Análise otimizada de<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; A esteatose hepática

Resumo

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Resumo

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.

Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Introdução

A obesidade é um problema de saúde crescente em países desenvolvidos e em desenvolvimento. Tem sido relatada como sendo uma das condições coexistentes frequentemente associadas com doença hepática não-alcoólica (EHNA), com uma prevalência que varia entre 30 e 100 por cento em pacientes NAFLD ^1. Devido à forte correlação entre o fígado gordo e obesidade, obesos (DIO) modelos de rato induzida por dieta são amplamente usadas para estudar os mecanismos moleculares complexas associadas com o desenvolvimento de EHNA ^{2, 3, 4, 5, 6.} A esteatose hepática é o primeiro estágio de DHGNA, e pode evoluir para esteato-hepatite não alcoólica (NASH), cirrose, e, finalmente, câncer de fígado ^7. Portanto, o objetivo geral deste método é gerar modelos animais e celulares de condições com esteatose hepática e ao PROvide protocolos detalhados para a medição de lípidos eficiente e preciso. Estes modelos e medições são também úteis para a investigação de outros distúrbios metabólicos, tais como a resistência à insulina e diabetes tipo 2.

Como a obesidade é identificado como sendo um dos principais factores de risco para EHNA, um alto teor de gordura, alta-sacarose dieta (HFHS) que imita a dieta de alta gordura de estilo ocidental é utilizado para induzir obesidade em ratos. Subsequentemente, o grau de esteatose hepática pode ser avaliada utilizando métodos diferentes. Primeiro, o peso corporal e análise de composição corporal com ressonância magnética nuclear (RMN) mostra a acumulação de lípidos durante a alimentação. A massa de gordura e massa magra pode ser quantificado de um modo não-invasivo e em tempo real.

Além disso, a imagem por ressonância magnética (MRI) é usado para mostrar tanto a todo o organismo e a distribuição de gordura no fígado. O sinal de escala de cinzentos da análise de ressonância magnética pode ser convertido numa imagem de pseudo-cor legível, e a intensidade dea escala de cinza e cor é hemi-quantificáveis. Esta tecnologia proporciona vantagens únicas para a medição da acumulação de lípidos nos animais vivos. Segundo, a análise histológica do fígado é o método mais comummente utilizado para determinar a esteatose hepática. Hematoxilina e Eosina (H & E) Coloração histológica fornece informações, tais como a morfologia dos hepatócitos e infiltração de macrófagos, enquanto Oil Red O coloração mostra o tamanho e a posição das gotículas lipídicas em hepatócitos. Em terceiro lugar, a análise do conteúdo de lípidos utilizando extracção com clorofórmio / metanol é uma medida precisa e quantitativa de lípidos hepática. Os níveis totais de triglicérides e colesterol pode ser medido com métodos bioquímicos. Mais importante, a análise de extracção lipídica e Oil Red O coloração pode também ser usado em geneticamente manipuladas ou tratadas farmaceuticamente hepatócitos.

A vantagem do presente método é a sua utilização de várias abordagens optimizadas para gerar modelos de esteatose hepáticae caracterizar exaustivamente os fenótipos tanto in vivo como in vitro. Os modelos de ratos DIO pode recapitular a patologia e metabólicas fenótipos de doença hepática gordurosa humano. Outros parâmetros metabólicos em seres humanos pode ser replicado neste modelo bem ^8. A geração do modelo de hepatócitos esteatótica em resposta ao alto teor de glucose e insulina é eficiente, útil, e supera a limitação do trabalho caro e demorado rato. Tomados em conjunto, estes métodos são suficientes e é essencial para o estudo da disfunção lípidos hepática e resistência à insulina durante a sobrecarga de nutrientes.

Protocolo

Todos os protocolos experimentais com animais foram aprovados pelo comitê de cuidados com os animais e uso institucional do Instituto de Ciências da Nutrição, Instituto Xangai de Ciências Biológicas, da Academia Chinesa de Ciências (Xangai, China).

