Pluripotente Stammzellen Herzzellen für Myocardial Repair Abgeleitet

Zusammenfassung

Wir präsentieren drei neue und effizientere Protokolle für den menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen in Kardiomyozyten, Endothelzellen differenzieren und glatten Muskelzellen und eine Fördermethode, die das Einwachsen von transplantierten Zellen verbessert durch Zellinjektion mit Patch-vermittelten Cytokin-Lieferung zu kombinieren.

Zusammenfassung

Menschlichen pluripotenten Stammzellen (hiPSCs) müssen vollständig in spezifische Zelltypen vor der Verabreichung unterschieden werden, aber herkömmliche Protokolle für hiPSCs in Kardiomyozyten (hiPSC-CMs), Endothelzellen (hiPSC-ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs) Differenzieren sind oft begrenzt durch geringe Ausbeute, Reinheit und / oder schlechter phänotypische Stabilität. Hier stellen wir neue Protokolle zum Erzeugen hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs, die wesentlich effizienter als herkömmliche Verfahren sind, sowie ein Verfahren zum Kombinieren von Zellinjektion mit einem Cytokin Haltiges Pflaster über der Verabreichungsstelle geschaffen. aus dem Myokard gequetscht, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen längeren Zeitraum der Patch verbessert sowohl die Beibehaltung der injizierten Zellen, indem die Nadelbahn Abdichten der Zellen aus zu verhindern. In einem Schweinemodell der myokardialen Ischämie-Reperfusionsverletzung, war die Rate der Verpflanzung mehr als das Zweifache größer, wenn dieZellen wurden mit dem Zytokin Haltiges Pflaster zu den Zellen ohne Patch vergleicht verabreicht und die Behandlung sowohl mit den Zellen und dem Patch, aber nicht mit den Allein-Zellen wurde mit signifikanten Verbesserungen in der Herzfunktion und die Infarktgröße zugeordnet ist.

Einleitung

Menschliche induzierte pluripotente Stammzellen (hiPSCs) gehören zu den vielversprechendsten Mittel für die regenerative Zelltherapie, weil sie in eine potenziell unbegrenzte Reichweite und Menge der Zellen unterschieden werden können, die durch den Patienten Immunsystem abgestoßen werden nicht. Aber ihre Fähigkeit zur Selbstreplikation und die Differenzierung kann auch zur Tumorbildung führen und folglich müssen hiPSCs vollständig in spezifische Zelltypen zu differenzieren, wie Kardiomyozyten (CMs), Endothelzellen (ECs) und glatten Muskelzellen (SMCs ), vor der Verabreichung. Eine der einfachsten und häufigsten Methoden der Zell Verabreichung direkte intramyokardiale Injektion, aber die Anzahl der transplantierten Zellen, die von der nativen Herzmuskelgewebe transplantiert werden, ist außerordentlich gering. Ein Großteil dieser Abrieb kann auf die zytotoxische Umgebung des ischämischen Gewebes zugeschrieben werden; Wenn jedoch murinen embryonalen Stammzellen (ES-Zellen) wurden direkt in das Myokard von unversehrten Herzen injiziert, only ~ 40% der 5 Millionen Zellen wurden für 3-5 h ^1, behielt geliefert , die ein wesentlicher Teil der verabreichten Zellen legt nahe , dass die Applikationsstelle verlassen, vielleicht , weil sie durch die hohen Drücke durch die Nadelbahn herausgedrückt erzeugt während Myokardkontraktion.

Hier stellen wir neuartige und wesentlich effizientere Methoden zur Erzeugung hiPSC abgeleitete Kardiomyozyten (hiPSC-CMs) ^2, Endothelzellen (hiPSC-ECs) ³ und glatten Muskelzellen (SMCs) ^4. Bemerkenswert ist , ist dies hiPSC-SMC - Protokoll die ersten , die breite Palette von morphologischen und funktionellen Eigenschaften in somatischen SMCs ⁵ beobachtet zu imitieren , indem die Zellen in Richtung einer überwiegend synthetische oder Kontraktions SMC - Phänotyp zu lenken. Wir stellen auch ein Verfahren zur Zellabgabe, die durch die Schaffung eines Cytokin-enthaltenden Fibrin p die Transplantationsrate von injizierten Zellen verbessertAtch auf die Injektionsstelle. Der Patch erscheint beide Zellretention zu verbessern, indem der Nadelbahn Abdichten der Zellen aus dem Verlassen des Myokards, und das Überleben der Zelle, durch die Freigabe insulin-like growth factor (IGF) über einen Zeitraum von mindestens drei Tage zu verhindern.

