra en el duodeno y causa distensión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

   3. Digestión y purificación de islotes.
      1. Incubar los tubos cónicos que contienen el páncreas perfundido a 37 ° C durante 17 min.
         NOTA: El tiempo de incubación puede variar con la edad y las especies del animal.
      2. Terminar la digestión añadiendo 7 ml de solución de neutralización y poner los tubos en hielo.
      3. Disociar el tejido agitando vigorosamente los tubos ( por ejemplo, 20 veces en 10 s) hasta que se obtienen partículas finas de tejido.
         NOTA: El rendimiento del islote será bajo si el páncreas no se disocia completamente.
      4. Filtrar las muestras de tejido digerido a través de malla de alambre de 0,5 mm para eliminar cualquier trozo de tejido no digerido. Recoja las suspensiones de los islotes en un nuevo tubo cónico de 50 ml.
      5. Centrifugar los tubos durante 3 min a 230 xg y 4 ° C y verter el sobrenadante cuidadosamente, sin alterar los gránulos de tejido.
      6. Resuspender los sedimentos de 3 ratones en 4 ml de gradiente de densidad de polisacáridos agitando vórtex suavemente o pIpetting la suspensión arriba y abajo unas cuantas veces. Lentamente pipetee 4 mL de HBSS por el lado del tubo hasta la parte superior de las soluciones de polisacáridos.
         NOTA: Las dos soluciones deben ser capas bien separadas con una interfaz nítida.
         NOTA: La adición de HBSS debe realizarse con cuidado, sin alterar el gradiente de densidad de polisacáridos en la parte inferior.
      7. Centrifugar la suspensión durante 20 min a 900 xg y 4 ° C seleccionando una velocidad de aceleración muy lenta. Termine la centrifugación sin freno.
         NOTA: Este es un paso para purificar los islotes de las células exocrinas, con la mayoría de los islotes migrando a la interfaz entre las capas de polisacárrea y HBSS y la mayoría de las células exocrinas se asientan en el fondo.
      8. Retire la totalidad de las soluciones sobrenadantes de 8 mL usando una pipeta de 15 mL de gran calibre. Pase las soluciones a través de un colador invertido de 70 μm.
         NOTA: Los islotes serán purificados y retenidos por el colador, mientras que las células exocrinasPasará a través del filtro.
         Precaución: El gradiente de densidad polysucorse es tóxico para las células; La filtración ayudará a los islotes a deshacerse de la polisacáridos.
      9. Pipetee 2 ml de solución de neutralización fría en una placa de Petri de 35 mm. Invertir el colador de la celda con el lado derecho hacia arriba, sumergir la superficie reteniendo los islotes en la solución y agitar suavemente para liberar los islotes.
      10. Recoger manualmente los islotes bajo un microscopio usando una pipeta de 20 μl con una punta blanca.
          NOTA: Los islotes son agregados de células compactos amarillentos ( Figura 3A ), mientras que el tejido o células exocrinas contaminantes tienen una estructura negruzca y suelta bajo el microscopio de disección.
      11. Colocar alrededor de 200 islotes en un plato de 35 mm con 2 ml de medio de cultivo e incubar a 37 ° C en un incubador suministrado con 5% de CO ₂ durante 12 h.
          NOTA: Normalmente se pueden cosechar 150-300 islotes de un ratón C57BL / 6J de 12 semanas de edad. Los islotes son propensos a formar agregados durante el cultivo,Y los grandes islotes (> 300 μm) son susceptibles a necrosis central ( Figura 1B , inserto). Agite bien la suspensión para distribuir uniformemente los islotes en el plato y reducir el aglomerado.

   2. Cultivo de islotes en el andamio

   NOTA: DCS tiene una porosidad de aproximadamente 79%, un espesor de aproximadamente 0,6 mm y un tamaño de poro que varía de 12 a 300 μm.

   1. Cortar los andamios en discos de 7 mm, empaparlos en etanol al 70% y lavarlos con HBSS. Coloque los andamios en los insertos de cultivo de tejidos de 24 pocillos.
      NOTA: Cuando los islotes frescos se recuperan después de un cultivo durante la noche, los islotes aparecen brillantes y apretados, con bordes lisos ( Figura 3B ).
   2. Remueva el plato y recoja los islotes del centro del plato usando una pipeta de 20 μl con una punta blanca. Transferir los islotes a los andamios (250 islotes / andamio) usando una pipeta y agregar 2 ml de medio de cultivo ael pozo. Cultivo de los islotes durante 12 h antes del trasplante.

