Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch-Massenspektrometrie zur Struktur Protein Studium und Dynamik

Zusammenfassung

Konformationsänderungen Flexibilität spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfunktion. Hier beschreiben wir die Verwendung von zeitaufgelöster Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie gekoppelt Wasserstoff-Deuterium-Austausch für die schnellen Strukturveränderungen Sondieren, die Funktion in geordneten und ungeordneten Proteinen treiben.

Zusammenfassung

Intrinsisch ungeordneten Proteine ​​(IDPs) sind seit langem eine Herausforderung an Strukturbiologen gewesen aufgrund ihres Mangels an stabilen Sekundärstrukturelemente. Wasserstoff-Deuterium-Austausch (HDX) bei schnellen Zeitskalen gemessen ist einzigartig geeignet Strukturen und Wasserstoffbindungsnetzwerke zu detektieren, die kurz aufgefüllt werden, so dass für die Charakterisierung von transienten Konformeren in nativer Ensembles. Die Kopplung von HDX Massenspektrometrie bietet mehrere Vorteile, darunter eine hohe Empfindlichkeit, geringe Probenverbrauch und ohne Beschränkung auf Proteingröße. Diese Technik hat sich stark in den letzten Jahrzehnten fortgeschritten, einschließlich der Fähigkeit HDX Kennzeichnungszeiten auf der Millisekunden-Zeitskala zu überwachen. Zusätzlich wird durch den HDX Workflow auf einer mikrofluidischen Plattform enthält eine saure Protease Mikroreaktor-Gehäuse, sind wir dynamischen Eigenschaften bei der Peptidebene lokalisieren können. In dieser Studie, zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations-Massenspektrometrie (Tresi-MS), die mit HDX was verwendet, um ein detailliertes Bild von Reststruktur in dem Tau-Protein zur Verfügung zu stellen, sowie die Konformationsänderung auf Hyperphosphorylierung induzierten Verschiebungen.

Einleitung

In den letzten Jahrzehnten haben bedeutende Fortschritte bei der Entwicklung von analytischen Techniken entworfen worden , um die Proteinstruktur und Dynamik ^{1, 2, 3, 4} zu messen. Während Röntgenkristallographie das Prinzip Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur, hohe Konzentrationen an Protein bleibt benötigt werden und umfangreiche Optimierung erforderlich Diffraktionsqualität Kristalle zu erzeugen. Proteine , die schwer zu kristallisieren, wie beispielsweise membranassoziiertes und intrinsisch ungeordneten Proteine klassisch durch Wasserstoff-Deuterium - Austausch (HDX) NMR ⁵ untersucht worden. Doch in den letzten Jahrzehnten Kopplung von Elektrospray - Ionisations - Massenspektrometrie (ESI-MS) zu HDX hat sich schnell an Popularität gewann ^{6, 7.}

Die Massenspektrometrie bietet eine Lösungzu viele der durch Röntgenkristallographie und NMR gestellt Einschränkungen. Insbesondere MS ist sehr empfindlich (nM bis uM Konzentrationen erforderlich), und es gibt praktisch keine Begrenzung für Proteingröße. Darüber hinaus ermöglicht die hohe Tastgrad von MS-Analyse der Möglichkeit von Proteinen zu studieren, wie sie enzymatischen Umsatz, misfolding, Komplexierung und andere biologisch relevante Prozesse unterzogen werden. Diese Prozesse treten häufig auf den von Millisekunden bis Sekunden Zeitskala und erfordern eine schnelle Vermischung von Reagenzien vor der Analyse.

Die Entwicklung des Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisation (Tresi) von Wilson und Konermann 2003 erlaubten Reaktionen in pseudo-Echtzeit durch ESI-MS überwacht werden. Ihre Einrichtung einen kapillaren Mischer mit einem stufenlos einstellbaren Reaktionskammervolumen ⁸ eingebaut. Die Vorrichtung besteht aus zwei konzentrischen Kapillaren, mit der inneren Kapillare abgedichtet und einer Kerbe in die Seite geschnitten zum Mischen innerhalb des engen inter Kapillarsystem zu ermöglicheny Raum von der Kerbe zu dem Ende der inneren Kapillare (typischerweise 2 mm). Wenn auf HDX Experimente angewandt, wobei die innere Kapillare das Protein von Interesse trägt, trägt die äußerte Kapillare die Kennzeichnung D ₂ O - Lösung, die dann mit dem Protein erfährt vermischt , bevor das einstellbare Reaktionskammer eintretenden zum Etikettieren von HDX ermöglicht vor dem direkten Transfer in die ESI Quelle.

Kurz gesagt, verlässt sich HDX auf Wasserstoffe Rückgrat Amid mit Deuteriumatomen in Lösung ^{9, 10} unterzogen Austausch. Der Austausch ist basenkatalysierte bei physiologischem pH-Wert, mit Säure-Katalyse bei pH 2,6 unter etwa verbreitet zu werden. Der Wechselkurs basiert auf vier Hauptfaktoren: pH, Temperatur, Lösungsmittelzugänglichkeit und intramolekulare Wasserstoffbindung. Da die ersten beiden Faktoren konstant während des gesamten Versuchs gehalten werden, ist der Wechselkurs, insbesondere bei Peptidgerüst Amid Positionen, in erster Linie dependent auf die Proteinstruktur ^11. Dicht Regionen gefaltet mit umfangreichen, stabilen Wasserstoffbrücken - Netzwerken in α-Helices und β-Faltblätter werden Deuterium bei wesentlich geringeren Geschwindigkeiten im Vergleich zu Schleifen und ungeordneten Bereiche (und manchmal gar nicht) ¹² aufzunehmen. Dies ermöglicht eine globale Proteinanalyse, in den Störungen in der Struktur (z. B. bei der Aggregation oder Substratbindung) führen zu unterschiedlicher Deuterium Aufnahme (Abbildung 1).

Die kinetischen kapillaren Mischer können in eine Mikrofluidik-Plattform integriert werden, um eine proteolytische Kammer für die Lokalisierung der Deuterium-Aufnahme enthält. Diese proteolytische Kammer wird bei niedrigem pH - Wert gehalten , um effektiv die Austauschreaktion zu auslöschen, und erfordert eine immobilisierte Säure - Protease, um das Protein in lokalisierte Peptide (Abbildung 2) zu verdauen. Überwachung Backbone Austausch in Millisekunden bis Sekunden Zeitskalen ist besonders wichtig für dieCharakterisierung von Konformationsänderungen innerhalb schwierig Schleifenregionen, geschmolzene Kügelchen und intrinsisch ungeordnete Proteine (IDPs) ^{13, 14} zu charakterisieren. Alternativ kann Tresi-HDX auch Proteine verwendet werden , zu charakterisieren , die derzeit keine gelöste Atomstruktur durch die Verfahren der Röntgenkristallographie und NMR haben, Deuterium - Austausch mit dem COREX - Algorithmus gekoppelt unter Verwendung von (DX-COREX) Ansatz ^{15, 16.} Dieses detaillierte Protokoll Tresi-HDX gilt tau zu studieren, ein IDP, sowohl sie als auch nativer Form ist, wie es pathogen hyperphosphorylated Zustand. Während einheimischer tau eine der gut untersucht IDPs ist, ist nur wenig über sein amyloidogenen Gegenstück ¹³ bekannt.

Protokoll

HINWEIS: Wenden Sie sich alle relevanten Sicherheitsdatenblätter (MSDS) vor dem Gebrauch. Fumes hergestellt durch Laserablation von Poly (methylmethacrylat) (PMMA) können toxisch sein. Achten Sie darauf, dass der Laser-Graveur an eine funktionierende Lüftungsanlage angeschlossen ist. Verwenden Sie alle geeigneten Praktiken Sicherheit bei der Mikrofluidik-Vorrichtung des Aufbau einschließlich der Verwendung von technischen Kontrollen (Dunstabzug, Behälter für spitze Gegenstände) und persönlicher Schutzausrüstung (Schutzbrille, Gesichtsmaske, Handschuhe, Kittel, in voller Länge Hosen, geschlossene Schuhe). Es ist von größter Bedeutung High Performance Liquid Chromatography (HPLC) grade Reagenzien, wann immer möglich zu verwenden, mit allen Sein von ACS-Qualität oder höherer störende Verunreinigungen während der Analyse zu verringern.

1. Herstellung der mikrofluidischen Vorrichtung

1. Der Bau der PMMA Mikrofluidik-Plattform
   1. Erhalten, die einen Standard-PMMA-Block (8,9 x 3,8 x 0,6 cm) und Laser-Ablatieren einen Eingangskanal zum Einführen des Reaktionsteilnehmers, ein proteoLysekammer und ein Ausgangskanal mit einem Laser-Graveur ^{17, 18} verwendet wird .
      HINWEIS: Ätzen der Proteolyse Kammer in einer länglichen ovalen Form (30 x 5 x 0,05 mm). Der Eingangs- und Ausgangskanal zu dem Ende der PMMA-Blöcke erstrecken muss und nicht größer als 75 & mgr; m sowohl in der Breite und Tiefe, um eine 30 ga Kapillare aufzunehmen.
   2. Geschnitten, um ein 30 GA Edelstahlmetall Kapillare in zwei Stücke von etwa 10 cm je ein Drehwerkzeug mit einer 1/64" dick abgeschnittenen Scheibe zu ermitteln. Ein Schleifpapier um die Ende der Kapillaren zu glätten (dies kann durch Betrachten unter a erleichtert werden, Lichtmikroskop).
   3. Schmelzen die Kapillaren in die geätzten Poly (methylmethacrylat) block mit einem Lötkolben verwendet wird. Der Eingangskanal wird auf automatisierte Spritzenpumpen angeschlossen werden, und der Ausgabekanal wird zur Kopplung in die MS verwendet werden.
2. Der Bau der Durchlaufzeitaufgelöste Kinetic Mixer
   1. Besorgen Sie sich einen fusioniertenQuarzglas-Kapillare (ID: 75 & mgr; OD: 150 & mgr; m) von etwa 40 cm, und sie in eine Edelstahlmetall Kapillare 28 GA von etwa 15 cm ein. In Abhängigkeit von der Reaktionszeit erforderlich ist, verwenden Sie einen längeren äußeren Metall Kapillare oder eines mit einer größeren ID.
      HINWEIS: Die Ermittlung der ‚wahre‘ Innendurchmesser der Metallkapillare ist entscheidend für eine genaue Reaktionszeiten zu erhalten. Dies kann durch Anbringen der Metallkapillare an eine HPLC durchgeführt werden, fließt Lösungsmittel obwohl die Kapillare, und Aufzeichnen der Rückdruck. Ein Gegendruck zu Innendurchmesser Berechnung kann gemacht werden, und das wahre Innendurchmesser des Metall Kapillare bestimmt. Dies kann die Molecular Weight Calculator Software berechnet werden (für Windows Version 6.49).
   2. Erzeugt eine 2 mm Kerbe unter Verwendung niedrigen Strom Laserengraver Einstellungen an einem Ende des inneren Glaskapillare und verschließen dieses Ende der inneren Glaskapillare (Abbildung 2). Alternativ macht die Kerbe eine Glaskeramik Kapillarsystem mity Schneidwerkzeug oder ein Rotationsschleifer mit einem feinen Schneidklinge.
   3. Aufstellung der innere Glaskapillare mit dem Ende des Metall Kapillare (dies kann durch Betrachten unter einem Lichtmikroskop erleichtert werden).
   4. Befestigen diesen kinetischen Mischer an ein Ende der Misch - T (Abbildung 2).
   5. Anhänge einen Quarzglas-Kapillare (ID: 75 & mgr; OD: 150 & mgr; m) von etwa 40 cm zu dem gegenüberliegenden Ende des kinetischen Mischer auf dem Misch-T. Dies wird verwendet, Säure (5% Essigsäure, pH 2,4) zu liefern, um die Reaktion abzuschrecken.
      HINWEIS: mit automatisierten Infusionspumpen Reaktanten werden auf das Gerät mit gasdichten Spritzen durch Polytetrafluorethylen (PTFE) -Schlauch geliefert.
3. Pepsin-Aktivierung
   1. Abwiegen 20 mg Pepsin aus Schweine Magenschleimhaut und suspendieren sie in 1 ml Kopplungspuffer (0,1 M Natriumphosphat, 0,15 M NaCl, pH 6,0).
   2. Man wiegt 50 mg N - Hydroxysuccinimid (NHS) -aktivierten Agaroseperlen, fügt die Re-suspended Protease und dreht sanft über Nacht bei 4 ° C.
   3. Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln.
   4. Absaugen ungebundene Protease.
   5. Inkubiere die Agarose in 1 ml Blockierungspuffer (1 M Tris-HCl, pH 6,0) und drehen sich sanft bei Raumtemperatur für 1 h.
   6. Spin down bei 1000 × g für 2 min bei Raumtemperatur um das Harz zu sammeln.
   7. Absaugen Blockierungspuffer.
   8. Inkubiere die Pepsin-Agarose mit 1 ml 5% Essigsäure, pH 2,4 für 5 min.
   9. Spin down bei 1000 × g für 2 min, um das Harz zu sammeln.
   10. Den Überstand aspirieren.
   11. Wiederholen Sie die Schritte 1.3.8 - 1.3.10 für insgesamt drei Wäschen.
   12. Lagern Sie die Beads in 1 ml Essigsäure bei 4 ° C für die langfristige Nutzung.
4. Vorrichtungsaufbau
   1. Füllen der Proteolyse Kammer mit der Aufschlämmung aus aktiviertem Pepsin-Agarosekügelchen in 5% Essigsäure einen sterilen Spatel verwendet wird.
   2. Legen Sie die PMMA mikrofluidischen platform zwischen zwei Leer PMMA-Blöcke als Abdeckung der Vorrichtung abzudichten, gefüttert mit Silikonkautschuk eine flüssigkeitsdichte Abdichtung zu schaffen.
   3. Verwenden metallische Klemmplatten zu Druckdichtung der Vorrichtung.
      HINWEIS: Die Klemme wurde speziell hergestellt, um die mikrofluidische Plattform zu passen, und besteht aus zwei Platten messen 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm.
   4. Strom 5% Essigsäure, pH 2,4 bei einer Rate von 10 & mgr; l / min. Fließ 50 mM Ammoniumacetat-Puffer (pH 6,9), obwohl die Protein-Linie mit einer Rate von 1 & mgr; l / min.
      HINWEIS: Es ist äußerst wichtig, dass die Essigsäure in der Gesamtheit des Experiments durch die Vorrichtung kontinuierlich fließen. Sicherzustellen, dass keine Leckagen sind und daß die Fluid austritt nur aus dem Ausgangskanal, die als die ESI-Quelle dienen.
   5. Koppel die Vorrichtung mit dem vorderen Ende eines modifizierten Quadrupol-Time-of-Flight (Q-TOF) Massenspektrometers einer einstellbare isolierte Stufe unter Verwendung Elektrosprüh optimale Bedingungen zu erreichen.
      HINWEIS: Ein Bypass-Schalterwird eingeführt, um das Vorhandensein einer kommerziellen ESI-Quelle zu simulieren. ¹⁷

2. Zeitaufgelöste Elektrospray-Ionisations Wasserstoff-Deuterium-Austausch

1. Erwerb von Pepsin und Protein nur Spectra
   HINWEIS: ESI-MS Erfassung wird in positivem Ionen-Modus mit einer Spannung von 4500 bis 5000, 60-V Declustering Potential und 250 V-Fokussierungspotential durchgeführt. Spektren werden über einen Bereich von 350-1,500 m / z mit einer Abtastrate von 1 s ^-1 erworben.
   1. Erwerben Sie ein Pepsin nur Spektrum. Etwaige Spitzen in diesem Spektrum erscheinen, werden abgezogen, sobald das Protein zugegeben wird.
   2. Einführung von 50-100 uM tau / phospho-tau - Protein (reinigen und vorzubereiten , wie zuvor beschrieben , ^{13, 19)} mit einer Rate von 1 & mgr; l / min , wo die 50 mM Ammoniumacetat - Puffer zuvor fließt wurden.
   3. Erwerben Sie ein Protein nur Spektrum.
2. Acquisition of Zeitpunkte
   1. Während 100 uM tau / phospho-tau - Protein fließt bei 1 & mgr; l / min, D ₂ O mit einer Rate von 3 & mgr; l / min über einen T - Verbinder einzuführen und ermöglichen , in dem kinetischen Mischer zu reagieren. Man läßt das System für mindestens 10 min vor dem Erwerb des Spektrums äquilibrieren.
      HINWEIS: Nach dem Austausch wird die Markierungsreaktion durch die Strömung von Essigsäure pH 2,4 bei 10 & mgr; l / min und der Verdauung des markierten Proteins erfolgt in der proteolytischen Kammer abgeschreckt wird.
   2. Um die Markierung der Zeit zu erhöhen, ziehen manuell die Position der inneren Glaskapillare zurück zu erreichen Zeiten von 42 ms bis 8 s zu mischen. Man lässt das System für mindestens 10 min äquilibrieren zwischen jedem pull-back.