Protokoll

Alle experimentellen Verfahren werden in Übereinstimmung mit den Tier Richtlinien der University of Alabama in Birmingham durchgeführt.

1. Differenziert hiPSCs in hiPSC-CMs

1. Beschichten der Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit vorgekühlten wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteingemisch bei 4 ° C über Nacht. Saugen Sie das gallertartig Proteinmischung vor dem Gebrauch. Seed die hiPSCs auf die vorbeschichteten Platten und Kultur der Zellen (1 × 10 ⁵ Zellen pro Vertiefung) bei 5% CO ₂ und 37 ° C in mTeSR1 Medium Ergänzung mit 10 uM ROCK - Inhibitor.
2. Aktualisieren Sie das Medium täglich, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen; dann, wachstumsfaktor reduziert gelatinösen Proteinmischung zu dem Medium (0,5 mg gelatinösen Proteinmischung pro Platte mit 6 Vertiefungen, 2 ml Medium pro Vertiefung), und die Kultur der Zellen für 5% CO ₂ und 37 ° C zwei Tage hinzu.
   1. Um das Medium zu ersetzen, saugen sanft das Medium aus der Petrischale über Vakuum mitaus den Zellen zu berühren, und neues Medium mit einer Transferpipette hinzufügen.
3. Initiieren Differenzierung durch das Medium mit RPMI1640-Medium ersetzt, supplementiert mit Wachstumsfaktor reduzierte gelatinösen Proteingemisch, B27 ohne Insulin und 100 ng / ml Activin A; Kultur die Zellen bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 24 Std.
4. Ersetzen des Mediums mit RPMI1640-Medium, das ohne Insulin mit B27 ergänzt wurde, 10 ng / ml bone morphogenic protein 4 (BMP-4) und 10 ng / ml basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF); Kultur die Zellen bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 96 Stunden.
5. Ersetzen Sie das Medium mit RPMI1640 - Medium mit B27 ergänzt und weiter Kultur der Zellen bei 5% CO ₂ und 37 ° C; erfrischen alle 3 Tage das Medium.
6. Beobachten Cluster von Zellen unter dem Mikroskop ~ 3 Tage nach Beginn der Differenzierung zieht. Sammeln Sie die Cluster ~ 7 Tage nach der ersten Kontraktionen und waschen Sie sie in Hanks Balanced Salt Solution Beobachtung.
   1. Distanzieren der geclusterten-Zellen in der Platte, indem sie in Hanks-Puffer Inkubation für 10 min bei 37 ° C, die 100 U / ml Kollagenase IV unter leichtem Schütteln; Dann wird für 5 min 0,25% Trypsin in Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) hinzuzufügen.
   2. Neutralisieren der Enzymlösung mit 10% fötalem Rinderserum in RPMI / B27-Medium und dann Resuspendieren der Zellen in RPMI / B27 Medium.
   3. Zähle die Anzahl der Zellen durch Hämocytometer. Kultur die Zellen auf 10 cm - Schalen bei 5% CO ₂ und 37 ° C für mindestens 3 Stunden, die die nicht-Kardiomyozyten - Zellen an die Oberfläche der Kulturschale anhaften können.
7. Sammeln Sie die Zellsuspension, die die hiPSC-CMs enthält, und halten Sie die Zellen (etwa 1 x 10 ⁶ Zellen pro 10 cm Schale) , indem sie auf einer gallertartigen Proteinmischung -beschichteten Oberfläche kultiviert werden .

