Análisis optimizada de<em&gt; En Vivo</em&gt; y<em&gt; In Vitro</em&gt; La esteatosis hepática

Resumen

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Resumen

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.

Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Introducción

La obesidad es un problema de salud creciente en los países desarrollados y en desarrollo. Se ha informado de que una de las condiciones coexistentes frecuentemente asociados con la enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD), con una prevalencia que oscila entre 30 y 100 por ciento en pacientes con NAFLD ^1. Debido a la fuerte correlación entre el hígado graso y la obesidad, obesidad (DIO) modelos de ratón inducidos por la dieta son ampliamente utilizados para estudiar los mecanismos moleculares complejos asociados con el desarrollo de hígado graso no alcohólico ^{2, 3, 4, 5, 6.} La esteatosis hepática es la etapa más temprana de hígado graso no alcohólico, y puede progresar a la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA), cirrosis, y en última instancia, el cáncer de hígado ^7. Por lo tanto, el objetivo general de este método es generar modelos animales y celulares de las condiciones esteatósicos hepáticas y para prOvide protocolos detallados para un análisis de lípidos eficiente y precisa. Estos modelos y las mediciones son también útiles para la investigación de otros trastornos metabólicos, tales como resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2.

Como se identifica que la obesidad es uno de los factores de riesgo de hígado graso no alcohólico, un alto contenido de grasa, dieta alta en sacarosa (HFHS) que imita la dieta alta en grasas de tipo occidental se utiliza para inducir la obesidad en ratones. Posteriormente, el grado de esteatosis hepática puede ser evaluada utilizando diferentes métodos. En primer lugar, el peso corporal y el análisis de la composición corporal con la resonancia magnética nuclear (RMN) muestran la acumulación de lípidos durante la hora de comer. La masa grasa y masa magra se pueden cuantificar de una manera no invasiva y en tiempo real.

Además, la resonancia magnética (MRI) se utiliza para mostrar tanto la de todo el cuerpo y la distribución de hígado de grasa. La señal de escala de grises del análisis de MRI se puede convertir una imagen de color pseudo-legible en, y la intensidad dela escala de grises y el color es hemi-cuantificable. Esta tecnología proporciona ventajas únicas para la medición de la acumulación de lípidos en animales vivos. En segundo lugar, el análisis histológico del hígado es el método más comúnmente utilizado para determinar la esteatosis hepática. Hematoxilina y eosina (H & E) tinción histológica proporciona información, tales como la morfología de los hepatocitos y la infiltración de macrófagos, mientras que Oil Red O tinción muestra el tamaño y la posición de las gotas de lípidos en los hepatocitos. En tercer lugar, el análisis del contenido de lípidos mediante la extracción de cloroformo / metanol es una medida precisa y cuantitativa de los lípidos hepáticos. Los niveles totales de colesterol y triglicéridos se pueden medir con métodos bioquímicos. Es importante destacar que, el análisis de extracción de lípidos y Oil Red O tinción también se pueden utilizar en los hepatocitos tratados farmacéuticamente manipulado genéticamente o.

La ventaja del presente método es su utilización de múltiples enfoques optimizados para generar modelos esteatósicos hepáticasy caracterizar exhaustivamente los fenotipos tanto in vivo como in vitro. Los modelos de ratones DIO pueden recapitular la patología y metabólicas fenotipos de la enfermedad de hígado graso humano. Otros parámetros metabólicos en humanos pueden ser replicados en este modelo, así ^8. La generación del modelo de hepatocitos grasos sometidos en respuesta a los altos de glucosa e insulina es eficiente, útil y supera la limitación del trabajo costoso y lento ratón. Tomados en conjunto, estos métodos son suficientes y esencial para el estudio de la disfunción hepática de lípidos y resistencia a la insulina durante la sobrecarga de nutrientes.

Protocolo

Todos los protocolos experimentales con animales fueron aprobados por el comité de cuidado de los animales y el uso institucional en el Instituto de Ciencias de la Nutrición, Shanghai Institutos de Ciencias Biológicas, la Academia China de Ciencias (Shanghai, China).

