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요약

구조적 유연성은 단백질 기능에 중요한 역할을한다. 여기서, 우리는 주문과 무질서 단백질의 기능을 구동 급속한 구조적 변화를 프로빙 수소 - 중수소 교환 결합 시분 전기 분무 이온화 질량 분석법의 사용을 설명합니다.

초록

본질적으로 무질서 단백질 (실향민) 길이 때문에 안정적인 이차 구조 요소의 부족 구조적 생물 학자에 도전하고있다. 수소 - 중수소 빠른 시간 척도로 측정 교환 (HDX)는 네이티브 앙상블 일시적인 이형태 체의 특성을 허용 간단히 채워진 구조와 수소 결합 네트워크를 검출하는 고유 적합하다. 질량 분석에 HDX의 커플 링은 높은 감도, 낮은 샘플 소비와 단백질의 크기에 제한을 포함하여 몇 가지 중요한 이점을 제공합니다. 이 기술은 밀리 초 시간 규모 HDX 라벨 시간을 모니터링 할 수있는 기능을 포함하여, 지난 몇 년간 크게 발전했다. 또한, 산성 프로테아제 마이크로 리액터 하우징 미세 유체 플랫폼 상 HDX 흐름을 도입함으로써, 우리는 펩타이드 레벨에서의 동적 속성을 지역화 할 수있다. 본 연구에서는 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 질량 분석법 (TRESI-MS)는 HDX의 WA 결합S는 타우 단백질에 잔여 구조의 상세한 그림뿐만 아니라 과인산에 유도 된 형태 적 변화를 제공하기 위해 사용된다.

서문

지난 몇 년 동안 상당한 발전 단백질 구조와 역학 1, 2, 3, 4를 측정하기위한 분석 기술의 개발되었습니다. X 선 결정학은 단백질 구조를 결정하기위한 원리 공구 유지하는 동안, 단백질의 고농도가 필요하다 광범위한 최적화 회절 품질의 결정을 제조 할 필요가있다. 이러한 막과 본질적으로 연관된 장애 단백질로서 결정화하기 어려운 단백질, 고전 수소 - 중수소 교환 (HDX) NMR (5)에 의해 연구되었다. 그러나 최근 수십 년간, HDX에 전기 분무 이온화 질량 분석 (ESI-MS)의 커플 링은 빠르게 인기 6, 7 얻고있다.

질량 분석은 솔루션을 제공합니다X 선 결정학 및 NMR로 인한 제약 사항에. 특히, MS는 매우 민감한 (필수 μM 농도로 ㎚)이고, 단백질의 크기에는 제한이 거의 없다. 또한, MS 분석의 높은 듀티 사이클은 효소 회전율, 미스 폴딩, 복합체 및 기타 중요한 생물학적 과정을 겪는다 같은 단백질 연구의 가능성을 허용한다. 이러한 프로세스는 종종 두 번째 규모로 밀리 초에서 발생 및 분석에 앞서 시약의 신속한 혼합이 필요합니다.

2003 허용 반응에서 윌슨과 Konermann 소요 시간 - 해결 된 전기 분무 이온화 (TRESI)의 개발은 ESI-MS에 의한 의사 실시간으로 모니터링 할 수 있습니다. 이들의 설정은 계속 조정 가능한 반응 실 용적 8 모세관 믹서로 통합된다. 장치는 좁은 상호 capillar 내 혼합을 허용하도록 밀봉 내부 모세관의 측면으로 잘라 노치 두 동심 모세관 이루어져내부 모세관 (일반적으로 2mm)의 단부에 절 결부의 공간 Y. HDX 실험에 적용 할 때, 상기 내부 모세관 관심 단백질을 운반 외측 모세관 표지 D를 다음 ESI로 직접 전송하기 전에 HDX 라벨링 있도록 조절 반응 챔버로 들어가기 전에 단백질과 혼합 겪는다 2 O 용액을 운반 출처.

