Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Resumen

flexibilidad conformacional desempeña un papel crítico en la función de la proteína. En este documento, se describe el uso de la espectrometría de masas de ionización por electrospray resuelta en el tiempo junto con el intercambio de hidrógeno-deuterio para sondear los rápidos cambios estructurales que impulsan función en proteínas ordenadas y desordenadas.

Resumen

proteínas intrínsecamente desordenados (PDI) han sido durante mucho tiempo un reto para los biólogos estructurales debido a su falta de elementos de estructura secundaria estables. El hidrógeno-deuterio Exchange (HDX) medida en escalas de tiempo rápidas es especialmente adecuado para detectar estructuras y redes de enlaces de hidrógeno que están pobladas brevemente, lo que permite la caracterización de confórmeros transitorios en conjuntos nativos. El acoplamiento de HDX a espectrometría de masas ofrece varias ventajas clave, incluyendo una alta sensibilidad, bajo consumo de muestra y sin restricción en el tamaño de la proteína. Esta técnica ha avanzado mucho en las últimas décadas, incluyendo la capacidad de supervisar HDX tiempos de etiquetado en la escala de tiempo de milisegundos. Además, mediante la incorporación del flujo de trabajo HDX en una plataforma de microfluidos que aloja un microreactor proteasa ácida, somos capaces de localizar propiedades dinámicas en el nivel de péptido. En este estudio, resuelta en el tiempo de ionización por electrospray espectrometría de masas (tresi-MS) acoplado a HDX was utiliza para proporcionar una imagen detallada de la estructura residual en la proteína tau, así como los cambios conformacionales inducidos en la hiperfosforilación.

Introducción

Durante las últimas décadas, los avances se han hecho importantes en el desarrollo de técnicas analíticas diseñadas para medir la estructura de la proteína y la dinámica de ^{1, 2, 3, 4.} Mientras que la cristalografía de rayos X sigue siendo la herramienta principio para la determinación de la estructura de proteínas, se necesitan altas concentraciones de proteína y se requiere una amplia optimización para producir cristales de calidad de difracción. Las proteínas que son difíciles de cristalizar, tales como proteínas asociadas a la membrana y intrínsecamente desordenadas clásicamente se han estudiado por intercambio de hidrógeno-deuterio (HDX) RMN ^5. Sin embargo, en las últimas décadas, el acoplamiento de ionización por electrospray espectrometría de masas (ESI-MS) para HDX ha ganado rápidamente popularidad ^{6, 7.}

Espectrometría de masas ofrece una solucióna muchas de las restricciones planteados por cristalografía de rayos X y RMN. En particular, MS es altamente sensible (nM a concentraciones mu M se requiere), y prácticamente no hay límite en el tamaño de la proteína. Además, el ciclo de trabajo alto de análisis MS permite la posibilidad de estudiar proteínas que sean sometidos a rotación enzimática, mal plegamiento, formación de complejos y otros procesos biológicamente relevantes. Estos procesos ocurren a menudo en el milisegundo a segunda escala de tiempo y requieren un mezclado rápido de los reactivos antes del análisis.

El desarrollo de resuelta en el tiempo de ionización por electrospray (tresi) por Wilson y Konermann en 2003 reacciones se permite monitorizar en tiempo real mediante la pseudo-ESI-MS. Su configuración incorpora un mezclador capilar con un volumen de cámara de reacción continuamente ajustable ^8. El dispositivo consta de dos capilares concéntricos, con el capilar interior sellado y una muesca cortada en su lado para permitir la mezcla dentro de la estrecha inter-capillary el espacio de la muesca en el extremo del capilar interior (típicamente 2 mm). Cuando se aplica a experimentos HDX, el capilar interior lleva la proteína de interés, el capilar exterior lleva el etiquetado _D2O solución, que sufre a continuación la mezcla con la proteína antes de entrar en la cámara de reacción ajustable que permite para el etiquetado HDX antes de la transferencia directa en el ESI fuente.

Brevemente, HDX se basa en hidrógenos amida de cadena principal sometidos a intercambio con átomos de deuterio en solución ^{9, 10.} El intercambio es catalizada por bases a pH fisiológico, con ácido-catálisis convertirse en predominante a pH por debajo de aproximadamente 2,6. La tasa de cambio se basa en cuatro factores principales: pH, temperatura, disolvente accesibilidad y de enlace de hidrógeno intramolecular. Como los dos primeros factores se mantienen constantes durante todo el experimento, la tasa de cambio, en particular en las posiciones de amida del esqueleto peptídico, es principalmente dependent en la estructura de proteínas ^11. Bien doblado regiones con extensas redes de enlaces de hidrógeno, estables en alfa-hélices y láminas beta se llevará hasta deuterio a velocidades sustancialmente más lento en comparación con los bucles y las regiones desordenadas (y, a veces no en todos) ^12. Esto permite el análisis de proteína global, donde las perturbaciones en la estructura (por ejemplo., Sobre la agregación o de unión al sustrato) conducen a diferentes captación de deuterio (Figura 1).