1. Modelo de ratón DIO

1. alimentación HFHS
   1. Alimentar a ratones C57BL / 6 macho de ocho semanas de edad, con un HFHS que contiene 40 kcal% de grasa y 40% de sacarosa kcal. Alojarlos en 12 h condiciones del ciclo de luz-oscuridad.
   2. Mantener los ratones en HFHS condición de la dieta materna durante cuatro a dieciséis semanas. Compruebe semanalmente el peso corporal.
2. Cuerpo análisis de la composición y análisis de imágenes pseudo-color de
   1. Se somete a los ratones a un análisis de la composición corporal analizador.
      1. Asegure ratones conscientes, no anestesiados en un tubo de plástico en el. Medir la masa grasa corporal, masa magra, y los fluidos que utilizan un sistema de RMN, como se ha descrito anteriormente ^2.
   2. Escanear todo el cuerpo de cada ratón utilizando un sistema de resonancia magnética.
      1. Anestesiar a los ratones con 1% Avertin a través de inyección intraperitoneal (25 l / g) y llevar a cabo el análisis de imágenes en tubos de vidrio especializados.
         NOTA: El proceso de formación de imágenes tiene una duración de casi 0,5 horas para cada ratón. Cuando se completa la medición, volver a los ratones a su jaula.
   3. Análisis de todo el cuerpo de los ratones en dorsal, medio y capas ventrales; escanear el hígado en la dirección vertical. Utilice un imán 0,55 T y los siguientes parámetros instrumentales: el espacio K = 192 x 256 m, espesor de la sección = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, y el número de exploraciones = 8. Scan usando la misma condición magnética para todos los grupos de ratones.
   4. Mapear la imagen en escala de grises de una imagen de pseudo-color en función de la intensidad de la señal ^9.
3. la eutanasia del ratón
   1. esterilizar dissectiherramientas Ng, tales como pinzas y tijeras.
   2. Vierta suficiente isoflurano en una toalla de papel y dejar que el isoflurano se volatiliza en un frasco de vidrio. Asegúrese de que los ratones son sacrificados por el isoflurano.
   3. Fijar los ratones en una mesa de operaciones. Pulverizar cada abdomen con 75% de etanol, hacer una incisión en la dermis de la apófisis xifoides con unas tijeras, y rasgar la dermis longitudinalmente a través de la línea media con las manos para exponer el peritoneo.
   4. Abrazadera de la apófisis xifoides con unas pinzas y cortar el peritoneo a lo ancho a través de la parte inferior de las costillas para exponer las vísceras.
   5. Recoger la sangre en tubos con EDTA recubiertos por punción cardiaca.
   6. Cortar el diafragma a lo largo del hígado y retirar con cuidado el hígado a partir de las enterocoelia utilizando unas tijeras finas. Cortar tres piezas de tejido hepático para las siguientes mediciones de lípidos: a) 6 x 3 x 3 mm para la tinción H & E, b) 6 x 3 x 3 mm para Oil Red O tinción, y c) 20-40 mg de hígado de cloroformo / extracción con metanol.
4. H & E tinción
   1. Fijar el hígado en 4% de acetato de formalina tamponada con fosfato a 4 ° C durante la noche y luego incrustarlo en cera de parafina.
   2. Los cortes de secciones de parafina (5 micras) y montarlos en portaobjetos de vidrio para tinción H & E, como se ha descrito previamente ^{3, 10.}
5. Oil Red O tinción
   1. preparación Regent
      1. Preparar la solución de trabajo Oil Red O con 10% de formalina, 60% de isopropanol, hematoxilina, y gelatina de glicerol. Disolver 0,5 g de Oil Red O en polvo con 100 ml de isopropanol y calentar en un baño de 60 ° C para hacer una solución de 0,5%.
      2. Diluir con agua doblemente destilada _(ddH2O) en una proporción de 3: 2 (3 ml de solución de reserva y 2 ml de _ddH2O). Se filtra la solución de trabajo y dejar reposar durante al menos 10 minutos a temperatura ambiente.
