다 능성 줄기 세포는 심근 수리를위한 심장 세포를 유도

요약

우리는 심근 세포, 내피 세포, 평활근 세포 및 패치 - 매개 사이토 카인 배달 세포 주입을 조합함으로써 이식 된 세포의 생착을 향상 배송 방법으로 인간 유도 만능 줄기 세포를 구별하기위한 세 가지 신규하고보다 효율적인 프로토콜을 제안한다.

초록

인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSCs)이 완전히 심근 (hiPSC-CMS), 내피 세포 (hiPSC-되는 EC), 및 평활근 세포 (SMCs)에 hiPSCs 차별화에 대한 관리 전에 특정 세포 유형,하지만 기존의 프로토콜로 분화해야합니다 자주 낮은 수율, 순도, 및 / 또는 가난한 표현형의 안정성에 의해 제한. 여기서는 신규 hiPSC-CM이, -ECs를 생성하기위한 프로토콜 및 -SMCs 실질적으로 종래의 방법보다 더 효율적이며, 물론 투여의 사이트를 통해 생성 된 사이토 카인 - 함유 패치 세포 주입을 조합하는 방법을 제시한다. 패치는 장기간 동안 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근에서 압착되는 세포 않도록 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 주입 된 세포의 보존을 모두 개선한다. 심근 허혈 재관류 손상의 돼지 모델에서 생착 속도가 클 때 두 배보다 더이었다세포는 세포 및 패치 모두 시토 킨 - 함유 패치없이 셀 비교 패치 및 치료 투여 아니라 단독 세포, 심장 기능 및 경색 크기에서 상당한 개선 연관되었다.

서문

들이 환자의 면역계에 의해 거부되지 않은 셀의 잠재적으로 무한 범위의 수로 구분 될 수 있기 때문에 유도 인간 다 능성 줄기 세포 (hiPSCs)는 재생 세포 치료에 가장 유망한 제제들이다. (SMCs을하지만, 자기 복제 및 분화 능력은 또한 종양 형성을 초래할 수 있으며, 결과적으로, hiPSCs 완전히 같은 심근 (CMS), 내피 세포 (EC에) 및 평활근 세포와 같은 특정 세포 유형으로 분화 될 필요 ), 투여 전. 세포 투여 간단하고 가장 일반적인 방법 중 하나는 직접 심근 내 주입이지만, 네이티브 심근 조직으로 이식 접목되는 세포의 수는 매우 낮다. 이 감소의 대부분은 허혈성 조직의 세포 독성 환경에 기인한다; 그러나, 생쥐 배아 줄기 세포 (는 ESC)가 있었을 때 손상되지 않은 마음의 심근에 직접 주입 O투여 된 세포의 상당한 비율이 그들이하는 동안 생성 된 높은 압력에 의해 바늘 트랙을 통해 압박했다 아마도 때문에 관리 사이트를 종료 제안 3-5 시간 ^{1 일} 동안 유지되었다 전달 된 5 백만 셀 할수 있답니다는 ~ 40 % 심근 수축.

여기, 우리는 hiPSC 유래 심근 세포 (hiPSC-CMS) ^2, 내피 세포 (hiPSC-되는 EC) ^3, 평활근 세포 (SMCs)을 ⁴ 생성 소설과 실질적으로 더 효율적인 방법을 제시한다. 특히,이 hiPSC-SMC 프로토콜은 주로 합성 또는 수축 SMC 표현형으로 세포를 연출하여 체세포 SMCs ^5에서 관찰 형태 학적 및 기능적 특성의 넓은 범위를 모방 처음이다. 우리는 또한 사이토 카인 함유 피브린 (P)을 생성하여 주사 세포의 생착 속도를 향상 세포 전달 방법을 제공하는주사 부위를 통해 ATCH. 패치는 적어도 3 일에 걸쳐 인슐린 유사 성장 인자 (IGF)를 해제함으로써, 심근 종료로부터 세포를 방지 바늘 트랙 및 세포 생존을 밀봉함으로써, 두 세포 유지를 향상시키기 위해 나타난다.