El mezclador capilar cinética puede ser incorporado en una plataforma de microfluidos que contiene una cámara proteolítica para la localización de la captación de deuterio. Esta cámara proteolítica se lleva a cabo a pH bajo con el fin de apagar efectivamente la reacción de intercambio, y requiere una proteasa ácida inmovilizada con el fin de digerir la proteína en péptidos localizados (Figura 2). Supervisión de Exchange columna vertebral en milisegundos a escalas segunda vez es especialmente importante para lacaracterización de cambios conformacionales dentro de difícil caracterizar regiones de bucle, glóbulos fundidos, y proteínas intrínsecamente desordenadas (PDI) ^{13, 14.} Alternativamente, tresi-HDX también se puede utilizar para caracterizar las proteínas que actualmente no tienen una estructura atómica resuelto a través de los métodos de cristalografía de rayos X y RMN, usando intercambio de deuterio acoplado al algoritmo de COREX (DX-COREX) enfoque ^{15, 16.} Este protocolo detallado se aplicará tresi-HDX para estudiar tau, un desplazado interno, tanto en su forma nativa, así como su estado hiperfosforilada patógeno. Mientras que la TAU nativa es una de las PDI más bien estudiado, se sabe poco sobre su contraparte amiloidogénica ^13.

Protocolo

NOTA: Por favor, consultar a todas las hojas de datos de seguridad (MSDS) antes de usar. Los humos producidos por ablación con láser de poli (metacrilato de metilo) (PMMA) pueden ser tóxicos. Asegúrese de que el grabador láser está conectado a un sistema de ventilación de trabajo. Utilice todas las prácticas de seguridad adecuadas en la construcción del dispositivo microfluídico incluyendo el uso de los controles de ingeniería (campana de humos, contenedor de objetos punzantes) y el equipo de protección personal (gafas de seguridad, mascarilla, guantes, ropa de laboratorio, pantalones largos, zapatos cerrados). Es de suma importancia para usar cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) los reactivos de grado cuando sea posible, con todo ser de grado ACS o superior para disminuir los contaminantes que interfieren durante el análisis.

