Pluripotentes células madre derivadas de células cardiacas para la reparación del miocardio

Resumen

Presentamos tres protocolos nuevos y más eficientes para la diferenciación de células madre pluripotentes inducidos por el hombre en cardiomiocitos, células endoteliales, y células del músculo liso y un método de entrega que permite mejorar el injerto de las células transplantadas mediante la combinación de la inyección de células con la entrega de citoquinas parche mediada.

Resumen

Las células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) deben estar completamente diferenciadas en tipos específicos de células antes de la administración, pero los protocolos convencionales para diferenciar hiPSCs en cardiomiocitos (hiPSC-CM), células endoteliales (hiPSC-ECS), y células musculares lisas (CML) son a menudo limitado por bajo rendimiento, la pureza, y / o una pobre estabilidad fenotípica. A continuación, presentamos nuevos protocolos para la generación de hiPSC-CM, -ECs y -SMCs que son sustancialmente más eficiente que los métodos convencionales, así como un método para la combinación de la inyección de células con un parche que contiene citoquinas creado sobre el sitio de administración. El parche mejora tanto la retención de las células inyectadas, sellando el trayecto de la aguja para evitar que las células de ser exprimido hacia fuera del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período prolongado. En un modelo porcino de la lesión por isquemia-reperfusión del miocardio, la tasa de injerto era más de dos veces mayor cuando lalas células se administraron con el parche que contiene citoquinas en comparación con las células sin parche, y el tratamiento tanto con las células y el parche, pero no con las células solas, se asoció con una mejora significativa en la función cardíaca y el tamaño del infarto.

Introducción

células madre pluripotentes inducidas (hiPSCs) están entre los agentes más prometedores para la terapia de células regenerativas, ya que pueden ser diferenciadas en una gama potencialmente ilimitado y la cantidad de células que no son rechazadas por el sistema inmune del paciente. Sin embargo, su capacidad de auto-replicación y diferenciación también puede conducir a la formación de tumores y, en consecuencia, hiPSCs necesitar ser totalmente diferenciado en tipos celulares específicos, tales como los cardiomiocitos (CMS), las células endoteliales (EC), y células de músculo liso (SMCs ), antes de la administración. Uno de los métodos más simples y más comunes de administración de las células es la inyección intramiocárdica directa, pero el número de células trasplantadas que se injerta el tejido miocárdico nativa es excepcionalmente bajo. Gran parte de este desgaste se puede atribuir al medio ambiente citotóxica del tejido isquémico; sin embargo, cuando eran células madre embrionarias murinas (CES) inyectados directamente en el miocardio del corazón no lesionados, oólo ~ 40% de los 5 millones de células entregadas fueron retenidas para 3-5 hr ^1, lo que sugiere que una proporción sustancial de las células administradas salió del sitio de administración, tal vez porque se exprimen a través del trayecto de la aguja por las altas presiones que se producen durante contracción del miocardio.

A continuación, presentamos los métodos novedosos y sustancialmente más eficientes para la generación de cardiomiocitos derivados de hiPSC (hiPSC-CM) ^2, las células endoteliales (hiPSC-ECS) ^3, y las células musculares lisas (CML) ^4. En particular, este protocolo hiPSC-SMC es la primera para imitar la amplia gama de características morfológicas y funcionales observados en somático SMCs ⁵ por la dirección de las células hacia un fenotipo predominantemente SMC sintético o contráctil. También proporcionamos un método de suministro de células que mejora la tasa de injerto de las células inyectadas por la creación de una que contiene citoquinas fibrina patch sobre el sitio de inyección. El parche parece mejorar tanto la retención de células, mediante el sellado del trayecto de la aguja para evitar que las células salgan del miocardio, y la supervivencia celular, mediante la liberación de factor de crecimiento similar a la insulina (IGF) durante un período de al menos tres días.

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las Directrices de Animales de la Universidad de Alabama en Birmingham.

1. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CM

1. Escudo los pocillos de una placa de 6 pocillos con una reducción del factor de crecimiento pre-enfriado mezcla de proteína gelatinosa a 4 ° C durante la noche. Aspirar la mezcla de proteína gelatinosa antes de su uso. Sembrar las hiPSCs sobre las placas pre-recubiertas, y cultivar las células (1 x 10 ⁵ células por pocillo) en 5% de _CO2 y 37 ° C en mTeSR1 suplemento de medio con el inhibidor de Rock 10 mM.
2. Refrescar el medio todos los días hasta que las células alcanzan el 90% de confluencia; a continuación, añadir la reducción del factor de crecimiento mezcla de proteína gelatinosa al medio (0,5 mg mezcla gelatinosa proteína por placa de 6 pocillos, 2 ml de medio por pocillo), y cultivar las células durante 5% de _CO2 y 37 ° C dos días más.
   1. Para reemplazar el medio, con cuidado aspirar el medio de la placa de Petri con medio de vacíofuera de tocar las células, y añadir nuevo medio utilizando una pipeta de transferencia.
3. Iniciar la diferenciación mediante la sustitución del medio con medio RPMI1640 suplementado con factor de crecimiento reducido mezcla de proteína gelatinosa, B27 sin insulina, y 100 ng / ml de activina A; cultivar las células en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 24 horas.
4. Reemplazar el medio con medio RPMI1640 que ha sido suplementado con B27 sin insulina, 10 ng / ml de proteína morfogénica ósea 4 (BMP-4), y 10 factor de ng / ml de crecimiento fibroblástico básico (bFGF); cultivar las células en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 96 horas.
5. Reemplazar el medio con medio RPMI1640 suplementado con B27 y continuar cultivar las células en 5% de _CO2 y 37 ° C; refrescar el medio cada 3 días.
6. Observe grupos de células bajo el microscopio contraer ~ 3 días después de iniciar la diferenciación. Recoge los grupos ~ 7 días después de observar primero las contracciones y lavarlos en solución salina equilibrada de Hanks.
   1. Disociar las células agrupadas en la placa mediante su incubación en tampón de Hanks que contiene 100 U / ml de colagenasa IV durante 10 min a 37 ºC con agitación suave; a continuación, añadir 0,25% de tripsina en ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) durante 5 min.
   2. Neutralizar la solución de enzima con suero bovino fetal al 10% en medio RPMI / B27 y luego volver a suspender las células en medio / B27 RPMI.
   3. Contar el número de células mediante un hemocitómetro. Cultivar las células en placas de 10 cm en 5% de _CO2 y 37 ° C durante al menos 3 horas, lo que permitirá que las células no cardiomiocitos a que se adhieran a la superficie de la placa de cultivo.
7. Recoger la suspensión celular, que contiene el hiPSC-CM, y mantener las células (alrededor de 1 x 10 ⁶ células por placa de 10 cm) mediante el cultivo en una superficie recubierta mezcla de proteína gelatinosa.

2. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-EC

1. Disociar la población hiPSC en células individuales mediante la incubación de THem con el agente quelante en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 5 min. Transferir las células a un tubo de centrífuga de 15 ml que contenía medio mTeSR1 fresco.
2. Centrifugar las células a 200 xg durante 5 min. Resuspender las células en medio mTeSR1 suplementado con inhibidor de Rock 10 mM. Determinar la densidad celular con un hemocitómetro.
3. Añadir 250 l de solución de trombina de 20 unidades NIH / ml a un pocillo de una placa de 24 pocillos.
4. Añadir 1 x 10 ⁶ hiPSCs a 250 l de una solución de fibrinógeno 12,5 mg / ml. Y añadir los 250 l de solución de fibrinógeno que contiene células de la trombina-cargado también. Observe que la mezcla se solidifique para formar una matriz de fibrina que contiene hiPSC-dentro min.
5. La transferencia de los, andamios que contienen células solidificados en los pocillos de una placa de 6 pocillos con las pinzas de vidrio de cubierta, e iniciar la diferenciación mediante el cultivo de los andamios en 2 ml de medio EBM2 suplementado con 2% B27 sin insulina, activina-A (50 ng / ml), y BMP-4 (25 ng / ml) durante 24 horas a 5% de CO 2 y 37 ° C.
   1. Vuelva a colocar suavemente el medio por aspiración de la media de edad a través del vacío sin tocar las células. Añadir nuevo medio EBM2 suplementado con B27 sin insulina, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF, 50 ng / ml), eritropoyetina (EPO, 100 ng / ml), y la transformación de β1 de factores de crecimiento (TGFß1, 10 ng / ml), y la cultura de la andamios en 5% de CO ₂ y 37 ° C durante 48 horas.
   2. Refrescar el medio y la cultura de los andamios en 5% de _CO2 y 37 ° C durante otras 48 horas; entonces, liberar las células de la andamio mediante la adición de 200 U de colagenasa IV (100 U / ml) al medio.
   3. Centrifugar las células después de que se liberan. Reemplazar el medio con 2 ml de medio EGM2-MV suplementado con 2% de B27, VEGF-A (50 ng / ml), y SB-431542 (10 mM); refrescar el medio cada dos días.
   4. Aproximadamente 10 días más tarde (es decir, en ~ Día 14 después de que se inició la diferenciación), disociar las células con 100 U / ml de colagenasa IV, aislar hIPSC-ECs de la población de células diferenciadas a través de citometría de flujo se analizan para la expresión de proteínas marcadoras EC-específicos (por ejemplo, CD31, CD144) ^3.
   5. Ampliar el aislado hiPSC-EC a través de un protocolo establecido ^3.

3. Diferenciar hiPSCs en hiPSC-CML

1. Sembrar el hiPSCs en placas que han sido recubiertas con la mezcla de proteína gelatinosa, y cultivar las células en medio mTeSR1 en 5% de _CO2 y 37 ° C, con cambios de medio día, hasta la confluencia (~ 2 días).
2. Iniciar la diferenciación en células de linaje mesodérmico-cultivando las células con CHIR99021 (5 M) y BMP-4 (10 ng / ml) en medio RPMI1640 y 2% B27 más insulina durante 3 días.
3. Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente sintético:
   1. Cultivar las células con VEGF-A (25 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos (β FGFβ, 5 ng / ml) en RPMI1640 me Dium, y 2% B27 menos insulina en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 4 días.
   2. Cultivar las células en VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) en medio RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 2 días.
   3. Cultivar las células en derivados de las plaquetas del factor de crecimiento β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF (3 ng / ml) en RPMI1640, y 2% B27 más insulina en 5% de _CO2 y 37 ° C durante 4 días.
4. Para producir hiPSC-CML con un fenotipo predominantemente contráctil:
   1. Cultivar las células durante 4 días con VEGF-A (25 ng / ml) y FGFβ (5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% de insulina B27 menos.
   2. Cultivar las células durante 7 días con PDGFβ (5 ng / ml) y TGF (2,5 ng / ml) en RPMI1640 y 2% B27 más insulina.
5. Se purifica el finales poblaciones hiPSC-SMC cultivando las células en lactato (4 mM) que contenía medio RPMI1640 metabólica para ~ 6 días.

jove_title "> 4. La creación de las microesferas que contienen IGF-

1. aceite de oliva de calor a 45 ° C en un baño de agua.
2. Heat 5 ml de solución de gelatina al 10% a 50 ° C.
3. Añadir la gelatina para el aceite de oliva, remover, y luego enfriar rápidamente a 5 ° C mediante la adición de hielo en el baño de agua.
4. Veinticinco minutos después, añadir acetona fría (4 ° C) para el aceite de oliva para inducir la formación de microesferas.
5. Mantener la temperatura a 5 ° C durante 1 hora; a continuación, recoger las microesferas, ellos lavar 5 veces con acetona enfriada previamente para eliminar el aceite de oliva, y permitir que se seque al aire a 4 ° C.
6. Resuspender las microesferas en una solución de 70% de etanol y 0,25% de glutaraldehído durante la noche a 4 ° C para inducir la reticulación y, a continuación neutralizar la mezcla con glicina 100 mM.
7. Cargar IGF en las microesferas mediante la mezcla de 5 mg de microesferas con 15 l H ₂ O destilada que contenía 5 mg de IGF y 0,1% de albúmina de suero bovino durante 30 min.