1. DIO Modelo rato

1. alimentação HFHS
   1. Alimente a oito semanas de idade, do sexo masculino camundongos C57BL / 6 com um HFHS que contém 40 kcal% de gordura e 40 kcal% de sacarose. Abrigá-los em 12 h condições do ciclo escuro de luz.
   2. Mantenha os ratos em estado dieta de alimentação HFHS de quatro a 16 semanas. Verifique semanalmente o peso corporal.
2. Análise de composição corporal e análise de imagem pseudo-color
   1. Sujeitar os ratos para uma análise de composição corporal analisador.
      1. Fixar ratos conscientes, não anestesiados num tubo de plástico no. Medir a massa de gordura corporal, massa magra, e fluidos usando um sistema de RMN, conforme descrito anteriormente ^2.
   2. Digitalizar todo o corpo de cada rato utilizando um sistema de ressonância magnética.
      1. Anestesiar os ratos com 1% Avertin através de injecção intraperitoneal (25 mL / g) e realizar a análise de imagens em tubos de vidro especializados.
         NOTA: O processo de imagiologia tem a duração de cerca de 0,5 h para cada rato. Quando a medição está concluída, retornar os ratos às suas gaiolas.
   3. Verificar todo o corpo dos ratos no dorsal, médio e camadas ventral; digitalizar o fígado na direcção vertical. Use um ímã 0,55 T e os seguintes parâmetros instrumentais: Espaço K = 192 x 256 mm, espessura de corte = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, e o número de scans = 8. Digitalizar usando a mesma condição magnética para todos os grupos de camundongos.
   4. Mapear a imagem em tons de cinza em uma imagem pseudo-cor de acordo com a intensidade do sinal ^9.
3. rato eutanásia
   1. esterilizar dissectiferramentas Ng, tais como pinça e tesouras.
   2. Despeje isoflurano suficiente sobre uma toalha de papel e deixar que o isoflurano volatilizar em um frasco de vidro. Assegure-se que os ratos são sacrificados pelo isoflurano.
   3. Corrigir os ratos numa mesa de operação. Spray de cada abdômen com 75% de etanol, fazer uma incisão na derme do apêndice xifóide usando uma tesoura, e desgaste da derme longitudinalmente através da linha média com as mãos para expor o peritônio.
   4. Prender o processo xifóide com uma pinça e cortar o peritoneu da largura através do fundo das nervuras para expor as vísceras.
   5. Recolha de sangue em tubos revestidos com EDTA por punção cardíaca.
   6. Cortar o diafragma ao longo do fígado e remova cuidadosamente o fígado dos enterocoelia usando uma tesoura fina. Corte três pedaços de tecido de fígado para as seguintes medições de lipidos: a) 6 x 3 x 3 mm para a coloração de H & E, b) 6 x 3 x 3 mm de Oil Red O coloração, e c) 20-40 mg de fígado de clorofórmio / extracção de metanol.
4. Coloração H & E
   1. Corrigir o fígado em 4% de acetato de formalina tamponada com fosfato a 4 ° C durante a noite e, em seguida, incorporá-lo em cera de parafina.
   2. Cortar secções de parafina (5 uM) e montá-los em lâminas de vidro para coloração com H @ E, conforme anteriormente descrito ^{3, 10.}
5. Oil Red O coloração
   1. preparação Regent
      1. Preparar solução de trabalho Oil Red O com formalina a 10%, isopropanol a 60%, de hematoxilina, e gelatina de glicerol. Dissolve-se 0,5 g de Oil Red O pó com 100 ml de isopropanol e aquecê-lo em um banho de 60 ° C para produzir uma solução stock a 0,5%.
      2. Dilui-se com água bidestilada _(ddH2O), a uma proporção de 3: 2 (3 mL de uma solução de estoque e 2 ml de _ddH2O). Filtra-se a solução de trabalho e deixar em repouso durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente.
