ניתוח אופטימלי של<em&gt; In vivo</em&gt; ו<em&gt; במבחנה</em&gt; כבדית steatosis

Summary

Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.

Abstract

Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.

Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.

Introduction

השמנה היא בעיה בריאותית המתפתחת במדינות מפותחות ומתפתחות. זה כבר דווח להיות אחד מחלות רקע קשורה לעיתים קרובות עם מחלת כבד שומני לא אלכוהולי (NAFLD), עם שכיחות הנע בין 30 ל -100 אחוזים בחולים NAFLD ^1. בשל הקשר החזק בין כבד שומני והשמנה, שמנים-induced דיאטה (DIO) במודלים של עכברים נמצאים בשימוש נרחב כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים מורכבים הקשורים בפיתוח NAFLD ^{2, 3, 4, 5, 6.} Steatosis כבדיה היא השלב המוקדם של NAFLD, וזה יכול להתקדם steatohepatitis אלכוהולי (NASH), שחמת כבד, ובסופו של דבר, סרטן כבד ^7. לכן, המטרה הכוללת של שיטה זו היא ליצור מודלים של בעלי חיים ותא של תנאי steatotic בכבד ל- PRפרוטוקולי ovide מפורטים למדידת שומנים יעילה ומדויקת. מודלים ומדידות אלה שימושיים גם עבור החקירה של הפרעות מטבוליות אחרות, כגון עמידות לאינסולין וסוכרת מסוג 2.

כפי מזוהה שמן להיות אחד מגורמי הסיכון המרכזיים עבור NAFLD, א-שומן גבוה, סוכרוז דיאטה (HFHS) המחקה את הדיאטה עתיר שומן בסגנון המערבי משמשת לגרום להשמנה בעכברים. בהמשך לכך, מידת steatosis הכבד ניתן להעריך באמצעות שיטות שונות. ראשית, משקל הגוף וניתוח הרכב הגוף עם תהודה מגנטית גרעינית (NMR) להראות את הצטברות השומנים במהלך שעת ההאכלה. מסת שומן המסה רזה ניתן לכמת באופן פולשני בזמן אמת.

בנוסף, הדמיה בתהודה מגנטית (MRI) משמשת כדי להראות הוא את הגוף ואת חלוקת הכבד של שומן. האות בגווני אפור של ניתוח MRI ניתן להמיר תמונה פסאודו צבע קריא, ואת עוצמתאת הגוון האפור והצבע הוא חם לכימות. טכנולוגיה זו מספקת יתרונות ייחודיים למדידת הצטברות שומנים בבעלי חיים. שנית, ניתוח היסטולוגית של הכבד הוא השיטה הנפוצה ביותר כדי לקבוע steatosis בכבד. מכתים Hematoxylin ו Eosin (H & E) מספק מידע היסטולוגית, כגון מורפולוגיה hepatocyte וחדירה מקרופאג, בעוד מכתים האדום O שמן מראה את הגודל והמיקום של טיפות השומנים ב hepatocytes. שלישית, ניתוח תוכן השומנים באמצעות מיצוי כלורופורם / מתנול הוא מדידה מדויקת וכמותית של שומנים בכבד. רמות הטריגליצרידים והכולסטרול סה"כ ניתן למדוד עם שיטות ביוכימיות. חשוב לציין, ניתוח שאיבת שומנים מכתים האדום O שמן יכול לשמש גם מניפולציה גנטית או hepatocytes מטופלים pharmaceutically.

היתרון של השיטה הנוכחית הוא הניצול של גישות אופטימיזציה מרובות כדי ליצור מודלי steatotic כבדיםולאפיין את פנוטיפים הוא in vivo ו במבחנה מקיפה. המודלים העכבר DIO יכול לשחזר את פנוטיפים פתולוגיה מטבולית של מחלת כבד שומני האדם. פרמטרים מטבוליים אחרים בבני אדם ניתן לשכפל במודל זה, כמו גם ^8. הדור של מודל hepatocyte steatotic בתגובה גבוהה גלוקוז בתוספת אינסולין יעיל, שימושי, מתגבר על מגבלה של עבודה עכבר זמן רב ויקר. יחדיו, שיטות אלה מספיקות וחיוניים לחקר תפקוד ועמידות לאינסולין שומנים בכבדים במהלך עומס יתר מזין.

