JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Конформационная гибкость играет важную роль в функции белка. Здесь мы опишем использование с временным разрешением масс-спектрометрии с ионизацией электрораспыления в сочетании с обменом водородно-дейтериевого для зондирования быстрых структурных изменений, которые ведут функцию в упорядоченных и неупорядоченных белках.

Аннотация

Искробезопасный неупорядоченные белки (ВПЛ) уже давно вызов структурных биологи из-за отсутствия стабильных элементов вторичной структуры. Водород-дейтерий Обмен (HDX), измеренный при быстрых временных масштабах уникально подходит для обнаружения структур и водородных связи сетей, которые кратко заселенные, что позволяет для характеристики переходных конформеров в нативных ансамблях. Взаимодействие с HDX масс-спектрометрии предлагает несколько ключевых преимуществ, в том числе высокой чувствительностью, низким потреблением образца и без ограничений по размеру белка. Этот метод значительно продвинулся вперед в течение последних нескольких десятилетий, в том числе возможности контролировать HDX раз маркировки на временной шкале миллисекунды. Кроме того, путь включения рабочего процесса HDX на микрофлюидальную платформу для дома кислой протеазы микрореактора, мы можем локализовать динамические свойства на уровне пептида. В этом исследовании, времяразрешенная ионизацией электрораспылением масс-спектрометрии (МС-TRESI), соединенный с HDX ваы используются для обеспечения детальную картину остаточной структуры в тау-белка, а также конформационные сдвиги, индуцированные при гиперфосфорилированию.

Введение

За последние несколько десятилетий, значительные достижения были сделаны в разработке аналитических методов , предназначенных для измерения белковой структуры и динамики 1, 2, 3, 4. В то время как рентгеновская кристаллография остается принцип инструмента для определения структуры белка, высокие концентрации белка необходимы и обширные оптимизации требуются для получения кристаллов дифракционного качества. Белки, которые трудно кристаллизуется, такие как ассоциированные с мембранами и внутренне неупорядоченными белки классически были изучены с помощью водородного обмена-дейтерия (HDX) ЯМРА 5. Тем не менее, в последние десятилетия, связь с электрораспылением ионизации масс - спектрометрии (ESI-MS) на HDX быстро завоевала популярность 6, 7.

Масс-спектрометрия предлагает решениеко многим из ограничений, связанных с рентгеновской кристаллографии и ЯМР. В частности, МС обладает высокой чувствительностью (нМ до концентрации мкМ требуется), и не существует практически никаких ограничений на размер белка. Кроме того, высокий рабочий цикл анализа MS допускает возможность изучения белков, поскольку они подвергаются ферментативному обороту, неправильный фолдинг, комплексообразование и других биологически соответствующих процессы. Эти процессы часто происходят на миллисекунды до второй шкалы времени и требуют быстрого смешивания реагентов до анализа.

Развитие Времяразрешенной ионизации электрораспыления (TRESI) Вильсон и Konermann в 2003 году, разрешенных реакций, подлежащий мониторинг в псевдо-режиме реального времени с помощью ESI-MS. Их установка включена капиллярный смеситель с плавно регулируемым реакционным объемом камеры 8. Устройство состоит из двух концентрических капилляров, с внутренним капилляром запечатанного и насечкой разрежет на его сторону, чтобы обеспечить смешивание в узком интер-капилляреу пространства от надреза до конца внутреннего капилляра (обычно 2 мм). При нанесении на опытах HDX, внутренний капиллярная несет белок , представляющий интерес, наружный капиллярная несет на маркировку D 2 O раствор, который затем подвергается смешивания с белком перед входом в регулируемой реакционной камеры , что позволяет для маркировки HDX до прямой передачи в ESI источник.