   2. Incorporar o fígado na temperatura ideal de corte composto (OCT) em apcaixa de encaixe lastic. Congelá-lo a -20 ° C durante 30 min. Corte-o em seções 8 mícrons em micrótomo de congelação, montar o tecido em um slide, e colocá-lo à temperatura ambiente durante 30 min.
   3. Coloque uma toalha de papel no fundo de uma banheira de coloração e derramar uma pequena quantidade de formalina a 10% para molhar a toalha de papel. Coloque o slide na banheira de coloração e corrigir os cortes congelados em vapores de formaldeído por 5 min a 4 ° C.
   4. Mergulhe a lâmina em 60% isopropanol na banheira de coloração por 3 s; repetir uma vez.
   5. Adicionar algumas gotas de solução de trabalho de Oil Red O para o deslizamento para cobrir todos os tecidos e incubar durante 15 min. Proteger o tecido da luz à temperatura ambiente.
   6. Lave o slide na nova isopropanol 60% na banheira de coloração por 3 s; repetir duas vezes.
   7. Lave o slide através de água destilada duas vezes e remover a água em torno do tecido. Não se esqueça de secar o tecido.
   8. Coloque o slide em hematoxilina durante 1 min e lavar cuidadosamente com água da torneira durante 5-10min. Lave o slide em água destilada duas vezes e manter o que em água destilada até que esteja pronto para colocar sobre a lamela.
   9. Aquece-se a gelatina glicerol no micro-ondas e colocar várias gotas na parte superior do tecido. Delicadamente, coloque a lamela em cima e tomar cuidado para não formar bolhas.
   10. Observe a mancha sob um microscópio e capturar imagens característicos usando 20X e 40X objectivos.
6. Medição de lipidos do fígado
   1. Colocar o tecido de fígado dissecado em um novo tubo de centrífuga de plástico de 2 ml. Homogeneizar em 1 ml de PBS com um homogeneizador e transferir o lisado para um novo tubo de vidro de 15 ml.
   2. Adicionar 5 mL de clorofórmio / metanol (2:, 1 v / v) de solução, de vórtice a mistura vigorosamente durante 1 min, e deixar em repouso durante 2 horas em gelo.
   3. Centrifugar a 1.650 xg durante 10 min a 4 ° C; a mistura deve separar em 3 camadas: a camada superior de metanol, o disco proteína meio, eo clorofórmio fundo e lipídios.
   4. Tran sfer a fase inferior para um tubo de vidro de novo usando uma pipeta de Pasteur de vidro; não há necessidade de obter cada gota da fração inferior. Definir o tubo de lado no gelo.
   5. Adicionar 600 mL de 4 mM de _MgCl2 e 1,5 ml de clorofórmio para a fracção do sobrenadante a esquerda no tubo anterior e vortex vigorosamente. Incubar em gelo durante 30 minutos e centrifugar a 1650 xg durante 10 min a 4 ° C.
   6. Combine a fase de fundo com o tubo primeira fase inferior usando Pasteur pipeta. Descartar as camadas média e alta.
   7. Evapora-se o clorofórmio sob atmosfera de azoto num banho de 37 ° C. Lavar os lados dos tubos de vidro cuidadosamente com 200 uL de 1% de Triton X-100 / clorofórmio (v / v). Evaporar sob atmosfera de azoto. Dissolve-se o lípido com 200 uL de _ddH2O e vórtice bem para tornar a emulsão final.
   8. Medir a triglicéridos totais (TG) e colesterol (TC) níveis usando um kit de triglicéridos ou de colesterol de acordo com o protocolo do fabricantexref "> 3.
      NOTA: Os valores são normalizados de lípidos aos das concentrações de proteína no homogenato inicial, tal como determinado por quantificação de proteínas ^3.