Protocol

כל פרוטוקולי הניסוי בבעלי החיים אושרו על ידי ועדת טיפול שימוש בבעלי חיים המוסדית במכון למדעי תזונה, המכונה שנחאי עבור מדעי ביולוגיה, האקדמיה הסינית למדעים (שנחאי, סין).

1. במודל עכבר DIO

1. האכלת HFHS
   1. להאכיל את העכברים שמונה שבועות בן זכר C57BL / 6 עם HFHS המכיל 40 שומן קלוריות% סוכרוז% 40 קלוריות. לשכן אותם 12 שעות בתנאי מחזור כהה אור.
   2. שמור על עכברים במצב דיאטה האכלה HFHS במשך ארבע עד שש עשרה שבועות. בדוק שבועון משקל גוף.
2. ניתוח הרכב הגוף ועל ניתוח התמונה פסאודו צבע
   1. נושא העכברים לניתוח מנתח הרכב הגוף.
      1. Secure מודע, עכברים הרדים לא בתוך שפופרת פלסטיק. מדוד את מסת השומן בגוף, מסת גוף רזה, ונוזלים באמצעות מערכת NMR, כפי שתואר לעיל ^2.
   2. סרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת MRI.
      1. להרדים את העכברים עם 1% Avertin באמצעות הזרקה הזרקה (25 μL / g) ולבצע ניתוח הדמיה צינורות זכוכית מיוחדים.
         הערה: תהליך ההדמיה נמשכת כמעט 0.5 שעות עבור כל עכבר. בסיום הבדיקה תושלם, להחזיר את העכברים לכלוב שלהם.
   3. סרוק את הגופים השלמים של עכברי גב, באמצע, ושכבות גחון; לסרוק את הכבד בכיוון האנכי. להשתמש במגנט 0.55 T והפרמטרים אינסטרומנטלי הבאים: שטח K = 192 x 256 מיקרומטר, עובי סעיף = 3 מ"מ, TE = 14.8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 מ"מ, FOVPhase = 100 מ"מ, ומספר סריקות = 8. סריקה באמצעות אותו המצב מגנטי עבור כל הקבוצות של עכברים.
   4. מפה את התמונה בגוונים האפורה על גבי תמונה פסאודו צבע בהתאם לאות בעצמה ^9.
3. המתת חסד עכבר
   1. לעקר dissectiכלי ng, כגון מלקחיים ומספריים.
   2. יוצקים isoflurane מספיק על מגבת נייר ולתת isoflurane לנדוף בתוך צנצנת זכוכית. ודא כי עכברים מומתים על ידי isoflurane.
   3. תקן העכברים על שולחן הניתוחים. ריסוס כל הבטן עם אתנול 75%, עושים חתך הדרמיס של תהליך xiphoid באמצעות מספריים, ולקרוע את הדרמיס לאורכו דרך קו האמצע עם הידיים כדי לחשוף את הצפק.
   4. הצמד את תהליך xiphoid עם מלקחיים לחתוך את לרוחב הצפק דרך התחתון של הצלעות לחשוף את הקרביים.
   5. איסוף דם צינורות מצופים EDTA על ידי לנקב לב.
   6. חותכים את הסרעפת לאורך הכבד ובזהירות להסיר את הכבד מן enterocoelia באמצעות מספריים בסדר. חותכים שלוש חתיכות של רקמת הכבד למדידות השומנים הבאים: א) 6 x 3 x 3 מ"מ עבור צביעת H & E, B) 6 x 3 x 3 מ"מ עבור מכתים O אדום שמן, ו- C) 20-40 מ"ג של הכבד עבור כלורופורם / מיצוי מתנול.
4. צביעת H & E
   1. תקן הכבד אצטט פורמלין 4% שנאגרו פוספט ב 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה ואז להטביע אותו שעוות פרפין.
   2. חותכים חלקים פרפין (5 מיקרומטר) ו הר להם על שקופיות זכוכית צביעת H & E, כפי שתואר לעיל ^{3, 10.}
5. מכתים שמן האדום O
   1. הכנת Regent
      1. כן פתרון עובד שמן האדום O עם 10% פורמלין, 60% isopropanol, Hematoxylin, וריבת גליצרול. ממיסים 0.5 גרם של אבקת O האדום שמן עם 100 מ"ל של isopropanol ומחממים אותו באמבט C 60 ° לעשות פתרון המניה 0.5%.
      2. לדלל עם מים מזוקקים פעמיים (DDH ₂ O) בכל 3: יחס 2 (3 מ"ל של פתרון המניות ו -2 מ"ל של DDH ₂ O). סנן את הפתרון עובד ולתת לעמוד במשך 10 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.