Если коротко, то HDX полагается на магистральных амидных водородах , проходящих обмен с атомами дейтерия в растворе 9, 10. Обмен катализируемой основанием при физиологическом рН, с кислотно-катализ становится распространенным при рН ниже примерно 2,6. Скорость обмена основана на четыре основных факторах: рН, температура, доступность растворителя и внутримолекулярные водородные связи. В первых два фактора поддерживается постоянным в течение всего эксперимента, скорость обмена, особенно на пептидном остове позиции амидной, в первую очередь dependenт на структуру белка 11. Плотно сложенные участки с обширными, стабильных водородных связей сетей в альфа-спиралей и бета-листов будет занимать дейтерий , по существу , более медленными темпами по сравнению с петлями и неупорядоченных областей (а иногда и не на всех) 12. Это позволяет для глобального анализа белков, где возмущение в структуре (например., После агрегации или связывание субстрата) приводит к различному поглощению дейтерия (рисунок 1).

Кинетическая капиллярная смеситель может быть включена в микрожидкую платформу, содержащей протеолитическую камеру для локализации поглощения дейтерия. Эта протеолитическая камера удерживается при низком значении рНа в целях эффективного гашения реакции обмена, и требует иммобилизованной кислоты протеазы, чтобы переварить белка в локализованные пептиды (рисунок 2). Мониторинг магистральной обмен на миллисекундах до вторых временных масштабов особенно важна дляхарактеристика конформационных изменений в пределах трудно охарактеризовать областей петли, расплавленные глобулы и внутренне неупорядоченные белки (ВПЛ) 13, 14. В качестве альтернативы, TRESI-HDX может также использоваться , чтобы характеризовать белки , которые в настоящее время не имеют решаемой атомную структуру с помощью методов рентгеновской кристаллографии и ЯМР, используя обмен дейтерия в сочетании с алгоритмом COREX (DX-COREX) подход 15, 16. Этот подробный протокол будет применяться TRESI-HDX для изучения тау, МВУ, в обоих его нативной формы, а также это патогенные гиперфосфорилированного состояние. В то время как родной тау является одним из наиболее хорошо изученных ВПЛ, мало известно о его амилоидогенном аналоге 13.

протокол

Примечание: Пожалуйста, обратитесь все соответствующие паспорта безопасности материала (MSDS) перед использованием. Дымовые газы, полученные с помощью лазерной абляции поли (метилметакрилата) (ПММА) могут быть токсичными. Убедитесь, что лазерный гравер подключен к работающей системе вентиляции. Используйте все соответствующие правила безопасности при строительстве микрожидкостных устройств, включая использование технических средств контроля (вытяжкой, высевки контейнер) и средств индивидуальной защиты (защитные очки, маски, перчатки, плащи, полные штаны длины, закрытый носок обуви). Это имеет огромное значение для использования высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) реагенты класса всякий раз, когда это возможно, со всем существом марки ACS или выше, чтобы уменьшить мешающие загрязняющих веществ в ходе анализа.