2. principal do mouse Hepatócito Modelo

1. O isolamento de hepatócitos primários de rato
   1. Anestesiar cada rato com 6% de hidrato de cloral (10 mL / g por via intraperitoneal).
   2. Isolar hepatócitos primários, como previamente descrito ^10. Cresça as células em lamelas de vidro revestidas com colagénio de uma placa de 6 poços para Oil Red O coloração. Para extracção de lípidos, semear as células numa placa de cultura celular de 10 cm ^10.
2. Tratamento com células e Oil Red O coloração
   1. Substituir o meio com 2 ml de meio de privação e incubar a 37 ° C durante 24 h. Trate-o com glucose 30 mM e 100 nM de insulina. Incubar em que uma temperatura de 37 ° C incubadora de cultura durante 24 h.
   2. Aspirar o meio. Adicionar 2 mL de PBS e agite cuidadosamente para lavar o material; repetir uma vez.
   3. Fixar a lamela para o slide com um elástico. Expor as células aderentes à superfície do lado de fora. Realizar a coloração de Vermelho de Óleo O, conforme descrito acima (passo 1.5).
      NOTA: Os níveis basais de acumulação de lípidos são estimuladas com um elevado teor de glucose, mais tratamento com insulina após privação de soro. As gotas de lípidos são visualizadas por coloração com Oil Red O.
3. Medição de lípidos
   1. Tratar os hepatócitos com alto teor de glucose e insulina no mesmo estado (passo 2.2.1). Adicionar 1 mL de PBS a cada placa de cultura celular de 10 cm. Raspar as células e colhem-los para novos tubos de vidro de 15 ml, a partir do qual se alíquotas de 100 ul são transferidos para tubos frescos de 1,5 ml para a quantificação de proteína.
   2. Adicionar 4 ml de clorofórmio / metanol (2: 1, v / v) para os restantes 900 ul de células. Sonicate por aproximados 20 sinais sonoros e, em seguida, vortex vigorosamente para liberaro lípido nas células. Incubar a mistura em gelo durante 2 h. Realizar a extração de lipídios (passo 1.6).

Resultados

Como mostrado na Figura 1A, o peso do corpo do rato foi aumentada para 45 ± 1,2 g depois de 16 semanas de alimentação HFHS, que é aproximadamente 1,5 vezes maior do que o grupo de dieta de comida de alimentação. A análise de RMN da composição corporal que mostra a massa de gordura e massa magra de ratos são indicados (Figura 1B). As distribuições de gordura do corpo inteiro e do fígado foram determinados por ressonância magnética e imagens...

Discussão

Esteatose hepática é uma série de doenças do fígado progressivas que está associado com o síndrome metabólico, a obesidade, resistência à insulina, ou diabetes mellitus tipo 2 (DM2) ^11. A marca da DHGNA é esteatose, a acumulação de lípidos nos hepatócitos. Aqui, um espectro de métodos é apresentada para caracterizar os fenótipos e parâmetros de esteatose hepática utilizando ratinhos DIO e hepatócitos primários de rato. Este procedimento pode ser útil para elucidar os mecani...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	SAKURA	4583
Oil Red O	Sigma	O0625-25G
Infinity Triglycerides kit	Fisher Scientific	TR22421
Infinity Cholesterol kit	Fisher Scientific	TR13421
Collagen type I, Rat tail	Millipore	08-115
DMEM (low glucose)	Invitrogen	11885-092
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-122
FBS	Invitrogen	10099141
PBS	cellgro	R21-040-CVR
HBSS	cellgro	20-021-CV
Insulin	TOCRIS Bioscience	3435	dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose	Sigma	G8270-100G
Microscope	Olympus	BX53
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
10 cm cell culture dish	Corning	420167
6-well-plate	Corning	3516
BCA assay	Beyotime	P0010
Nuclear Magnetic Resonance	Niumag technology	MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS)	Research Diets	D12327