간단히, HDX 용액 9, 10 중수소 원자 교환을 진행 백본 아미드 수소에 의존한다. 교환은 염기 - 촉매 생리적 pH에서, 산 촉매는 약 2.6 이하의 pH에서 함께 널리 사용되고있다. 산도, 온도, 용매 접근성과 분자간 수소 결합 : 교환 율은 네 가지 요인에 기초한다. 이전의 두 가지 요인이 실험 특히 펩티드 백본 아미드 위치에서의 환율에 걸쳐 일정하게 유지되기 때문에, 우선적 인 dependen단백질 구조 (11)에 t. 밀접 루프와 무질서 영역 (때때로 전혀) (12)에 비해 실질적으로 느린 속도로 중수소 소요될 것이다 α 나선과 β-시트 광범위한 안정된 수소 결합 네트워크 영역으로 접혀. 이 글로벌 단백질 분석을 가능 여기서 구조 섭동 (예., 응집 또는 기질 결합시) 중수소 흡수 (도 1)에 다른 리드.

운동 모세관 믹서 중수소 흡수 제이션을위한 단백질 분해 챔버를 포함하는 미세 유체 플랫폼으로 통합 될 수있다. 이러한 단백질 분해 챔버 효과적으로 교환 반응을 급냉시키기 위해 낮은 pH로 유지하고, 지역화 된 펩티드 (도 2)로 단백질을 소화하기 위해 고정화 산 프로테아제를 필요로한다. 두 번째 시간 규모에 밀리 초에서 모니터링 백본 교환은 특히 중요하다어려운 내 구조적 변화 특성 루프 영역, 용융 구체와 본질적으로 무질서 단백질 (실향민) (13) (14)을 특성화한다. 대안 적으로, TRESI-HDX 또한 COREX 알고리즘 (DX-COREX) 방법 (15, 16)에 결합 된 중수소 교환을 이용하여, 현재 X 선 결정학 및 NMR의 방법을 통해 해결할 원자 구조를 갖고 있지 않은 단백질을 특성화하는데 사용될 수있다. 이 상세한 프로토콜은 병원성 hyperphosphorylated 상태입니다으로 모두가 기본 형태뿐만 아니라의에, 타우, 실향민을 연구하기 위해 TRESI - HDX을 적용합니다. 기본 타우가 가장 잘 연구 실향민 중 하나이지만, 약간은 아밀로이드 대응 (13)에 대한 알려져있다.

프로토콜

참고 : 사용하기 전에 모든 관련 물질 안전 보건 자료 (MSDS)를 참조하십시오. 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트)의 레이저 어블 레이션 (PMMA)에 의해 생성 된 증기는 독성이있을 수있다. 레이저 조각사가 작동 환기 시스템에 연결되어 있는지 확인합니다. (, 보안경, 얼굴 마스크, 장갑, 실험실 코트, 전체 길이 바지 폐쇄 발가락 신발) 공학적 관리 (흄 후드, 예리한 컨테이너) 및 개인 보호 장비의 사용을 포함하여 마이크로 유체 장치를 구축 할 때 모든 적절한 안전 방법을 사용합니다. 그것은 가능한 분석 과정을 방해 오염 물질을 감소 ACS 등급 이상의 모든 존재와 함께, 고성능 액체 크로마토 그래피 (HPLC) 등급의 시약을 사용하는 것이 가장 중요합니다.

미세 유동 장치의 제조 1

  1. PMMA 마이크로 유체 플랫폼의 건설
    1. 표준 PMMA 블록 (8.9 X 3.8 X 0.6 cm) 및 구 시약을 도입하기위한 proteo을 입력 채널을 레이저 어블 레이션-용해 챔버 및 레이저 조각기 (17), (18)를 이용하여 출력 채널.
      주의 : 연장 된 타원형 (30 × 5 mm X 0.05)의 단백질 분해 챔버 에칭. 입력 및 출력 채널은 PMMA 블록의 단부까지 연장하고, GA (30) 모세관을 수용하기 위해 두 폭과 깊이보다 더 큰 75 μm의 없어야한다.
    2. . 1/64 "두께 차단 디스크와 회전 공구를 사용하여 약 10cm 각의 두 부분으로 30 GA 스테인레스 금속 모세관 컷 모세관의 단부 (이것은 아래 보면서 용이해진다 부드럽게 사포를 사용하여 광학 현미경).
    3. 납땜 인두를 사용하여 에칭 된 폴리 (메틸 메타 크릴 레이트) 블록으로 모세관 녹아. 입력 채널은 자동 주사기 펌프에 연결되며, 상기 출력 채널은 MS에 결합을 위해 사용될 것이다.
  2. 연속 흐름 시간 해결 운동 믹서의 건설
    1. 융합을 구합니다석영 유리 모세관 (ID : 75 μm의, OD 150 μm의) 약 40cm의 약 15cm의 28 GA 스테인레스 금속 모세관 삽입. 필요한 반응 시간에 따라, 더 큰 ID와 장기간 외부 금속 또는 모세관을 사용한다.
      주 : 금속 모세관의 '참'내경을 결정하는 정확한 반응 시간을 얻기 위해 중요하다. 이것은 비록 용매 모세관 유동 및 후방 압력, 레코딩 HPLC에 금속 모세관을 부착시킴으로써 이루어질 수있다. 내경 계산에 배압이 이루어질 수 있으며, 금속 모세관의 실제의 내경이 결정. 이것은 (윈도우 버전 6.49의 경우) 분자량 계산기 소프트웨어를 사용하여 계산 될 수있다.
    2. 내측 유리 모세관의 일단에 저출력의 레이저 조각기를 이용하여 설정 2mm 노치 생산 내측 유리 모세관 (도 2)의 단부를 밀봉. 또한, 세라믹 유리 capillar를 사용하여 노치을Y 커터 공구 나 미세 절단 날과 회전 분쇄기.
    3. 라인업 금속 모세관의 끝 부분과 상기 내부 유리 모세관 (이는 광 현미경에 의해 용이하게 볼 수있다).
    4. 믹싱 티의 일단 (도 2)이 부착 운동 믹서.
    5. 믹싱 티 운동 혼합기의 반대쪽에 약 40cm의 (가 150㎛ : 75 μm의, OD ID) 융합 된 석영 유리 모세관을 첨부. 이러한 반응을 종결 산 (5 % 아세트산의 pH 2.4)을 제공하기 위해 사용된다.
      주의 : 반응물 자동 주입 펌프를 사용하여 테트라 플루오로 에틸렌 (PTFE) 튜브를 통해 기밀 주사기로 장치에 공급된다.
  3. 펩신의 활성화
    1. 돼지의 위 점막에서 20mg의 펩신을 달아 결합 완충액 (0.1 M 인산 나트륨, 0.15 M 염화나트륨, pH를 6.0) 1 ㎖에 중단.
    2. N 개의 -hydroxysuccinimide (NHS) 부활 아가 로스 비드 50 mg의 체중을 재들에 추가uspended 프로테아제 부드럽게 밤새 4 ℃로 회전한다.
    3. 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운.
    4. 언 바운드 단백질 분해 효소를 대기음.
    5. 버퍼 (1 M 트리스 -HCl, pH를 6.0) 차단를 1ml 아가 로스를 인큐베이션하고 1 시간 동안 실온에서 부드럽게 회전한다.
    6. 수지를 수집하고 실온에서 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운.
    7. 블로킹 버퍼 대기음.
    8. 1 mL의 5 % 아세트산, 5 분 동안 pH를 2.4 펩신 아가 로스 부화.
    9. 수지를 수집하기 위해 2 분 동안 1,000 XG에서 스핀 다운.
    10. 뜨는을 대기음.
    11. 세 세척의 총 1.3.10 - 반복 1.3.8 단계를 반복합니다.
    12. 장시간 사용을 위해 4 ℃에서 1 mL의 아세트산 비드를 저장한다.
  4. 장치 조립
    1. 멸균 주걱을 사용하여 5 % 아세트산 펩신 활성 아가 로스 비드 슬러리와 단백질 분해 챔버를 채운다.
    2. PMMA 마이크로 유체 platfor 배치장치를 밀봉하는 덮개와 같은 두 개의 빈 PMMA 블록 사이에서 m은 액밀 시일을 만드는 실리콘 고무 늘어서.
    3. 압력 실에 장치를 금속 클램핑 플레이트를 사용한다.
      주 : 클램프 맞춤 미세 유체 플랫폼을 맞추기 위해 제출되었다 10.1 cm X 7.4 cm X 1.2 cm 측정 개의 플레이트로 구성되어있다.
    4. 10 μL / 분의 속도로 5 % 아세트산, pH가 2.4를 흐른다. 1 μL / 분의 속도로 단백질 라인 비록의 50 mM 아세트산 암모늄 완충액 (pH 6.9)을 흐른다.
      주 : 아세트산 연속적 실험 전체에 걸쳐 디바이스를 통해 흐르는 것이 매우 중요하다. 거기에는 누설이없는 그 유체 ESI 소스 역할을한다 출력 채널에서만 종료되었는지 확인.
    5. 몇 일렉트로 최적 조건을 달성하기 위해 조절 가능한 절연 스테이지를 사용하여 개질 중극 비행 시간 형 (Q-TOF) 질량 분광기의 선단부에 장치.
      참고 : 바이 패스 스위치상업 ESI 소스의 존재를 시뮬레이션하기 위해 도입된다. (17)

2. 시간 해결 전기 분무 이온화 수소 - 중수소 교환

  1. 펩신의 수집 및 단백질 만 스펙트럼
    주 : ESI-MS 취득 60 V 디 클러스터링 전위에 5,000 4,500의 전압 양이온 모드에서 수행되며, 250 V 전위 집중. 스펙트럼은 (1 개) (S)의 주사 속도 350-1,500 m / z 범위에 걸쳐 취득 -1.
    1. 펩신 유일한 스펙트럼을 획득. 단백질이 추가되면이 스펙트럼에서 나타나는 모든 피크가 감산된다.
    2. 50 mM의 아세트산 암모늄 완충액 이전 흘렀다 1 μL / 분의 속도로 50 ~ 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질 (19 정화 앞서 설명한 제조 13) 소개.
    3. 단백질 만 스펙트럼을 획득.
  2. 취득 오F 시간 포인트
    1. 100 μM 타우 / 인산화 타우 단백질은 1 μL / 분으로 흐르는 동안, 티 커넥터를 통해 3 μL / 분의 속도로 D O 2를 도입하고 운동 믹서에서 반응 할 수있다. 스펙트럼의 취득 전에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템.
      음표 : 교환 후, 라벨링 반응 표지 단백질의 10 μL / 분으로 아세트산의 pH 2.4의 흐름과 절단에 의해 급냉된다 단백질 분해 챔버 내에서 발생한다.
    2. 수동 레이블 시간을 증가 8의 42 밀리 초의 시간 혼합 달성 내측 유리 모세관의 위치를 ​​위로 끌어하기 위하여. 각 풀 - 백 사이에 적어도 10 분 동안 평형을 허용 시스템.

3. 데이터 및 통계 분석

  1. 펩티드를 확인하고 중수소 교환의 비율을 계산
    1. , MS 스펙트럼 mMass 소프트웨어를 사용하여 분석 버전 5.5.0 (20)를 수행 .
    2. ExPASy FindPept 단백체 서버를 사용하여 펩티드를 확인하고 (21)을 필요한 경우 충돌 - 유도 해리 (CID)에 의해 확인한다.
      참고 : 여기, 중수소 흡수 통합은 동위 원소 분포 분석 (22), (23)에 대한 자체 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 측정 하였다.
    3. 구체 웹 도구 (22, 24)를 사용하여 기본 시퀀스에 기초하여 이론적 극한 요금을 계산한다.
    4. 단일 지수 비선형 회귀를 사용하여 데이터를 장착하고, 그래프와 통계 소프트웨어 (예 SigmaPlot)를 이용하여 정규화.
      주 : 비율 K INT / K OBS 보호 인자 (PF)의 특정 영역은 상기 입체 앙상블 내의 구조화 정도 반 정량적 측정 값을 산출한다.

결과

네이티브 및 인산화 타우 분해 프로파일이 각각 77.1과 71.7 %의 서열 커버리지를 수득 유사 하였다. 펩타이드 중수소 흡수 값은 사내 개발 FORTRAN 소프트웨어를 사용하여 생성 된 이론적 인 분포로 관찰 동위 원소 분포를 피팅하여 구 하였다. 최상의 결합 분포 연관된 중수소 흡수 값과 함께 (도 3a)을 나타낸다. 통풍 운동 프로파일은 생성되고, 또한 하나의 지수 ?...

토론

그들이 단백질의 매우 상세한 구조를 제공하기 때문에 이러한 X 선 결정학 및 NMR 구조 생물학 등의 방법이 유리하지만, 이러한 이미지들은 정적이다. 과도 종과 약하게 구조화 된 도메인의 특성은 이러한 기존의 방법으로 공부하면 어려운되고 있습니다. 따라서, 이러한 유형의 시스템에 동적 통찰력을 얻기 위해이 빠른 시간 규모에서 일을하는 것이 중요합니다. 우리는 성공적으로 지역화 된 펩?...

공개

We have nothing to disclose.

감사의 말

We gratefully acknowledge Dr. Markus Zweckstetter for providing the pdb coordinate file for the 'native' tau ensemble predicted from his NMR work, with contributed analysis tools provided by Dr. Adnan Sljoka. Funding for this work was provided by the Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC) ENGAGE Grant program.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Poly(methyl methacrylate) or PMMAProfessional PlasticsSACR.250CCP8.9 cm x 3.8 cm x 0.6 cm
Fused Silica Glass CapillaryPolymicro Technologies106815-0018ID: 75 µm, OD: 150 µm
Metal CapillariesMcMaster-Carr28 ga – 89875K97
30 ga  - 89875K99
Fluorinated Ethylene Propylene (FEP) TubingIDEX1477
1548		ID: 0.007”, OD: 1/16”
ID: 0.020”, OD: 1/16”
Standard Polymer Tubing CutterIDEXA-327for 1/16” and 1/8” OD tubing
Micro Static Mixing TeeIDEXM-540for 1/16” OD tubing
or
Stainless Steel Tee, 0.25 mm BoreValco Instruments Co., Inc. (VICI)ZT1Cfor 1/16” OD tubing
PEEK Tee for 1/16” OD TubingIDEXP-727
10-32 Female to Female LuerIDEXP-659
10-32 PEEK Double-Winged NutIDEXF-300
Ferrule for 1/16” OD TubingIDEXF-142
100 Series Rotary ToolDremelF013010001
Cut-Off DiscsJobmate1/64” thickness
Stereomaster Digital Zoom MicroscopeFisher Scientific12-563-411
Soldering IronMastercraft58-6301-2
VersaLaserUniversal Laser
SyringesHamilton81220500 µL capacity
Syringe PumpsHarvard Apparatus70-4501
NameCompanyCatalog NumberComments
Reagents
NHS-Activated AgaroseFisher Scientific26196
Pepsin from Porcine Gastric MucosaSigma-AldrichP6887-250MG
Deuterium OxideSigma-Aldrich151882-10X0.6ML
Acetic AcidSigma-Aldrich695092-100ML
HPLC Grade WaterFisher ScientificW5-4
Ammonium AcetateSigma-AldrichA7330-500G
Sodium PhosphateFisher ScientificS369-500
Sodium ChlorideFisher ScientificS671-3
NameCompanyCatalog NumberComments
Software/Online Tools
CorelDraw X3Corel
Molecular Weight CalculatorVersion 6.49Open Source MS Tool
mMassVersion 5.5.0Open Source MS Tool
ExPASy FindPeptSwiss Institute of Bioinformatics
SigmaPlotSystat SoftwareVersion 11.0
PyMOLSchrödingerVersion 1.5.0.4
NameCompanyCatalog NumberComments
Instruments
QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass SpectrometerAB SCIEX

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