프로토콜

모든 실험 절차는 버밍엄에서 알라바마 대학의 동물 가이드 라인에 따라 수행된다.

1. hiPSC-CM이에 hiPSCs 차별화

1. 코트 밤새 4 ℃에서 사전 냉각 된 성장 인자 - 감소 된 젤라틴 단백질 혼합물로 6 웰 플레이트의 웰. 사용하기 전에 젤라틴 단백질 혼합물을 기음. 5 % CO _2, 10 μM의 ROCK 저해제와 37 ° C mTeSR1 중간 보충에있는 세포 (물론 당 1 × 10 ⁵ 세포를) 미리 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화.
2. 세포가 90 % 합류에 도달 할 때까지 매일 배지를 새로 고침; 다음, 5 % CO _2, 37 ° C 두 개 더 일 동안 매체 (0.5 mg을 젤라틴 단백질 6 웰 플레이트 당 혼합물, 잘 당 2 ㎖의 중간), 문화에 세포 성장 인자 감소 젤라틴 단백질 혼합물을 추가합니다.
   1. 매체를 교체하려면, 부드럽게 진공 통해 페트리 접시에서 매체를 빨아아웃 셀을 터치하고, 전송 피펫을 사용하여 새로운 매체를 추가합니다.
3. 보충 된 RPMI1640 배지 배지로 대체하여 분화를 시작하지 않고 인슐린 젤라틴 단백질 혼합물 B27를 성장 인자 - 감소, 100 NG / ㎖ 티빈 a 및 문화 5 % CO _2, 24 시간 동안 37 ℃에서 세포.
4. ; RPMI1640 인슐린없이 B27로 보충 된 배지 10 NG / ㎖ 뼈 형태 형성 단백질 4 (BMP-4), 10 ng의 / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF)와 매체를 대체 문화 5 % CO _2, 96 시간 동안 37 ℃에서 세포.
5. B27 보충 된 RPMI1640 배지로 배지를 교체하고, 5 % CO ₂ 및 37 ° C에서 배양 세포를 계속; 3 일마다 배지를 새로 고칩니다.
6. 분화를 시작 후 3 일 ~ 현미경으로 세포를 수축의 클러스터를 관찰한다. ~ 칠일 최초의 수축을 관찰 한 후 클러스터를 수집하고 행크스 균형 소금 솔루션에 씻어.
   1. 부드러운 진동 37 ºC에서 10 분 동안 100 U는 / ㎖ 콜라게나 제 IV 포함 행크스 버퍼를 배양하여 접시에 클러스터 된 세포를 떼어 놓다; 이어서, 5 분 동안 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 0.25 % 트립신을 추가한다.
   2. RPMI / B27 배지에서 10 % 소 태아 혈청 효소 용액을 중화하고 RPMI / B27 배지에서 세포를 재현 탁.
   3. 혈구에 의해 세포 수를 계산. 문화 비 심근 세포가 배양 용기의 표면에 부착 할 수 있도록 5 % CO _2, 적어도 3 시간 동안 37 ℃에서 10cm 접시에 세포.
7. hiPSC-CMS에 포함 된 세포 현탁액을 수집하고, 단백질 혼합물을 젤라틴 코팅 된 표면을 배양함으로써 (10cm 접시 당 ¹ × ¹⁰⁶ 세포 주위) 세포를 유지한다.

2. hiPSC-되는 EC에 hiPSCs 차별화

1. 일을 배양하여 단일 세포로 hiPSC 인구 해리5 % CO _2, 5 분 동안 37 ° C에서 킬레이트 제와 엠. mTeSR1 신선한 배지를 함유하는 15 mL의 원심 분리 튜브에 세포를 옮긴다.
2. 5 분 동안 200 XG에서 세포를 스핀 다운. 10 μM의 ROCK 저해제로 보충 mTeSR1 매체에 세포를 재현 탁. 혈구와 셀 밀도를 결정합니다.
3. 24 웰 플레이트 잘 하나에 20 NIH 단위 / ml의 트롬빈 용액 250 μl를 추가합니다.
4. 12.5 ㎎ / ㎖ 피브리노겐 용액 250 ㎕를 1 × 10 ⁶ hiPSCs를 추가합니다. 그리고 트롬빈로드 웰에 세포 함유 피브리노겐 용액 250 μl를 추가합니다. 혼합물 분 내에 hiPSC 함유 섬유소 발판을 형성하기 위해 응고 관찰한다.
5. 커버 유리 집게로 6 웰 플레이트에 고화 셀 - 함유 지지체를 전송하고, 인슐린없이 2 % B27 보충 2ml의 EBM2 매체 골격을 배양하여 분화를 개시, 티빈-A (50 NG / ㎖) BMP-4 24 시간 동안 (25 NG / ㎖), 5 % CO에서 이 37 ° C를.
   1. 부드럽게 세포를 건드리지 않고 진공을 통해 기존의 매체를 흡입하여 매체를 교체합니다. 인슐린없이 B27 보충 된 새로운 EBM2 매체, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF, 50 NG / ㎖) 에리트로 포이 에틴 (EPO 100 NG / ㎖) 및 변형 성장 인자 β1 (TGFβ1 10 NG / ㎖)과 문화 추가 5 %에서 비계 CO _2, 48 시간 동안 37 ° C.
   2. 매체와 문화 5 % CO _2와 다른 48 시간 동안 37 ℃에서 공사장 공중 발판을 새로 고침; 다음에, 배지에 200 U의 콜라게나 제 IV (100 U / ㎖)을 첨가하여 지지체로부터 세포를 분리.
   3. 이 출시 된 후 세포를 스핀 다운. B27, VEGF-A (50 NG / ㎖) 및 SB-431542 (10 μM)의 2 % 용액이 보충-MV EGM2 배지로 배지를 교체; 매 2 일 매체를 새로 고칩니다.
   4. 100 U와 / ㎖ 콜라게나 제 IV를 세포를 떼어 놓다 약 10 일 후 (~ 분화가 시작된 후 하루 14 예), 시간을 분리유동 세포 계측법을 통한 분화 세포 집단에서 IPSC의 EC-EC는 특정 마커 단백질의 발현을 분석하여 (예를 들어, CD31, CD144) ^3.
   5. 설립 프로토콜 ^(3)을 통해 고립 hiPSC-되는 EC를 확장합니다.

3. hiPSC-SMCs에 hiPSCs 차별화

1. 젤라틴 단백질 혼합물로 코팅 된 플레이트 상에 hiPSCs 종자, 문화 mTeSR1 배지에서 세포를 5 % CO _2, 37 ℃에서 하루 중 변화와 합류 할 때까지 (~ 2 일간).
2. 3 일간 RPMI1640 배지 및 2 % B27 플러스 인슐린에 CHIR99021 (5 μM) 및 BMP-4 (10 ng의 / ㎖) 세포를 배양하여 혈통 중배엽 세포로의 분화를 시작.
3. 주로 합성 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 :
   1. 문화 VEGF-A (25 NG / ㎖), RPMI1640 내에서 섬유 아세포 성장 인자 β (FGFβ 5 NG / ㎖)을 세포 dium, 2 %의 B27 마이너스 인슐린 5 % CO _2에서 4 일 동안 37 ° C.
   2. 문화 VEGF-A의 셀 (25 NG / ㎖) FGFβ 5 % CO ₂ 및 37 RPMI1640 배지 (5 NG / ㎖)에 2 % B27 플러스 인슐린 2 일 동안 C를 °.
   3. 문화 혈소판 유래 성장 인자 β (PDGFβ 10 NG / ㎖), TGFβ, 5 % CO ₂ 및 37 RPMI1640 (3 NG / ㎖), 2 % B27 플러스 인슐린 세포 4 일 동안 C를 °.
4. 주로 수축 표현형과 hiPSC-SMCs을 생성하려면 :
   1. 문화 4 RPMI1640에서 VEGF-A와 일 (25 NG / ㎖) 및 FGFβ (5 NG / ㎖) 및 2 % B27 마이너스 인슐린에 대한 세포.
   2. RPMI1640 배양하고, 2 % B27 플러스 인슐린 PDGFβ (5 NG / mL) 및 TGFβ (2.5 NG / ㎖) 7 일 동안 세포.
5. 6 ~ 일 대사 RPMI1640 배지를 함유하는 락트산 (4 mM)을 상기 세포를 배양하여 최종 hiPSC SMC-집단을 정제.