   2. Incrustar el hígado en el compuesto temperatura óptima de corte (OCT) en APLastic caja de empotrar. Congelar a -20 ° C durante 30 min. Cortarlo en secciones de 8 micras en un micrótomo de congelación, montar el tejido en una diapositiva, y colocarlo a temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Coloque una toalla de papel en el fondo de una bañera de tinción y se vierte una pequeña cantidad de formalina al 10% para mojar la toalla de papel. Colocar el portaobjetos en la bañera de tinción y fijar las secciones congeladas de vapores de formaldehído durante 5 min a 4 ° C.
   4. Sumergir el portaobjetos en isopropanol al 60% en la bañera de tinción durante 3 s; repita una vez.
   5. Añadir unas gotas de solución de trabajo de Oil Red O a la diapositiva para cubrir todo el tejido y se incuba durante 15 min. Proteger el tejido de la luz a temperatura ambiente.
   6. Enjuague el portaobjetos en la nueva isopropanol 60% en la bañera de tinción durante 3 s; repetir dos veces.
   7. Enjuague suavemente el portaobjetos a través del agua destilada dos veces y eliminar el agua alrededor del tejido. Asegúrese de no secar el tejido.
   8. Colocar el portaobjetos en hematoxilina durante 1 min y enjuagar suavemente con agua del grifo durante 5-10min. Enjuague suavemente el portaobjetos en agua destilada dos veces y mantener la con agua destilada hasta que esté listo para poner en el cubreobjetos.
   9. Calentar la gelatina de glicerol en el microondas y colocar varias gotas en la parte superior del tejido. Coloque con cuidado el cubreobjetos en la parte superior y tener cuidado de no formar burbujas.
   10. Observe la mancha con un microscopio y capturar imágenes usando característicos de 20X y 40X.
6. Medición de lípidos del hígado
   1. Coloque el tejido del hígado diseccionado en un nuevo tubo de centrífuga de 2 ml de plástico. Homogeneizar en 1 ml de PBS con un homogeneizador y transferir el lisado a un nuevo tubo de vidrio de 15 mL.
   2. Añadir 5 ml de cloroformo / metanol (2:, 1 v / v), vórtice la mezcla vigorosamente durante 1 min, y se deja reposar durante 2 horas en hielo.
   3. Centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C; la mezcla debe separarse en 3 capas: la capa superior de metanol, el disco proteína media, y la parte inferior de cloroformo y lípidos.
   4. tran sfer la fase inferior en un nuevo tubo de vidrio usando una pipeta Pasteur de vidrio; no hay necesidad de conseguir cada gota de la fracción inferior. Ajuste el tubo a un lado en el hielo.
   5. Añadir 600 l de 4 mM MgCl ₂ y 1,5 ml de cloroformo a la fracción sobrenadante que queda en el tubo anterior y agitar vigorosamente. Incubar en hielo durante 30 min y se centrifuga a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C.
   6. Combinar la fase inferior con el primer tubo fase inferior mediante pipeta Pasteur. Desechar las capas altas y medias.
   7. Evaporar el cloroformo bajo gas nitrógeno en un baño de 37 ° C. Lavar los lados de los tubos de vidrio a fondo con 200 l de 1% de Triton X-100 / cloroformo (v / v). Se evapora bajo gas nitrógeno. Disolver el lípido con 200 l de _ddH2O y agitar bien para hacer la emulsión final.
   8. Mida el total de triglicéridos (TG) y colesterol (TC) niveles mediante el uso de un kit de triglicéridos o colesterol de acuerdo con el protocolo del fabricantexref "> 3.
      NOTA: Los valores de lípidos se normalizan a los de las concentraciones de proteína en el homogeneizado inicial, según lo determinado por la cuantificación de proteínas ^3.