3. Daten und statistische Analyse

1. Identifizierung von Peptiden und Berechnung der Prozentsatz der Deuterium-Austausch
   1. Führen Sie MS - Spektren analysiert mit mMass Software, Version 5.5.0 ²⁰ .
   2. Peptide , die die Identifizierung ExPASy Proteomics - Server FindPept und bestätigen durch kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) , wenn ²¹ erforderlich.
      HINWEIS: Hier wurde Deuterium Aufnahme Inkorporation gemessen , um eine in-house entwickelte Fortran - Software für die Isotopenverteilungsanalyse ^{22, 23} verwendet wird .
   3. Berechne die theoretischen intrinsischen Raten auf der Grundlage der Primärsequenz des Web - Tool unter Verwendung KUGEL ^{22, 24.}
   4. Passen , die Daten einzelne exponentielle nichtlineare Regression unter Verwendung von und normalisieren eine Visualisierungs- und statistische Software (zB SigmaPlot).
      HINWEIS: Das Verhältnis von k _int / k _obs ergibt den Schutzfaktor (PF), ein semi-quantitatives Maß für den Grad , dass eine bestimmte Region innerhalb des Konformationsensembles strukturiert ist.

Ergebnisse

Verdauung Profile von nativen und Phospho-tau waren ähnlich, die jeweils eine Sequenz von 77,1 Abdeckung und 71,7% erhalten wird. Deuterium Aufnahmewerte jedes Peptids wurde durch Anpassen der beobachteten Isotopenverteilungen mit den theoretischen Verteilungen unter Verwendung einer Software im Hause entwickelten FORTRAN erzeugt wird, bestimmt. Die am besten passenden Verteilungen werden (Abbildung 3a) gezeigt , zusammen mit den zugehörigen Deuterium Aufnahmewerten. U...

Diskussion

Während der Strukturbiologie Methoden wie die Röntgenkristallographie und NMR vorteilhaft sind, weil sie äußerst detaillierte Strukturen von Proteinen liefern, sind diese Bilder oft statisch. Die Charakterisierung von transienter Spezies und schwach strukturierter Domänen weiterhin schwer sein, wenn sie von diesen herkömmlichen Verfahren untersucht. Deshalb, um dynamische Erkenntnisse über diese Art von Systemen zu gewinnen, ist es wichtig, bei schnellen Zeitskalen zu arbeiten. Wir haben erfolgreich angewandt Tre...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Poly(methyl methacrylate) or PMMA	Professional Plastics	SACR.250CCP	8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass Capillary	Polymicro Technologies	106815-0018	ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal Capillaries	McMaster-Carr	28 ga – 89875K97 30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) Tubing	IDEX	1477 1548	ID: 0.007”, OD: 1/16” ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing Cutter	IDEX	A-327	for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing Tee	IDEX	M-540	for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm Bore	Valco Instruments Co., Inc. (VICI)	ZT1C	for 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD Tubing	IDEX	P-727
10-32 Female to Female Luer	IDEX	P-659
10-32 PEEK Double-Winged Nut	IDEX	F-300
Ferrule for 1/16” OD Tubing	IDEX	F-142
100 Series Rotary Tool	Dremel	F013010001
Cut-Off Discs	Jobmate		1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom Microscope	Fisher Scientific	12-563-411
Soldering Iron	Mastercraft	58-6301-2
VersaLaser	Universal Laser
Syringes	Hamilton	81220	500 µL capacity
Syringe Pumps	Harvard Apparatus	70-4501
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
NHS-Activated Agarose	Fisher Scientific	26196
Pepsin from Porcine Gastric Mucosa	Sigma-Aldrich	P6887-250MG
Deuterium Oxide	Sigma-Aldrich	151882-10X0.6ML
Acetic Acid	Sigma-Aldrich	695092-100ML
HPLC Grade Water	Fisher Scientific	W5-4
Ammonium Acetate	Sigma-Aldrich	A7330-500G
Sodium Phosphate	Fisher Scientific	S369-500
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S671-3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software/Online Tools
CorelDraw X3	Corel
Molecular Weight Calculator		Version 6.49	Open Source MS Tool
mMass		Version 5.5.0	Open Source MS Tool
ExPASy FindPept	Swiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlot	Systat Software	Version 11.0
PyMOL	Schrödinger	Version 1.5.0.4
Name	Company	Catalog Number	Comments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer	AB SCIEX