1. Подготовка микрожидкостных устройств

  1. Строительство ПММА Микрофлюидальные платформы
    1. Получают стандартный блок ПММА (8,9 х 3,8 х 0,6 см) и лазерной абляции входной канал для введения реагентов, а Proteoлизиса камеры, а выходной канал с использованием лазерного гравировального устройства 17, 18.
      Примечание: Протравите протеолиз камеру в удлиненной овальной форме (30 х 5 х 0,05 мм). Канальный вход и выход должен распространяться на конце блока ПММА и не должен превышать 75 мкм в обоих ширины и глубины для того, чтобы вместить 30 га капилляр.
    2. Вырезать 30 га из нержавеющей стали металлического капилляра на две части примерно 10 см каждый, используя ротационный инструмент с толстым отрезного диском 1/64" . Используйте наждачную бумагу, чтобы сгладить концы капилляров (это может быть облегчено путем просмотра в а оптический микроскоп).
    3. Melt капилляров в протравленную поли (метилметакрилат) с использованием блоком паяльника. Входной канал будет подключен к автоматизированным шприцевым насосам, а также выходной канал будет использоваться для соединения в MS.
  2. Построение непрерывного поток времяразрешенного Kinetic Mixer
    1. Получить слитыстеклянный капилляр кремнезем (ID: 75 мкм, ОД: 150 мкм) примерно 40 см, и вставить его в 28 га из нержавеющей стали металлического капилляра приблизительно 15 см. В зависимости от времени реакции, необходимого, использовать больше наружный металлический капилляр или один с большим ID.
      Примечание: Определение «истинный» внутренний диаметра металлического капилляра имеет решающее значение для получения точного времени реакции. Это может быть сделано путем прикрепления металлического капилляра к высокоэффективной жидкостной хроматографии, протекающий растворитель, хотя капилляра, и запись обратного давления. Противодавления для расчета внутреннего диаметра могут быть выполнены, а истинный внутренний диаметр металлического капилляра определяется. Это можно рассчитать с помощью программного обеспечения Молекулярный вес калькулятор (для версии Windows 6.49).
    2. Производит 2 мм паз , используя низкие настройки мощности лазерного гравера на одном конце внутреннего стеклянного капилляра и запечатать этот конец внутреннего стеклянного капилляра (рисунок 2). В качестве альтернативы, сделать выемку с использованием керамического стекла капиллярныху режущего инструмента или вращающийся шлифовальный станок с тонким режущим лезвием.
    3. Линия вверх внутренний стеклянный капилляр с концом металлического капилляра (это может быть облегчено путем просмотра под световым микроскопом).
    4. Приложить этот кинетический смеситель с одним конца смесительного тройника (рисунок 2).
    5. Приложить кварцевое стекло капилляр (ID: 75 мкм, OD: 150 мкм) примерно 40 см до противоположного конца кинетического смесителя на смесительном тройнике. Это используется для доставки кислоты (5% уксусной кислоты, рН 2,4) для гашения реакции.
      Примечание: Реактивы подаются на устройство с газонепроницаемыми шприцами через политетрафторэтилен (PTFE) насосно-компрессорные трубы с использованием автоматизированных инфузионных насосов.
  3. Пепсин активации
    1. Взвесить 20 мг пепсина из свиной слизистой оболочки желудка и приостановить его в 1 мл связывающего буфера (0,1 М фосфата натрия, 0,15 М NaCl, рН 6,0).
    2. Взвесить 50 мг N -hydroxysuccinimide (NHS) -активированные агарозные шарики, добавить к повторному-х годамuspended протеазы и вращать осторожно в течение ночи при 4 ° С.
    3. Спин вниз при 1000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы собрать смолу.
    4. Аспирируйте несвязанную протеазу.
    5. Инкубируйте агарозы в 1 мл блокирующего буфера (1 М Трис-HCl, рН 6,0) и осторожно повернуть при комнатной температуре в течение 1 ч.
    6. Спин вниз при 1000 х г в течение 2 мин при комнатной температуре, чтобы собрать смолу.
    7. Аспирируйте блокирующий буфер.
    8. Инкубируйте пепсина-агарозы с 1 мл 5% -ной уксусной кислоты, рН 2,4 в течение 5 мин.
    9. Спин вниз при 1000 х г в течение 2 мин, чтобы собрать смолу.
    10. Аспирата супернатант.
    11. Повторите шаги 1.3.8 - 1.3.10 в общей сложности три раза.
    12. Хранить шарики в 1 мл уксусной кислоты при температуре 4 ° С в течение длительного использования.
  4. Сборка устройства
    1. Заполните протеолиза камеру с суспензией активированного пепсина-агарозных шариков в 5% -ной уксусной кислоты с использованием стерильного шпателя.
    2. Поместите микрофлюидальную platfor ПММАм между двумя пустыми ПММОЙ блоками в качестве крышки для герметизации устройства, облицованные силиконовой резиной, чтобы создать герметичное уплотнение жидкости.
    3. Используйте металлические прижимные пластины к давлению уплотнения устройства.
      Примечание: Зажим был на заказ, чтобы соответствовать микрожидкостной платформе и состоит из двух пластин размера 10,1 см х 7,4 см х 1,2 см.
    4. Поток 5% уксусной кислоты, рН 2,4 со скоростью 10 мкл / мин. Поток 50 мМ ацетат аммония буфера (рН 6,9), хотя белковой линии со скоростью 1 мкл / мин.
      Примечание: Это чрезвычайно важно, что уксусная кислота непрерывно течет через устройство по всей полноте эксперимента. Убедитесь, что нет утечки и что жидкость выхода только из выходного канала, который будет служить в качестве источника ESI.
    5. Пара устройство к переднему концу модифицированного (Q-TOF) массы-спектрометра квадрупольного времени пролета с использованием регулируемого изолированного этапа для достижения оптимальных условий электрораспыления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: байпасвводится для того, чтобы имитировать наличие коммерческого источника ESI. 17