   2. שבץ הכבד בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (אוקטובר) מתחם apתיבת הטבעה lastic. להקפיא אותו ב -20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חותכים אותו לחלקים 8-מיקרומטר בתוך microtome מקפיא, הר רקמת בשקופית, ולמקם אותו בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
   3. מניחים מגבת נייר בתחתית גיגית מכתים לשפוך כמות קטנה של פורמלין 10% להרטיב מגבת נייר. מניחים את השקף באמבטיה מכתים ולתקן את הסעיפים קפוא אדי פורמלדהיד במשך 5 דקות ב 4 ° C..
   4. טובלים את השקופית isopropanol 60% באמבטיה מכתים עבור 3 s; לחזור פעם.
   5. הוסף כמה טיפות של תמיסת עבודה האדומה שמן O לשקופית כדי לכסות את כל רקמות דגירה במשך 15 דקות. הגן על הרקמות מפני אור בטמפרטורת חדר.
   6. יש לשטוף את שקופית isopropanol 60% החדשים באמבטיה המכתימה עבור 3 s; וחזור פעמיים.
   7. לשטוף בעדינות את והחלק דרך מים מזוקקים פעמיים ולהסיר את המים סביב הרקמה. הקפד לא לייבש את הרקמה.
   8. מניחים את השקף ב Hematoxylin דקות 1 ולשטוף בעדינות עם מי ברז למשך 5-10דקות. לשטוף בעדינות את השקף במים מזוקקים פעמיים ולשמור על אותו במים מזוקקים עד מוכן לשים על coverslip.
   9. חממו את ג'לי גליצרול במיקרוגל ומניחים כמה טיפות על גבי הרקמה. בעדינות במקום coverslip על גבי ולדאוג שלא ליצור בועות.
   10. שים את הכתם מתחת למיקרוסקופ ללכוד תמונות מאפיינות באמצעות מטרות 20X ו 40X.
6. מדידת שומנים בכבד
   1. מניחים את רקמת הכבד גזור צינור צנטריפוגות 2 מ"ל פלסטיק חדש. Homogenize ב 1 מ"ל של PBS עם homogenizer ולהעביר את lysate אל צינור זכוכית 15 מ"ל חדש.
   2. הוסף 5 מ"ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) פתרון, מערבולת את התערובת במרץ דקות 1, ולתת לעמוד במשך 2 שעות על הקרח.
   3. צנטריפוגה ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס; התערובת צריכה להתחלק 3 שכבות: שכבת מתנול העליונה, דיסק החלבון באמצע, ואת כלורופורם ושומנים התחתונים.
   4. טראן ספיר השלב התחתון לתוך צינור זכוכית חדש באמצעות pipet זכוכית פסטר; אין צורך לקבל כל טיפה של השבר התחתון. הגדר את הצינור בצד על קרח.
   5. להוסיף 600 μL של 4 מ"מ MgCl ₂ ו -1.5 מ"ל של כלורופורם לשבר supernatant עזב בצינור מערבולת הקודם במרץ. דגירה על קרח למשך 30 דקות ו צנטריפוגות ב 1,650 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
   6. מערבב את השלב התחתון עם צינור השלב התחתון הראשון באמצעות pipet פסטר. מחק את השכבות הגבוהות ובינוניות.
   7. לאדות את כלורופורם תחת גז חנקן באמבט 37 מעלות צלזיוס. שטפו את צידי צינורות זכוכית ביסודיות עם 200 μL של 1% Triton X-100 / כלורופורם (v / v). להתאדות תחת גז חנקן. ממיסים את השומנים עם 200 μL של DDH ₂ O ו מערבולת היטב כדי להפוך את תחליב הסופי.
   8. מדוד את הטריגליצרידים הכולל (TG) וכולסטרול (TC) רמות באמצעות ערכת טריגליצרידים או כולסטרול על פי פרוטוקול של היצרןXref "> 3.
      הערה: ערכי השומנים הם מנורמלים לאלה של ריכוזי חלבון homogenate הראשוני, כפי שנקבעו על ידי חלבון כימות ^3.