1. Preparación del dispositivo de microfluidos

1. La construcción de la plataforma de microfluidos PMMA
   1. Obtener un bloque PMMA estándar (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) y láser de ablación de un canal de entrada para la introducción de los reactivos, un proteolisis de cámara, y un canal de salida utilizando un grabador láser ^{17, 18.}
      NOTA: Etch la cámara de la proteolisis en una forma oval alargada (30 x 5 x 0,05 mm). El canal de entrada y de salida debe extenderse hasta el extremo del bloque de PMMA y ser mayor de 75 m de anchura y profundidad con el fin de acomodar un capilar de 30 ga.
   2. Cortar un acero inoxidable capilar de metal 30 ga en dos piezas de aproximadamente 10 cm cada uno utilizando una herramienta rotativa con un disco de corte 1/64" de espesor. Utilice papel de lija para suavizar los extremos de los capilares (esto puede facilitarse mediante la visualización bajo una microscopio de luz).
   3. Fundir los capilares en el poli grabado al agua fuerte (metacrilato de metilo) de bloque utilizando un soldador. El canal de entrada se conectará a bombas de jeringa automatizados, y el canal de salida se utiliza para el acoplamiento en la MS.
2. La construcción del mezclador Kinetic Resuelta en tiempo Flujo Continuo
   1. Obtener una fusionadocapilar de sílice de vidrio (ID: 75! m, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm, y la inserta en un acero inoxidable capilar de metal 28 ga de aproximadamente 15 cm. Dependiendo del tiempo de reacción requerido, usar un capilar de metal exterior más largo o uno con un ID más grande.
      NOTA: Determinar el diámetro interior 'verdadero' del capilar de metal es crítico para la obtención de tiempos de reacción precisas. Esto se puede hacer conectando el capilar de metal a una HPLC, que fluye disolvente aunque el capilar, y el registro de la presión de retorno. Una contrapresión para el cálculo del diámetro interior se puede hacer, y el verdadero diámetro interior del capilar de metal determinado. Esto se puede calcular usando el software Molecular Weight Calculator (para Windows Versión 6.49).
   2. Producir una muesca 2 mm utilizando la configuración grabador láser de baja potencia en un extremo del capilar de vidrio interior y sellar este extremo del capilar de vidrio interior (Figura 2). Alternativamente, hacer la muesca usando un capilar de vidrio cerámicoherramienta de corte Y o un molino rotatorio con una cuchilla de corte fino.
   3. Line-up el capilar de vidrio interior con el extremo del capilar de metal (esto se puede facilitar mediante la visualización bajo un microscopio de luz).
   4. Fije este mezclador cinética a un extremo de la te de mezcla (Figura 2).
   5. Adjuntar un capilar fundido de vidrio de sílice (ID: 75! M, OD: 150 m) de aproximadamente 40 cm hasta el extremo opuesto de la mezcladora cinética en la te de mezcla. Esto se utiliza para entregar ácido (ácido acético al 5%, pH 2,4) para extinguir la reacción.
      NOTA: Los reactivos se suministran al dispositivo con jeringas de gas hermética a través de un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) usando bombas de infusión automatizadas.
3. La activación de la pepsina
   1. Pesar 20 mg de pepsina de mucosa gástrica porcina y suspenderlo en 1 ml de tampón de acoplamiento (fosfato sódico 0,1 M, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
   2. Pesar 50 mg de N-hidroxisuccinimida (NHS) perlas de agarosa activados por, añadir a la re-sproteasa uspended y gire suavemente durante la noche a 4 ° C.
   3. Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina.
   4. Aspirar la proteasa no unido.
   5. Incubar la agarosa en 1 ml de tampón de bloqueo (1 M Tris-HCl, pH 6,0) y gire suavemente a temperatura ambiente durante 1 h.
   6. Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min a temperatura ambiente para recoger la resina.
   7. Aspirar el tampón de bloqueo.
   8. Incubar la pepsina-agarosa con ácido acético 1 ml de 5%, pH 2,4 durante 5 min.
   9. Centrifugar a 1.000 xg durante 2 min para recoger la resina.
   10. Aspirar el sobrenadante.
   11. Repita los pasos 1.3.8 - 1.3.10 para un total de tres lavados.
   12. Almacenar las perlas en 1 ml de ácido acético a 4 ° C para su uso a largo plazo.
4. Asamblea dispositivo
   1. Llene la cámara de la proteolisis con la suspensión de perlas de pepsina-agarosa activadas en ácido acético al 5% usando una espátula estéril.
   2. Coloque el platfor microfluidos PMMAm en entre dos bloques de PMMA en blanco como una cubierta para sellar el dispositivo, revestido con caucho de silicona para crear un sello estanco a los líquidos.
   3. Usar placas de sujeción metálico a la presión de sellado en el dispositivo.
      NOTA: La abrazadera fue hecho a medida con el fin de adaptarse a la plataforma de microfluidos y se compone de dos placas de medición 10.1 cm x 7.4 cm x 1.2 cm.
   4. El flujo de ácido acético al 5%, pH 2,4 a una velocidad de 10 l / min. El flujo mM de tampón de acetato de amonio 50 (pH 6,9), aunque la línea de proteína a una velocidad de 1 l / min.
      NOTA: Es muy importante que el ácido acético fluye continuamente a través del dispositivo a lo largo de la totalidad del experimento. Asegúrese de que no hay fugas y que el fluido está saliendo sólo desde el canal de salida, que servirá como la fuente ESI.
   5. Acoplar el dispositivo al extremo frontal de un espectrómetro modificado cuadrupolo tiempo de vuelo (Q-TOF) de masas usando una fase aislamiento ajustable para conseguir condiciones de electrospray óptimos.
      NOTA: Un interruptor de derivaciónse introduce con el fin de simular la presencia de una fuente ESI comercial. ¹⁷

2. Intercambio de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio resuelta en el tiempo

1. Adquisición de pepsina y Proteína Sólo Spectra
   NOTA: adquisición ESI-MS se lleva a cabo en el modo de ion positivo con un voltaje de 4.500 hasta 5.000, 60-V potencial desagrupación, y 250-V potencial de enfoque. Los espectros se adquirieron en un intervalo de 350-1,500 m / z con una velocidad de barrido de 1 s ^-1.
   1. Adquirir una única espectro de pepsina. Cualquier picos que aparecen en este espectro se restan una vez que se añade la proteína.
   2. Introducir 50-100 M tau / proteína fosfo-tau (purificar y preparar como se ha descrito previamente ^{13, 19)} a una velocidad de 1 l / min en el que el tampón de acetato de amonio 50 mM fluía anteriormente.
   3. Adquirir una proteína única espectro.
2. adquisición oPuntos f Tiempo
   1. Mientras que la proteína 100 M tau / fosfo-tau está fluyendo a 1 l / min, introducir D ₂ O a una velocidad de 3 l / min a través de un conector tee y dejar reaccionar en el mezclador cinética. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min antes de la adquisición del espectro.
      NOTA: Después del intercambio, la reacción de marcaje se inactiva por el flujo de pH ácido acético 2,4 a 10 l / min y la digestión de la proteína marcada se produce en la cámara proteolítica.
   2. Con el fin de aumentar el tiempo de etiquetado, manualmente tire hacia atrás de la posición del capilar de vidrio interior para lograr tiempos de 42 ms de mezcla a 8 s. Permitir que el sistema se equilibre durante al menos 10 min entre cada pull-back.

3. Los datos y análisis estadístico

1. La identificación de péptidos y calculando el porcentaje de deuterio intercambio
   1. Realizar análisis de espectros de MS utilizando el software mMass, versión 5.5.0 ²⁰ .
   2. Identificar péptidos utilizando el servidor de proteómica ExPASy FindPept y confirmar por disociación inducida por colisión (CID) cuando se requiera ^21.
      NOTA: Aquí, la incorporación de deuterio absorción se midió utilizando un software FORTRAN en-casa desarrollado para el análisis de distribución isotópica ^{22, 23.}
   3. Calcular las tasas intrínsecas teóricos basados en la secuencia primaria mediante la herramienta web SPHERE ^{22, 24.}
   4. Ajustar los datos usando regresión no lineal exponencial único y normalizar usando una gráfica y software estadístico (por ejemplo, SigmaPlot).
      NOTA: La relación de k _int / k _obs produce el Factor de Protección (PF), una medida semi-cuantitativa del grado de que una región particular, está estructurado dentro del conjunto conformacional.

Resultados

perfiles de digestión de nativo y fosfo-tau fueron similares, produciendo una secuencia de cobertura de 77,1 y 71,7%, respectivamente. valores de captación de deuterio de cada péptido se determinó mediante el ajuste de las distribuciones isotópicas observadas con las distribuciones teóricas generadas usando un software FORTRAN de desarrollo propio. Las mejores distribuciones de ajuste se muestran (Figura 3a), junto con los valores de captación de deuterio asociado...

Discusión

Mientras que los métodos de biología estructural, tales como cristalografía de rayos X y RMN son ventajosos porque proporcionan estructuras extremadamente detalladas de proteínas, estas imágenes son a menudo estática. La caracterización de las especies transitorias y dominios débilmente estructurados sigue siendo difícil de alcanzar cuando se estudió por estos métodos convencionales. Por lo tanto, con el fin de obtener una visión dinámica de este tipo de sistemas es importante trabajar a escalas de tiempo r...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(methyl methacrylate) or PMMA	Professional Plastics	SACR.250CCP	8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary	Polymicro Technologies	106815-0018	ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal Capillaries	McMaster-Carr	28 ga – 89875K97 30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing	IDEX	1477 1548	ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter	IDEX	A-327	for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee	IDEX	M-540	for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore	Valco Instruments Co., Inc. (VICI)	ZT1C	for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing	IDEX	P-727
10-32 Female to Female Luer	IDEX	P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut	IDEX	F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing	IDEX	F-142
100 Series Rotary Tool	Dremel	F013010001
Cut-Off Discs	Jobmate		1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope	Fisher Scientific	12-563-411
Soldering Iron	Mastercraft	58-6301-2
VersaLaser	Universal Laser
Syringes	Hamilton	81220	500 µL capacity
Syringe Pumps	Harvard Apparatus	70-4501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose	Fisher Scientific	26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P6887-250MG
Deuterium Oxide	Sigma-Aldrich	151882-10X0.6ML
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092-100ML
HPLC Grade Water	Fisher Scientific	W5-4
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	A7330-500G
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	S369-500
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S671-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3	Corel
Molecular Weight Calculator		Version 6.49	Open Source MS Tool
mMass		Version 5.5.0	Open Source MS Tool
ExPASy FindPept	Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot	Systat Software	Version 11.0
PyMOL	Schrödinger	Version 1.5.0.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer	AB SCIEX