   3. Transplante de islotes en el sitio EFP

   1. Inducción de la diabetes en ratones receptores.
      1. Coloque los ratones C57BL / 6J (más de 10 semanas de edad) en una jaula fresca con un suministro de agua, pero sin alimentos. Ayuno de los ratones durante 10 h antes de la inducción de la diabetes.
      2. Preparar soluciones tampón con valores de pH de 4,2-4,5 mezclando ácido cítrico 0,1 M con citrato sódico 0,1 M. Disolver STZ (10 mg / ml) en el tampón recién preparado y esterilizar la solución pasándola a través de un filtro de 0,22 μm.
         NOTA: STZ es sensible a la luz y pierde actividad en 10 minutos; Siempre prepare la solución STZ fresca justo antes de la inyección.
      3. Inyectar cada ratón intraperitonealmente con STZ a una dosis de 140-150 mg / kg por cada ratón C57BL / 6J.
         NOTA: La dosis varía dependiendo de la edad y las especies del animal. Se recomienda realizar una optimización de la dosis a pequeña escala teSt para la especie dada antes de iniciar el experimento formal.
      4. Recoger la sangre de la vena de la cola y controlar la glucosa en la sangre con un medidor de glucosa en los días 2, 3 y 4 post-STZ inyección.
         NOTA: Cuando los animales son hiperglucémicos (glucosa en sangre sin ayuno> 16,7 mM) en dos días consecutivos, están listos para el trasplante de islotes.
   2. Transplante de islotes al sitio EFP.
      1. Anestesiar los ratones con pentobarbital administrado intraperitonealmente (50 mg / kg). Coloque el ratón en posición supina sobre una toalla de papel, con la cola apuntando hacia el operador. Afeitar el abdomen extensivamente para quitar la piel de alrededor del sitio de la incisión. Tape las cuatro extremidades y limpie la piel completamente con toallitas alternas de alcohol y yodóforo moviéndose de manera circular para esterilizar el sitio de la incisión. Cubra el ratón con un paño estéril, permitiendo sólo el acceso a la zona de la incisión. Haga una incisión de 7 mm a través de la pared peritonealLínea media, cerca de la zona genital.
         NOTA: Todos los instrumentos utilizados durante la cirugía, incluidos los guantes, deben ser estériles.
      2. Agarre suavemente y retire el EFP de la cavidad abdominal usando fórceps. Esparza el EFP sobre una gasa estéril húmeda. Coloque el andamio que contiene islotes en el EFP y dobla el EFP para envolver el trasplante. Asegurar el contacto directo entre los islotes y el EFP suturando el EFP con suturas absorbibles de 6-0. Humedezca la superficie del EFP con solución salina estéril usando un hisopo de algodón empapado para evitar que el EFP se seque.
      3. Coloque suavemente el EFP en la cavidad abdominal. Cierre la incisión suturando la pared peritoneal y sujetando la capa dérmica con clips de herida.
      4. Inyectar buprenorfina (0.1 mg / kg) por vía subcutánea como analgésico.
      5. Inyectar 1 mL de solución salina por vía subcutánea para prevenir la deshidratación.
      6. Coloque el ratón en una jaula en una almohadilla de calefacción hasta que el ratón se recupera de la anestesia.
      7. Compruebe la glucosa sin ayunoDos días después recogiendo sangre de la vena de la cola. Si recupera el injerto, repita los procedimientos de trasplante anteriores, retire suavemente la EFP, use sutura 3-0 para ligar el extremo de la almohadilla de grasa adyacente al epidídimo, obstruya los vasos sanguíneos, explante el injerto de EFP y consérvelo para histología .
         NOTA: Explantar los islotes debe volver a rendir a los ratones receptores hiperglucémicos de nuevo dentro de 3 días, confirmando la función del injerto.

Resultados

Nuestro método de sujeción, realizado con una pinza hemostática microscópica, es sencillo y ahorra tiempo en comparación con la técnica de ligadura de sutura. Se tomó aproximadamente 4 h para aislar y purificar alrededor de 1.200 islotes de 6 ratones. Los islotes recién aislados tenían típicamente una periferia rugosa bajo un microscopio óptico ( Figura 3A ). Una vez que los islotes se recuperaron del proceso de aislamiento, parecían brillantes y...

Discusión

La perfusión del páncreas y el tiempo de digestión son dos parámetros clave que afectan el rendimiento y la calidad de los islotes. Moskalewski informó por primera vez el uso de una mezcla de colagenasa cruda para digerir el páncreas ^de conejillo de indias picada [ ^11] . Lacy et al. Informó la inyección de enzimas en el sistema de conductos para perfundir el páncreas, lo que aumentó considerablemente el rendimiento de islotes [ ^12]

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissor	Ningbo Medical
Forceps	Ningbo Medical
0.5 mm diameter wire mesh	Ningbo Medical
70 μm cell strainer	Falcon	352350
Artery hemostatic clamp	Ningbo Medical
Microscopic hemostatic clamp	Ningbo Medical
Hemostatic forceps	Ningbo Medical
Absorbable 6-0 PGLA sutures	JINHUAN		With needle
Wound clip	Ningbo Medical
Cotton swab	Ningbo Medical
Gauze	Ningbo Medical
Sterile drapes	Ningbo Medical
10mL syringe	JINGHUAN
1 mL syringe	JINGHUAN
27G intravenous needle	JINGHUAN	0.45x15 RWSB
1.5 mL Eppendorf tube	Axygen
15mL conical tube	Corning	430791
50mL conical tube	Corning	430829
35mm Non-treated  Peri-dishes	Corning	430588
Transwell	Corning	3422
0.22 μm filter	Pall	PN4612
10 mL serological pipet	Corning	4488
Pipet filler S1	Thermo Scientific	9501
Pipette (2-20μL)	Axygen	AP-20	AXYPETTM
Dissecting microscope	Olympus	SZ61
Centrifuge	Eppendorf	5810R
Hank’s balanced salt solution	Gibco	C14175500CP
Collagenase P	Roche	COLLP-RO
Histopaque 1077	Sigma	10771
RPMI 1640	Gibco	11879-20
FBS	Gibco	16000-044
D-glucose	Gibco	A24940-01
Glucose meter	Roche		ACCU-CHEK
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Streptozotocin	Sigma	V900890	VetecTM
Chloral hydrate	J&K	C0073
Sodium citrate	Sigma	71497
Citric acid	Sigma	C2404
Iodophors	Ningbo Medical
C57BL/6J, 10-12 weeks old	VitalRiver		Beijing, China
Decellularized scaffold	Guanhao Biotec	131102	Guangzhou, China