2. דגם ראשונים העכבר Hepatocyte

1. בידוד של hepatocytes העיקרי העכבר
   1. להרדים כל עכבר עם 6% הכלורל-הידרט (10 μL / g intraperitoneally).
   2. לבודד hepatocytes העיקרי, כפי שתואר לעיל ^10. לגדל תאים על coverslips זכוכית מצופה קולגן צלחת 6-גם עבור מכתים O האדום השמן. להפקת שומנים בדם, זרע התאים על צלחת תרבית תאים של 10 סנטימטרים ^10.
2. טיפול בתאי והכתים O האדום השמן
   1. החלף בינוני עם 2 מ"ל של מדיום רעב לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. טפל בו עם 30 גלוקוז מ"מ ו -100 אינסולין ננומטר. דגירה זה תרבות חממת 37 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
   2. לשאוב את המדיום. הוסף 2 מ"ל של PBS ו מערבולת בעדינות כדי לשטוף את בינוני; לחזור פעם.
   3. תקן את coverslip לשקופית עם גומייה. לחשוף את התאים חסידים אל פני השטח החיצוניים. בצע את מכתים O האדום השמן כפי שתואר לעיל (שלב 1.5).
      הערה: רמות הבסיס של הצטברות שומנים הם מגורה עם טיפול גלוקוז בתוספת אינסולין גבוה לאחר רעב בסרום. טיפות השומנים הם דמיינו ידי מכתים שמן האדום O.
3. מדידת שומנים
   1. פנק את hepatocytes עם גלוקוז גבוה בתוספת אינסולין באותו המצב (שלב 2.2.1). הוסף 1 מ"ל של PBS על כל צלחת תרבית תאים של 10 ס"מ. לגרד את התאים למסוק אותם לתוך צינורות זכוכית חדש 15 מ"ל, שממנו aliquots של 100 μL מועברים צינורות 1.5 מ"ל טריים כימות חלבון.
   2. הוסף 4 מ"ל של כלורופורם / מתנול (2: 1, V / V) על 900 μL של התאים הנותרים. Sonicate במשך 20 צפצופים המשוער ולאחר מכן מערבולת במרץ לשחררהשומנים בתאים. דגירה את התערובת על קרח למשך 2 שעות. בצע את מיצוי השומנים (שלב 1.6).

תוצאות

כפי שניתן לראות בתרשים 1 א ', משקל גוף העכבר הוגדל ל 45 ± 1.2 גרם לאחר 16 שבועות של האכלת HFHS, וזה בערך פי 1.5 גבוה יותר מאשר קבוצת האכלת דיאטת צ'או. הרכב הגוף NMR ניתוחי מראה את מסת השומן ומסת רזה של עכברים מסומנים (איור 1B). התפלגויות השומן ...

Discussion

NAFLD היא סדרה של מחלות כבד מתקדמת אשר מזוהה עם תסמונת מטבולית, השמנה, עמידות לאינסולין, או סוכרת סוג 2 (T2DM) ^11. המאפיין העיקרי של NAFLD הוא steatosis, הצטברות של שומנים hepatocytes. הנה, קשת של שיטות מוצגת לאפיין את פנוטיפים ופרמטרים של steatosis בכבד באמצעות עכברי DIO ו hepatocytes הע...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
O.C.T compound	SAKURA	4583
Oil Red O	Sigma	O0625-25G
Infinity Triglycerides kit	Fisher Scientific	TR22421
Infinity Cholesterol kit	Fisher Scientific	TR13421
Collagen type I, Rat tail	Millipore	08-115
DMEM (low glucose)	Invitrogen	11885-092
Penicillin / Streptomycin	Invitrogen	15140-122
FBS	Invitrogen	10099141
PBS	cellgro	R21-040-CVR
HBSS	cellgro	20-021-CV
Insulin	TOCRIS Bioscience	3435	dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose	Sigma	G8270-100G
Microscope	Olympus	BX53
Peristaltic pump	Longerpump	BT100-2J
10 cm cell culture dish	Corning	420167
6-well-plate	Corning	3516
BCA assay	Beyotime	P0010
Nuclear Magnetic Resonance	Niumag technology	MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS)	Research Diets	D12327