2. Differenziert hiPSCs in hiPSC-ECs

1. Distanzieren die hiPSC Bevölkerung in einzelne Zellen durch Inkubation them mit Mittel bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 5 min chelatisierenden. Übertragen Sie die Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen mit frischem mTeSR1 Medium.
2. Spin down die Zellen bei 200 xg für 5 min. Resuspendieren der Zellen in mTeSR1 Medium, das mit 10 & mgr; M ROCK-Inhibitor. Bestimmen Sie die Zelldichte mit einem Hämozytometer.
3. In 250 ul 20 NIH-Einheiten / ml Thrombin-Lösung auf eine Vertiefung einer 24-Well-Platte.
4. 1 x 10 ⁶ hiPSCs bis 250 & mgr; l einer 12,5 mg / ml Fibrinogen - Lösung. Und fügen Sie die 250 ul zellhaltigen Fibrinogenlösung auf die Thrombin-geladen gut. Beachten Sie die Mischung verfestigen, um ein hiPSC haltigen Fibrin Gerüst innerhalb min zu bilden.
5. Übertragen die verfestigten, zellhaltigen Gerüste in die Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen mit den Deckglaspinzetten und Differenzierung einzuleiten durch Kultivieren der Gerüste in 2 ml EBM2 Medium, ergänzt mit 2% B27 ohne Insulin, Activin-A (50 ng / ml) und BMP-4 (25 ng / ml) für 24 h bei 5% CO 2 und 37 ° C.
   1. Ersetzen Sie das Medium vorsichtig das alte Medium über Vakuum saugt, ohne die Zellen zu berühren. Hinzufügen neuer EBM2 Medium, supplementiert mit B27 ohne Insulin, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF, 50 ng / ml), Erythropoietin (EPO, 100 ng / ml) und transformierender Wachstumsfaktor β1 (TGFβ1, 10 ng / ml), und die Kultur, die Gerüste bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 48 Stunden.
   2. Aktualisieren Sie die mittlere und Kultur die Gerüste bei 5% CO ₂ und 37 ° C für weitere 48 h; Dann lassen Sie die Zellen aus dem Gerüst durch Zugabe von 200 U Kollagenase IV (100 U / ml) zum Medium.
   3. Spin down die Zellen, nachdem sie freigegeben werden. Ersetzen Sie das Medium mit 2 ml EGM2-MV-Medium mit 2% der B27 ergänzt, VEGF-A (50 ng / ml) und SB-431542 (10 & mgr; M); aktualisieren alle zwei Tage das Medium.
   4. Etwa 10 Tage später (dh auf ~ 14. Tag nach der Differenzierung initiiert wurde), distanzieren die Zellen mit 100 U / ml Kollagenase IV, isolieren hiPS-ECs aus der Population von differenzierten Zellen über Durchflusszytometrie analysiert für die Expression von EC-spezifischen Markerproteine (zB CD31, CD144) ^3.
   5. Erweitern Sie den isolierten hiPSC-ECs über ein etabliertes Protokoll ^3.

3. Differenziert hiPSCs in hiPSC-SMCs

1. Samen der hiPSCs auf Platten, die die Zellen in mTeSR1 Medium bei 5% CO ₂ und 37 ° C, mit täglicher Mediumwechsel, bis zur Konfluenz (~ 2 Tage) mit gelatinösen Proteingemisch, und die Kultur beschichtet wurden.
2. Initiieren Differenzierung in mesodermalen Abstammungslinien-Zellen durch Kultivieren der Zellen mit CHIR99021 (5 uM) und BMP-4 (10 ng / ml) in RPMI1640-Medium und 2% B27 plus Insulin für 3 Tage.
3. HiPSC-SMCs mit überwiegend synthetischen Phänotyp zu erzeugen:
   1. Kultur der Zellen mit VEGF-A (25 ng / ml), Fibroblasten-Wachstumsfaktor-β (FGFβ, 5 ng / ml) in RPMI1640 me dium und 2% B27 minus Insulins bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 4 Tage.
   2. Kultur der Zellen in VEGF-A (25 ng / ml), FGFβ (5 ng / ml) in RPMI1640 - Medium und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 2 Tage.
   3. Kultur der Zellen in platelet-derived growth factor β (PDGFβ, 10 ng / ml), TGF & bgr; (3 ng / ml) in RPMI - 1640 und 2% B27 plus Insulin bei 5% CO ₂ und 37 ° C für 4 Tage.
4. HiPSC-SMCs mit überwiegend Kontraktions Phänotyp zu erzeugen:
   1. Kultur die Zellen für 4 Tage mit VEGF-A (25 ng / ml) und FGFβ (5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 minus Insulin.
   2. Kultur die Zellen für 7 Tage mit PDGFβ (5 ng / ml) und TGF & bgr; (2,5 ng / ml) in RPMI-1640 und 2% B27 plus Insulin.
5. Reinige den endgültigen hiPSC-SMC-Populationen, indem die Zellen in Lactat-Kultivierung (4 mM) RPMI1640 Stoffwechselmedium für ~ 6 Tage enthält.

jove_title "> 4. Erstellen der IGF-enthaltenden Microspheres

1. Olivenöl erhitzen auf 45 ° C in einem Wasserbad.
2. Wärme 5 ml 10% igen Gelatinelösung auf 50 ° C.
3. Fügen Sie die Gelatine zu dem Olivenöl, rühren, und dann schnell abkühlen bis 5 ° C durch das Eis in das Wasserbad Zugabe.
4. Fünfundzwanzig Minuten später hinzuzufügen gekühlt (4 ° C) Aceton zu dem Olivenöl Mikrokügelchens Bildung zu induzieren.
5. Man hält die Temperatur bei 5 ° C für 1 Stunde; Dann sammeln Sie die Microspheres, sie 5-mal mit vorgekühltem Aceton waschen das Olivenöl, und lassen Sie sie an der Luft trocknen bei 4 ° C zu entfernen.
6. Resuspendieren der Mikrokügelchen in einer Lösung aus 70% Ethanol und 0,25% Glutaraldehyd über Nacht bei 4 ° C eine Vernetzung zu induzieren, und dann die Mischung mit 100 mM Glycin zu neutralisieren.
7. Last IGF in die Mikrokügelchen durch Mischen von 5 mg Mikrosphären mit 15 & mgr; l destilliertem H ₂ O , enthaltend 5 & mgr; g IGF und 0,1% Rinderserumalbumin für 30 min.