2. Времяразрешенная Обмен ионизация электрораспыления водорода дейтерия

  1. Приобретение пепсина и белок только Spectra
    Примечание: приобретение ESI-МС осуществляется в режиме положительных ионов с напряжением +4,500 до +5,000, 60-V декластеризация потенциал, и 250-V, сосредоточив внимание потенциал. Спектры приобретаются в диапазоне 350-1,500 м / г со скоростью сканирования 1 с -1.
    1. Приобретать пепсин только спектр. Любые пики, появляющиеся в этом спектре вычитают один раз добавляют белки.
    2. Введение 50-100 мкМ тау / фосфо-тау - белка (очистить и подготовить , как описано выше 13, 19) со скоростью 1 мкл / мин , где 50 мМ буфера ацетат аммония ранее протекающего.
    3. Acquire белка только спектр.
  2. Приобретение оF Время Очки
    1. В то время как 100 мкМ тау / фосфо-тау - белка протекает в 1 мкл / мин, ввести D 2 O со скоростью 3 мкл / мин через соединитель тройник и позволяют реагировать в кинетическом смесителе. Разрешить для системы уравновешиваться в течение по крайней мере 10 мин перед приобретением спектра.
      Примечание: После обмена, реакцию гасили маркировки потоком уксусной кислоты рН 2,4 при 10 мкл / мин и перевариванием меченого белка происходит в протеолитического камере.
    2. Для того, чтобы увеличить время маркировки, вручную потянуть назад положение внутреннего стеклянного капилляра, чтобы достичь смешения времен 42 мс до 8 с. Разрешить для системы уравновешиваться в течение по крайней мере 10 мин между каждым выдвижным задним.

3. Данные и статистический анализ

  1. Определение Пептиды и Расчет Процент дейтерий биржи
    1. Выполните MS спектры анализа с использованием программного обеспечения mMass, версия 5.5.0 20 .
    2. Определение пептидов с помощью протеомных серверов ExPASy FindPept и подтвердить столкновение индуцированной диссоциации (CID) , когда это требуется 21.
      Примечание: Здесь поглощение дейтерий включение измеряли с использованием собственной разработки FORTRAN программное обеспечение для изотопного анализа распределения 22, 23.
    3. Рассчитать теоретические внутренние ставки на основе первичной последовательности с помощью веб - инструмента СФЕРЫ 22, 24.
    4. Установить данные с помощью одного экспоненциальная нелинейной регрессии и нормализуют с использованием графиков и статистического программного обеспечения (например, Sigmaplot).
      Примечание: Отношение к INT / к набл дает коэффициент защиты (PF), пол-количественную меру степени , что конкретный регион структурированной в конформационном ансамбле.

Результаты

Варочные профили нативного и фосфо-тау были похожи, что дает покрытие последовательности из 77,1 и 71,7% соответственно. поглощение дейтерия значение каждого пептида определяло путем подгонки наблюдаемых изотопных распределений с теоретическими распределениями, генер?...

Обсуждение

В то время как структурные методы биологии, такие как рентгеновская кристаллография и ЯМР являются предпочтительными, поскольку они обеспечивают чрезвычайно подробные структуры белков, эти изображения часто являются статичными. Характеристика переходных видов и слабо структуриров?...

Раскрытие информации

We have nothing to disclose.