5. Creación del parche sobre el sitio de la lesión y inyectando las células

1. Se suspende el derivado de hiPSC CM (2 millones), SMC (1 millón) y EC (1 millón), así como en 1 ml de medio esencial mínimo (MEM).
2. Suspender 5 mg de microesferas en 1 ml de solución de fibrinógeno (25 mg / ml).
3. Llene una jeringa con la solución que contiene células, otra jeringa con la solución de fibrinógeno / microesfera, y tercera jeringa con 1 ml de solución de trombina (80 unidades NIH / ml, suplementadas con 2 l 400 mM CaCl ₂ y 200 mM ε-aminocaproico ácido).
4. Quirúrgicamente inducir el infarto de miocardio en el corazón porcina a través de la ligadura de la arteria descendente anterior coronaria como se ha descrito antes ^2.
   NOTA: En breve, cerdos Yorkshire hembra (~ 13 kg, 45 días de edad) son sedados con una inyección intramuscular de zoletil / xilazina (4,4 mg / kg), y fue intubado bajo anestesia general con isoflurano (0,5-5%). Un ^4º interctoracotomía ostal se lleva a cabo y se fue arteria coronaria descendente anterior se expone. La arteria coronaria se ocluye por una ligadura para 60 min y luego se elimina la ligadura. desfibrilación eléctrica inmediata se realiza en el caso de la fibrilación ventricular.
5. Coloque un anillo de plástico estéril (~ 2,5 cm) en el epicardio de la zona del infarto de corazón de cerdo, y luego inyectar simultáneamente las soluciones de microesferas / fibrinógeno y trombina en el anillo.
6. Dejar que la mezcla se solidifique (~ 30 seg), y luego insertar la aguja de la jeringa que contiene células a través de la mezcla solidificada en el miocardio infartado e inyectar las células. Cierre las capas musculares, tejido subcutáneo y de la pared torácica con 3-0 o 2-0 monocryl de sutura según el tamaño del animal. La buprenorfina 0,01-0,02 mg / kg inyección intramuscular se utilizará cada 8 horas para controlar el dolor durante los primeros 3 días después de la cirugía.
7. Evaluar la función cardíaca mediante una resonancia magnética cardiacaformación de imágenes (MRI) antes del procedimiento quirúrgico, una semana y cuatro semanas después del procedimiento quirúrgico ^{2, 3, 4.} Después de los estudios finales de resonancia magnética, sacrificar al animal y procesar sus corazones para histología y análisis molecular ^{2, 3, 4.}

Resultados

Caracterización de Diferenciada hiPSC-CM, -ECs, y -SMCs

La capacidad diferencial de hiPSCs se evaluaron ^{2, 3, 4.} Flujo de análisis de citometría de T expresión troponina cardíaca (cTnT) sugieren que la pureza de la población final hiPSC-CM puede exceder de 90% (Figura 1A, 1B, panel de B1). Casi tod...

Discusión

Rendimiento mejorado / pureza de hiPSC-CM

protocolos convencionales para la diferenciación de las células madre humanas en los CM son a menudo limitadas por el bajo rendimiento y la pureza; por ejemplo, solo 35-66% de células madre-CM obtiene a través de la separación de Percoll y la formación de cuerpos cardiaca expresado miosina lenta cadena pesada o cTnT ^6. La pureza de las poblaciones hiPSC-CM diferenciadas se puede incrementar sustancialmente mediante la selec...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H