5. Erstellen der Patch über der Stelle der Verletzung und die Injektion der Zellen

1. Hängen Sie den hiPSC abgeleiteten CMs (2 Millionen), SMCs (1 Million) und ECs (1 Million) zusammen in 1 ml Minimum Essential Medium (MEM).
2. Suspend 5 mg Mikrokügelchen in 1 ml Fibrinogen-Lösung (25 mg / ml).
3. Füllen einer Spritze mit der zellhaltigen Lösung, eine andere Spritze mit der Fibrinogen / Mikrokügelchen - Lösung und eine dritte Spritze mit 1 ml Thrombinlösung (80 NIH Einheiten / ml, ergänzt mit 2 & mgr; l 400 mM CaCl ₂ und 200 mM ε-Aminocapronsäure Acid).
4. Chirurgisch Myokardinfarkt bei Schweinen Herz über Ligatur der linken vorderen absteigenden Koronararterie induzieren , wie vor ² beschrieben.
   HINWEIS: Kurz gesagt, weibliche Yorkshire Schweine (~ 13 kg, 45 Tage alt) mit intramuskuläre Injektion von Telazol / Xylazin sediert sind (4,4 mg / kg) und unter Vollnarkose mit Isofluran (0,5-5%) intubiert. A 4 ^th intercostal Thorakotomie Koronararterie vorderen absteigenden ausgeführt und links ausgesetzt ist. Die Koronararterie wird durch eine Ligatur für 60 min okkludiert und dann wird die Ligatur entfernt. Sofortige elektrische Defibrillation wird im Fall von ventrikulärer Fibrillation durchgeführt.
5. Positionieren Sie einen sterilen Kunststoffring (~ 2,5 cm) auf dem Epikard des Infarktregion Schweineherzen, und dann zu injizieren gleichzeitig die Mikrokügelchen / Fibrinogen und Thrombin-Lösungen in den Ring.
6. Lassen Sie die Mischung (~ 30 sec) zu verfestigen, und dann legen Sie die Nadel der zellhaltigen Spritze durch die verfestigte Mischung in das Infarkt Myokard und injizieren die Zellen. Schließen Sie die Muskelschichten, Unterhautgewebe, und der Brustwand mit 3-0 oder 2-0 Monocryl Naht je nach Tiergröße. Buprenorphin 0,01-0,02 mg / kg intramuskulär alle 8 Stunden verwendet werden, um Schmerzen für die ersten 3 Tage nach der Operation zu steuern.
7. Bewerten Sie die Herzfunktion eines Herz mittels magnetischer Resonanzimaging (MRI) vor dem chirurgischen Eingriff, einer Woche und vier Wochen nach der chirurgischen Prozedur ^{2, 3, 4.} Nach dem abschließenden MRT - Studien, opfern , um das Tier und verarbeiten ihre Herzen für die Histologie und molekulare Analyse ^{2, 3, 4.}

Ergebnisse

Charakterisierung von Differentiated hiPSC-CMs, -ECs und -SMCs

Die differentielle Kapazität von hiPSCs ² wurden ^{ausgewertet, 3, 4.} Durchflusszytometrie analysiert des kardialen Troponin T (cTnT) Ausdruck deuten darauf hin , dass die Reinheit des endgültigen hiPSC-CM Bevölkerung 90% überschreiten kann (Abbildung 1A, <...

Diskussion

Verbesserte Ausbeute / Reinheit von hiPSC-CMs

Herkömmliche Protokolle für die oft menschliche Stammzellen in CMs Differenzierung durch eine geringe Ausbeute und Reinheit begrenzt; zum Beispiel erhalten nur 35-66% der hESC-CMs über Percoll Trennung und Herzkörperbildung langsam Myosin schwere Kette oder cTnT ⁶ ausgedrückt. Die Reinheit von differenzierten hiPSC-CM - Populationen im wesentlichen durch die Auswahl für die Expression eines Reportergens erhöht werden, ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H