Благодарности

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the 'native' tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(methyl methacrylate) or PMMAProfessional PlasticsSACR.250CCP8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass CapillaryPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal CapillariesMcMaster-Carr28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) TubingIDEX1477
1548		ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing CutterIDEXA-327for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing TeeIDEXM-540for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm BoreValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1Cfor 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD TubingIDEXP-727
10-32 Female to Female LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Double-Winged NutIDEXF-300
Ferrule for 1/16” OD TubingIDEXF-142
100 Series Rotary ToolDremelF013010001
Cut-Off DiscsJobmate1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom MicroscopeFisher Scientific12-563-411
Soldering IronMastercraft58-6301-2
VersaLaserUniversal Laser
SyringesHamilton81220500 µL capacity
Syringe PumpsHarvard Apparatus70-4501
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
NHS-Activated AgaroseFisher Scientific26196
Pepsin from Porcine Gastric MucosaSigma-AldrichP6887-250MG
Deuterium OxideSigma-Aldrich151882-10X0.6ML
Acetic AcidSigma-Aldrich695092-100ML
HPLC Grade WaterFisher ScientificW5-4
Ammonium AcetateSigma-AldrichA7330-500G
Sodium PhosphateFisher ScientificS369-500
Sodium ChlorideFisher ScientificS671-3
NameCompanyCatalog NumberComments
Software/Online Tools
CorelDraw X3Corel
Molecular Weight CalculatorVersion 6.49Open Source MS Tool
mMassVersion 5.5.0Open Source MS Tool
ExPASy FindPeptSwiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlotSystat SoftwareVersion 11.0
PyMOLSchrödingerVersion 1.5.0.4
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass SpectrometerAB SCIEX