2. Modelo de hepatocitos de ratón primaria

1. Aislamiento de hepatocitos primarios de ratón
   1. Anestesiar a cada ratón con un 6% de hidrato de cloral (10 l / g por vía intraperitoneal).
   2. Aislar hepatocitos primarios, como se describió anteriormente ^10. Se cultivan las células en cubreobjetos de vidrio recubiertos de colágeno en una placa de 6 pocillos de Oil Red O tinción. Para la extracción de los lípidos, sembrar las células en 10 cm placa de cultivo celular ^10.
2. El tratamiento con células y Oil Red O tinción
   1. Reemplazar el medio con 2 ml de medio de inanición y se incuba a 37 ° C durante 24 h. Tratarla con glucosa 30 mM y 100 nM de insulina. Incubar en una incubadora de cultivo de C 37 ° durante 24 h.
   2. Aspirar el medio. Añadir 2 ml de PBS y agitar suavemente para enjuagar el medio; repita una vez.
   3. Fijar el cubreobjetos al portaobjetos con una banda elástica. Exponer las células adherentes a la superficie exterior. Realizar la tinción Oil Red O como se describe anteriormente (paso 1.5).
      NOTA: Los niveles basales de la acumulación de lípidos son estimuladas con un alto nivel de glucosa más el tratamiento con insulina después de la privación de suero. Las gotas de lípidos se visualizaron por tinción con Oil Red O.
3. Medición de lípidos
   1. El tratamiento de los hepatocitos con alto contenido de glucosa e insulina en la misma condición (paso 2.2.1). Añadir 1 ml de PBS a cada 10 cm de placa de cultivo celular. Raspar las células y los cosechan en nuevos tubos de vidrio de 15 ml, de la que alícuotas de 100 l se transfieren a tubos frescos de 1,5 ml para la cuantificación de proteínas.
   2. Añadir 4 ml de cloroformo / metanol (2: 1, v / v) a los restantes 900 l de células. Someter a ultrasonidos para aproximadas 20 pitidos y luego agitar vigorosamente para liberarel lípido en las células. Incubar la mezcla en hielo durante 2 h. Realizar la extracción de lípidos (paso 1.6).

Resultados

Como se muestra en la Figura 1A, el peso corporal del ratón se aumentó a 45 ± 1,2 g después de 16 semanas de alimentación HFHS, que es aproximadamente 1,5 veces mayor que en el grupo de alimentación de dieta de pienso. Los análisis de la composición corporal de RMN que muestra la masa grasa y la masa magra de ratones se indican (Figura 1B). Las distribuciones de grasa de todo el cuerpo y del hígado se determinó por resonancia magnética, y las ...

Discusión

Hígado graso no alcohólico es una serie de enfermedades hepáticas progresivas que se asocia con el síndrome metabólico, la obesidad, la resistencia a la insulina, o diabetes mellitus tipo 2 (DM2) ^11. El sello distintivo de hígado graso no alcohólico es la esteatosis, la acumulación de lípidos en los hepatocitos. Aquí, un espectro de métodos se presenta para caracterizar los fenotipos y los parámetros de la esteatosis hepática utilizando ratones DIO y hepatocitos primarios de ratón. ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	SAKURA	4583
Oil Red O	Sigma	O0625-25G
Infinity Triglycerides kit	Fisher Scientific	TR22421
Infinity Cholesterol kit	Fisher Scientific	TR13421
Collagen type I, Rat tail	Millipore	08-115
DMEM (low glucose)	Invitrogen	11885-092
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-122
FBS	Invitrogen	10099141
PBS	cellgro	R21-040-CVR
HBSS	cellgro	20-021-CV
Insulin	TOCRIS Bioscience	3435	dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose	Sigma	G8270-100G
Microscope	Olympus	BX53
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
10 cm cell culture dish	Corning	420167
6-well-plate	Corning	3516
BCA assay	Beyotime	P0010
Nuclear Magnetic Resonance	Niumag technology	MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS)	Research Diets	D12327