jove_title "> 4. IGF-포함하는 마이크로 스피어 만들기

1. 열 올리브 오일 수조에서 45 ° C까지.
2. 열 50 ° C로 10 % 젤라틴 용액 5 ㎖.
3. 올리브 오일, 볶음에 젤라틴을 추가하고 물을 욕조에 얼음을 추가하여 5 ° C에 다음 급속 냉각.
4. 스물 다섯 분 후, 마이크로 스피어의 형성을 유도하기 위해 올리브 오일에 냉장 (4 ℃로) 아세톤을 추가합니다.
5. 도 5에서의 온도를 유지 1 시간 동안 ° C; 다음 올리브 오일을 제거하기 위해 미리 냉각 아세톤으로 그들에게 5 번 세척, 미세을 수집하고, 4 ℃에서 자연 건조로 할 수 있습니다.
6. 가교 결합을 유도 밤새 4 ℃에서 70 % 에탄올 및 0.25 %의 글루 타르 알데히드의 용액에 미소 구를 재현 탁하고 100mM의 글리신과 혼합하여 중화.
7. H를 30 분 동안 5 μg의 IGF와 0.1 % 소 혈청 알부민을 함유하는 ₂ O 증류수 15 ㎕의 5 mg의 미세 구를 혼합하여 미립자로로드 IGF.

5. 세포를 손상의 사이트를 통해 패치를 작성 및 주입

1. 1 ml의 최소 필수 중간 (MEM)에 함께 hiPSC 파생 SMCs (100 만)의 CM (200 만), 및되는 EC (1000000)를 일시 중단합니다.
2. 1 ㎖의 피브리노겐 용액 (25 ㎎ / ㎖)에 5 ㎎ 미소 일시 중단.
3. 셀 - 함유 용액, 피브리노겐 / 미세 용액과 다른 주사기 및 트롬빈 용액 1 ㎖와 함께 제 주사기 한 주사기를 채우기 (80 NIH 단위 / ㎖, 2 ㎕의 400 mM의 _CaCl2를 200 mM의 ε 아미노 카프로 보충 산).
4. ^수술이 이전에 설명 된 바와 같이 관상 동맥을 내림차순 왼쪽 전방의 결찰을 통해 돼지 심장에서 심근 경색을 유도한다.
   참고 : 간단한, 여성 요크셔 돼지에서 (~ 13kg이, 연령 45 일)을 Telazol / 크 실라 (4.4 ㎎ / ㎏)의 근육 내 주사로 진정되고, 이소 플루 란 (0.5 %)와 전신 마취하에 삽관. 4 ^번째 intercostal 개흉술을 수행하고 노출 관상 동맥을 내림차순 앞쪽에 남아 있습니다. 관상 동맥을 60 분간 결찰하여 가려 짐 후 봉합사를 제거한다. 직접 전기 세동은 심실 세동의 경우에서 수행된다.
5. 돼지 마음의 경색 영역의 심장 외막에 멸균 플라스틱 링 (~ 2.5 cm)을 배치하고 동시에 링에 미세 / 피브리노겐과 트롬빈 솔루션을 주입.
6. 혼합물 (~ 30 초)을 고화하도록 한 다음 세포를 심근 경색으로 응고 된 혼합물을 통해 세포 함유 주사기의 바늘을 삽입하고 삽입. 3-0 또는 2-0 Monocryl 봉합이 동물의 크기에 따라와 근육 층, 피하 조직, 그리고 가슴 벽을 닫습니다. 부 프레 노르 핀 0.01-0.02 밀리그램 / kg 근육 내 주사는 8 시간마다 수술 후 처음 3 일 동안 통증을 제어하는 ​​데 사용된다.
7. 심장 자기 공명를 사용하여 심장 기능을 평가수술 한 주일 수술 ^{2, 3, 4} 이후 사주 전 영상 (MRI). 최종 MRI 연구 후에, 동물을 희생하고 조직 학적 및 분자 분석을 ^{2, 3, 4의} 마음을 처리한다.

결과

차별화 된 hiPSC-CM이, -ECs 및 -SMCs의 특성

hiPSCs의 차동 용량 ^{4, 2 (3)을} 평가했다. 세포 계측법 최종 hiPSC-CM 인구의 순도가 90 % (그림 1A, 1B, 패널 B1)를 초과 할 수 있음을 시사 심장 트로포 닌 T (cTnT를) 식의 분석 흐름. 거의 모든 셀 느린 미...

토론

hiPSC-CM이 향상된 수율 / 순도

의 CM으로 인간의 줄기 세포를 분화에 대한 기존의 프로토콜들은 종종 낮은 수율과 순도에 의해 제한된다 예를 들어, hESC의-CM이 단지 35-66% 느린 마이 오신 중쇄 또는 cTnT의 ⁶ 표현 퍼콜 분리 및 심장 몸 형성을 통해 획득했습니다. 분화 hiPSC-CM 인구의 순도는 대략의 프로모터에 결합되어 리포터 유전자의 발현을 위해 선택함으로써 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Protocol Section 1
mTeSR1 medium	Stem cell technologies	5850
Growth-factor-reduced matrigel	Corning lifescience	356231
Y-27632	Stem cell technologies	72304
B27 supplement, serum free	Fisher Scientific	17504044
RPMI1640	Fisher Scientific	11875-119
Activin A	R&D	338-AC-010
BMP-4	R&D	314-BP-010
bFGF	R&D	232-FA-025
Collagenase IV	Fisher Scientific	NC0217889
Hanks Balanced Salt Solution (Dextrose, KCl, KH2PO4, NaHCO3, NaCl, Na2HPO4 anhydrous)	Fisher Scientific	14175079
Fetal Bovine Serum	Fisher Scientific	10438018
6-well plate	Corning Lifescience	356721
10 cm dish	Corning Lifescience	354732
Cell incubator	Panasonic	MCO-18AC
Protocol Section 2
Versene	Fisher Scientific	15040066
Fibrinogen	Sigma-Aldrich	F8630-5g
Thrombin	Sigma-Aldrich	T7009-1KU
EMB2 medium	Lonza	CC-3156
VEGF	ProSpec-Tany	CYT-241
EPO	Life Technologies	PHC9431
TGF-β	Peprotech	100-21C
EGM2-MV medium	Lonza	CC-4147
SB-431542	Selleckchem	S1067
CD31	BD Bioscience	BDB555445
CD144	BD Bioscience	560411
15 ml centrifuge tube	Fisher Scientific	12565269
Eppendorff Centrifuge	Eppendorf	5702R
Protocol Section 3
CHIR99021	Stem cell technologies	720542
PDGF-β	Prospec	CYT-501-10ug
Protocol Section 4
Olive oil	Sigma-Aldrich	O1514
Gelatin	Sigma-Aldrich	G9391
Acetone	Sigma-Aldrich	179124
Ethanol	Fisher Scientific	BP2818100
Glutaraldehyde	Sigma-Aldrich	G5882
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898
IGF	R&D	291-G1-01M
Bovine serum albumin	Fisher Scientific	15561020
Heating plate	Fisher Scientific	SP88850200
Water bath	Fisher Scientific	15-462-10Q
Protocol Section 5
CaCl2	Sigma-Aldrich	223506
ε-aminocaproic acid	Sigma-Aldrich	A0420000
MEM medium	Fisher Scientific	12561-056
Syringe	Fisher Scientific	1482748
Anesthesia ventilator	Datex-Ohmeda	47810
Anesthesia ventilator	Ohio Medical	V5A
Defibrillator	Physiol Control	LIFEPAK 15
1.5 T MRI	General Electric	Signa Horizon LX
7 T MRI	Siemens	10018532
Gadolinium Contrast Medium (Magnevist)	Berlex	50419-188-02
2-0 silk suture	Ethilon	685H
3-0 silk suture	Ethilon	622H
3-0 monofilament suture	Ethilon	627H