Ссылки

  1. Sapienza, P. J., Lee, A. L. Using NMR to study fast dynamics in proteins: methods and applications. Curr. Opin. Pharmacol. 10, 723-730 (2010).
  2. Neira, J. L. NMR as a tool to identify and characterize protein folding intermediates. Arch. Biochem. Biophys. 531, 90-99 (2013).
  3. Xu, A., Li, F., Robinson, H., Yeung, E. S. Can protein conformers be fractionated by crystallization?. Anal. Chem. 85, 6372-6377 (2013).
  4. Keedy, D. A., et al. Mapping the conformational landscape of a dynamic enzyme by multitemperature and XFEL crystallography. eLife. 4, e07574 (2015).
  5. Englander, S. W., Sosnick, T. R., Englander, J. J., Mayne, L. Mechanisms and uses of hydrogen exchange. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 18-23 (1996).
  6. Engen, J. R., Smith, D. L. Investigating protein structure and dynamics by hydrogen exchange MS. Anal. Chem. 73, 256A-265A (2001).
  7. Hoofnagle, A. N., Resing, K. A., Ahn, N. G. Protein analysis by hydrogen exchange mass spectrometry. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 32, 1-25 (2003).
  8. Wilson, D. J., Konermann, L. A Capillary Mixer with Adjustable Reaction Chamber Volume for Millisecond Time-Resolved Studies by Electrospray Mass Spectrometry. Anal. Chem. 75, 6408-6414 (2003).
  9. Wales, T. E., Engen, J. R. Hydrogen exchange mass spectrometry for the analysis of protein dynamics. Mass Spectrom. Rev. 25, 158-170 (2006).
  10. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chem. Soc. Rev. 40, 1224-1234 (2011).
  11. Morgan, C. R., Engen, J. R. Investigating solution-phase protein structure and dynamics by hydrogen exchange mass spectrometry. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 17, Unit 17.6.1-Unit 17.6.17 (2009).
  12. Katta, V., Chait, B. T. Conformational changes in proteins probed by hydrogen-exchange electrospray-ionization mass spectrometry. Rapid Commun. Mass Spectrom. RCM. 5, 214-217 (1991).
  13. Zhu, S., et al. Hyperphosphorylation of intrinsically disordered tau protein induces an amyloidogenic shift in its conformational ensemble. PloS One. 10, e0120416 (2015).
  14. Lento, C., Ferraro, M., Wilson, D., Audette, G. F. HDX-MS and deletion analysis of the type 4 secretion system protein TraF from the Escherichia coli F plasmid. FEBS Lett. 590, 376-386 (2016).
  15. Hilser, V. J., Freire, E. Structure-based calculation of the equilibrium folding pathway of proteins. Correlation with hydrogen exchange protection factors. J. Mol. Biol. 262, 756-772 (1996).
  16. Liu, T., et al. Quantitative Assessment of Protein Structural Models by Comparison of H/D Exchange MS Data with Exchange Behavior Accurately Predicted by DXCOREX. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 23, 43-56 (2012).
  17. Rob, T., Wilson, D. J. A versatile microfluidic chip for millisecond time-scale kinetic studies by electrospray mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass Spectrom. 20, 124-130 (2009).
  18. Liuni, P., Rob, T., Wilson, D. J. A microfluidic reactor for rapid, low-pressure proteolysis with on-chip electrospray ionization. Rapid Commun. Mass Spectrom. 24, 315-320 (2010).
  19. Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol. Biol. Clifton NJ. 299, 35-51 (2005).
  20. Strohalm, M., Kavan, D., Novák, P., Volný, M., Havlícek, V. mMass 3: a cross-platform software environment for precise analysis of mass spectrometric data. Anal. Chem. 82, 4648-4651 (2010).
  21. Gattiker, A., Bienvenut, W. V., Bairoch, A., Gasteiger, E. FindPept, a tool to identify unmatched masses in peptide mass fingerprinting protein identification. PROTEOMICS. 2, 1435-1444 (2002).
  22. Rob, T., et al. Measuring Dynamics in Weakly Structured Regions of Proteins Using Microfluidics-Enabled Subsecond H/D Exchange Mass Spectrometry. Anal. Chem. 84, 3771-3779 (2012).
  23. Ferguson, P. L., et al. Hydrogen/Deuterium Scrambling during Quadrupole Time-of-Flight MS/MS Analysis of a Zinc-Binding Protein Domain. Anal. Chem. 79, 153-160 (2007).
  24. Bai, Y., Milne, J. S., Mayne, L., Englander, S. W. Primary structure effects on peptide group hydrogen exchange. Proteins. 17, 75-86 (1993).
  25. Buée, L., Bussière, T., Buée-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders1. Brain Res. Rev. 33, 95-130 (2000).
  26. Zhang, H. M., et al. Enhanced Digestion Efficiency, Peptide Ionization Efficiency, and Sequence Resolution for Protein Hydrogen/Deuterium Exchange Monitored by FT-ICR Mass Spectrometry. Anal. Chem. 80 (23), 9034-9041 (2008).
  27. Deng, B., Lento, C., Wilson, D. J. Hydrogen deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical discovery and development - A review. Anal. Chim. Acta. , (2016).
  28. Pan, L. Y., Salas-Solano, O., Valliere-Douglass, J. F. Conformation and dynamics of interchain cysteine-linked antibody-drug conjugates as revealed by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Anal. Chem. 86, 2657-2664 (2014).
  29. Zhang, Q., et al. Epitope mapping of a 95 kDa antigen in complex with antibody by solution-phase amide backbone hydrogen/deuterium exchange monitored by Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Anal. Chem. 83, 7129-7136 (2011).
  30. Engen, J. R. Analysis of protein complexes with hydrogen exchange and mass spectrometry. The Analyst. 128, 623-628 (2003).
  31. Lu, J., et al. IL-1beta epitope mapping using site-directed mutagenesis and hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry analysis. Biochemistry (Mosc). 44, 11106-11114 (2005).
  32. Konermann, L., Rodriguez, A. D., Sowole, M. A. Type 1 and Type 2 scenarios in hydrogen exchange mass spectrometry studies on protein-ligand complexes. The Analyst. 139, 6078-6087 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

122

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены