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Resumen

Las uniones intercelulares son requisitos para las funciones y desarrollo específicos de la glándula mamaria. Este manuscrito proporciona un protocolo detallado para el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP) y co-localización utilizando glándulas mamarias murinas. Estas técnicas permiten investigar la dinámica de la asociación física entre las uniones intercelulares en diferentes etapas del desarrollo.

Resumen

Las interacciones célula-célula juegan un papel fundamental en la preservación de la integridad del tejido y la barrera entre los diferentes compartimentos de la glándula mamaria. Estas interacciones son proporcionadas por proteínas de unión que forman nexos entre células adyacentes. La pérdida de función y, en consecuencia, la disfunción de los órganos, pueden producir una errónea asociación de proteínas de unión y una asociación física reducida con sus socios de unión. Por lo tanto, identificar la localización de proteínas y las interacciones proteína-proteína (IPP) en los tejidos normales y relacionados con la enfermedad es esencial para encontrar nuevas evidencias y mecanismos que conduzcan a la progresión de enfermedades o alteraciones en el estado de desarrollo. Este manuscrito presenta un método de dos pasos para evaluar los IBP en las glándulas mamarias murinas. En la sección de protocolo 1, se describe un método para realizar co-inmunofluorescencia (co-IF) usando anticuerpos contra las proteínas de interés, seguidos de anticuerpos secundarios marcados con fluorocromos. Aunque todos losOws para la demostración de la proximidad de las proteínas, permite estudiar sus interacciones físicas. Por lo tanto, se proporciona un protocolo detallado para co-inmunoprecipitación (co-IP) en la sección de protocolo 2. Este método se usa para determinar las interacciones físicas entre proteínas, sin confirmar si estas interacciones son directas o indirectas. En los últimos años, las técnicas co-IF y co-IP han demostrado que ciertos componentes de las uniones intercelulares co-localizan e interactúan entre sí, creando nexos de unión dependientes de la etapa que varían durante el desarrollo de la glándula mamaria.

Introducción

El crecimiento y desarrollo de la glándula mamaria ocurre principalmente después del nacimiento. Este órgano se remodela constantemente a lo largo de la vida reproductiva de un mamífero 1 . El epitelio de la glándula mamaria adulta está compuesto por una capa interna de células epiteliales luminales y una capa externa de células basales, compuestas principalmente por células mioepiteliales, rodeadas por una membrana basal 2 . Para una buena revisión sobre la estructura y desarrollo de la glándula mamaria, el lector puede referirse a Sternlicht 1 . Las interacciones célula-célula a través de la separación (GJ), estrecha (TJ), y adherens (AJ) las uniones son necesarias para el desarrollo normal y la función de la glándula 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los componentes principales de estas uniones en la glándula mamaria murina son Cx26, Cx30, Cx32 y Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 y -7 yZO - 1 (TJ); Y E-cadherina, P-cadherina y β-catenina (AJ) 7 , 8 . Los niveles de expresión de estas diferentes proteínas de unión varían de una manera dependiente de la etapa durante el desarrollo de la glándula mamaria, lo que sugiere diferencial célula-célula interacción requisitos [ 9] . GJ, TJ y AJ están ligados estructural y funcionalmente y atar otras proteínas estructurales o reguladoras a los sitios vecinos de las células adyacentes, creando así un nexo de unión 10 . La composición del nexo de unión puede impactar el puente con el citoesqueleto subyacente, así como la permeabilidad y estabilidad del nexo, y por consiguiente puede influir en la función de la glándula 8 , 9 , 10 , 11 . Los componentes de las uniones intercelulares que residen en nexos de unión o que interactúan entre sí en difSe analizaron recientemente las diferentes etapas del desarrollo de la glándula mamaria con co-inmunofluorescencia (co-IF) y co-inmunoprecipitación (co-IP) 9 . Mientras que otras técnicas permiten la evaluación de la asociación funcional entre proteínas, estos métodos no se presentan en este manuscrito.

Como las proteínas simplemente actúan solas para funcionar, el estudio de las interacciones proteína-proteína (IPP), como las transducciones de señales y las cascadas bioquímicas, es esencial para muchos investigadores y puede proporcionar información significativa sobre la función de las proteínas. Co-IF y el análisis microscópico ayudan a evaluar algunas proteínas que comparten el mismo espacio subcelular. Sin embargo, el número de dianas está limitado por los anticuerpos, que deben ser criados en diferentes animales, y por el acceso a un microscopio confocal equipado con láseres de longitud de onda diferentes y un detector espectral para multiplexación. Co-IP confirma o revela interacciones físicas de alta afinidad entreEntre dos o más proteínas que residen dentro de un complejo de proteínas. A pesar del desarrollo de nuevas técnicas, como la transferencia de energía de resonancia de fluorescencia (FRET) 12 y el ensayo de ligación de proximidad (PLA) 13 , que pueden detectar simultáneamente la localización e interacciones de proteínas, el co-IP sigue siendo una técnica apropiada y asequible para estudiar interacciones entre Proteínas endógenas.

El método paso a paso descrito en este manuscrito facilitará el estudio de la localización de proteínas y los IBP y señalará las trampas a evitar al estudiar IPP endógenos en las glándulas mamarias. La metodología comienza con la presentación de los diferentes procedimientos de conservación de los tejidos necesarios para cada técnica. La parte 1 presenta cómo estudiar la co-localización de las proteínas en tres etapas: i) el corte de las glándulas mamarias, ii) el etiquetado doble o triple de diferentes proteínas mediante la técnica del co-IF, y iii)Localización de proteínas. La Parte 2 muestra cómo precipitar una proteína endógena e identificar sus proteínas que interactúan en tres etapas: i) preparación del lisado, ii) inmunoprecipitación indirecta de la proteína, y iii) identificación del asociado de unión por SDS-PAGE y Western blot. Cada paso de este protocolo se optimiza para tejidos de glándula mamaria de roedor y genera resultados de alta calidad, específicos y reproducibles. Este protocolo también puede utilizarse como punto de partida para estudios PPI en otros tejidos o líneas celulares.

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Protocolo

Todos los protocolos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Universitario de Cuidado de Animales (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canadá).

1. Identificación de la co-localización de proteínas

  1. Del tejido a las diapositivas microscópicas
    NOTA: Los tejidos y secciones deben ser manipulados en hielo seco.
    1. Excise las glándulas mamarias de un animal (para una descripción completa de este procedimiento, consulte Plante et al. ) 14 .
    2. Incrusta el tejido escindido en medio de congelación / montaje sobre hielo seco. Añadir suficiente medio para cubrir la glándula. Cuando el medio se solidifica, transfiera los tejidos a un congelador a -80 ° C para uso posterior 9 .
    3. Usando un cryomicrotome establecido a ≤ -35 ​​° C, corte los tejidos en secciones de 7-10 μm de espesor y colóquelos en portaobjetos de microscopio.
      NOTA: Cuando sea posible, coloque dos secciones en cada diapositiva; La sección izquierda se utilizará comoUn control negativo para verificar la especificidad de los anticuerpos y la autofluorescencia del tejido, mientras que el lado derecho se marcará con los anticuerpos.
    4. Mantenga las secciones a -80 ° C para su uso posterior.
  2. Tinción con Co-IF
    1. Recuperar los portaobjetos microscópicos del congelador y fijar inmediatamente las secciones sumergiéndolas en formaldehído al 4% durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT).
    2. Luego sumerja los portaobjetos en solución salina tamponada con fosfato (PBS) a RT. Deje las diapositivas en PBS a RT hasta continuar con el paso siguiente.
    3. Circule cada sección de la diapositiva usando una barrera hidrófoba disponible comercialmente o un lápiz de laboratorio repelente al agua (vea la Tabla de Materiales ). Tenga cuidado de no tocar el tejido. Inmediatamente agregar gotas de PBS al tejido y colocar la diapositiva en una cámara de histología húmeda para el resto del procedimiento.
      NOTA: Las secciones de tejido deben permanecer hidratadas. AlternativaUtilice una caja con una tapa y coloque toallas de papel mojadas en la parte inferior.
    4. Bloquear cada sección de tejido con 100-200 μl de albúmina de suero bovino al 3% (BSA) - solución salina tamponada con Tris (TBS) -0,1% de polisorbato 20 (véase la Tabla de Materiales ) durante 30 minutos a TA. Mientras las muestras están bloqueando, preparar las soluciones de anticuerpos primario y secundario mediante la dilución de los anticuerpos en TBS-0,1% de polisorbato 20.
      NOTA: La concentración requerida para el anticuerpo es proporcionada por el fabricante; Véase la Tabla de Materiales y las Figuras 1 y 2 para ejemplos, así como Dianati et al. 9 . Aunque no es necesario trabajar en la oscuridad cuando se usa la mayoría de los anticuerpos conjugados con fluoróforo, evite exponer las soluciones de anticuerpos o tejidos teñidos a luz intensa y brillante.
    5. Se retira la solución de bloqueo por aspiración e incuba las secciones en 100-200 μl del anticuerpo primario diluido durante 60 minutos a TA. AlternativelY, incubar con el anticuerpo primario durante la noche a 4ºC.
    6. Eliminar la solución de anticuerpo primario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado por aspiración y repita el lavado dos veces.
    7. Se retira la solución de lavado por aspiración e incuba las secciones con 100-200 μl del anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo apropiado durante 60 minutos a TA.
    8. Eliminar la solución de anticuerpo secundario por aspiración y lavar las secciones con 250-500 μ l de TBS-0,1% de polisorbato 20 durante 5 min. Retire la solución de lavado y repita dos veces.
    9. Repita el paso 2.5-2.8 usando la combinación apropiada de anticuerpos primarios y secundarios para la proteína o proteínas posteriores de interés.
    10. Se retira la solución de lavado por aspiración y se realiza la tinción del núcleo incubando la sección con 100-200 μl de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) de 1 mg / ml en TBS-polisorbato al 0,1% 20 durante 5 min aRT.
    11. Retire la solución DAPI por aspiración y monte las diapositivas con un medio de montaje soluble en agua y no fluorescente (consulte la Tabla de materiales ) y cubreobjetos. Continúe con una diapositiva a la vez.
      NOTA: La incubación de la mancha del núcleo durante más de 5 min no cambiará la intensidad de la tinción. Alternativamente, retire la solución de DAPI en todas las diapositivas e incube los tejidos en PBS mientras monta las diapositivas.
    12. Coloque los portaobjetos planos en un refrigerador de 4 ° C durante al menos 8 h. Proceda a la obtención de imágenes microscópicas de fluorescencia (ver Figuras 1 y 2 ).
  3. Imágenes microscópicas
    1. Visualizar los anticuerpos secundarios conjugados con fluoróforo utilizando un microscopio confocal equipado con los diversos láseres necesarios para excitar los fluoróforos en sus longitudes de onda específicas.
      Nota: Para poder visualizar conductos y alvéolos, se sugiere un objetivo de 40X con una apertura numérica de 0.95. Un ejemploE de los ajustes específicos se proporciona en la Figura 1 .
    2. Verificar la localización de cada proteína individualmente escaneando la imagen una longitud de onda en ese momento.
      Nota: En esta etapa, es importante analizar críticamente la localización de las proteínas de unión. Para poder formar nexos de unión, estas proteínas deben estar localizadas en la membrana plasmática.
    3. Determinar la co-localización de proteínas mediante la fusión de las imágenes escaneadas con los láseres en las diferentes longitudes de onda.
      Nota: La co-localización de las proteínas se puede visualizar mediante el cambio de color resultante de la emisión de dos o más fluoróforos en el mismo lugar y puede medirse utilizando el software apropiado ( Figuras 1 y 2 ).

2. El estudio de los IPP

NOTA: Las glándulas mamarias abdominales deben usarse para estudiar los IPP, ya que las glándulas torácicas están en estrecha asociación con el pectoralmúsculos. Excise las glándulas mamarias (para una descripción completa de este procedimiento, véase Plante et al .) 14 y mantenerlos a -80 ° C para su uso posterior.

  1. Preparación del lisado
    1. Coloque papel de pesaje y tubos de microcentrífuga de 2 mL en hielo seco para precalentarlos antes de proceder con los siguientes pasos.
    2. Tome el tejido de la glándula mamaria desde -80 ° C y mantenerlos en hielo seco.
    3. Pesar los tejidos en los papeles de pesaje pre-enfriados y luego transferir el tejido a tubos de microcentrífuga de 2 ml (mango en hielo seco). Utilizar entre 50 y 100 mg de tejido por muestra. Mantenga el tejido en hielo seco hasta el paso 2.1.5.
    4. Preparar la cantidad requerida de tampón de lisis de detergente triple suplementado con NaF, NaVO 3 y inhibidor de proteasa / fosfatasa, como se indica en la Tabla de Materiales , usando las siguientes fórmulas. Ratones: tampón requerido (μL) = peso de tejido de ratón (mg) x 3; Rata: requeridoTampón (μL) = peso del tejido de rata (mg) x 5.
    5. Añadir la cantidad necesaria de tampón de lisis enfriado con hielo (calculado en el paso 2.1.4) al tubo de 2 ml que contiene el tejido.
      NOTA: En los pasos 2.1.5-2.1.6, proceda con un solo tubo a la vez.
    6. Homogeneizar el tejido durante 30-40 s utilizando homogeneización continua en un molino de tejidos; Siempre mantener el tubo en el hielo. Ajuste el homogeneizador de tejidos a velocidad media y mueva suavemente la amoladora hacia arriba y hacia abajo dentro del tubo.
    7. Repita los pasos 1.6 y 1.7 con los otros tubos.
    8. Incubar los lisados ​​en hielo durante 10-30 min.
    9. Centrifugar los tubos a 170 xg durante 10 min a 4 ° C.
    10. Mientras tanto, identifique 6-10 tubos de microcentrífuga (0.6 mL) para cada muestra y manténgalos en hielo.
    11. Una vez realizada la centrifugación, revise los tubos. Asegúrese de que contienen una capa superior de lípidos claros, amarillos a rosados ​​(dependiendo de la etapa de desarrollo) y un gránulo.
    12. Crear un agujero en la capa de lípidosUtilizando una punta de pipeta de 200 μl para acceder a la fase líquida. Cambiar la punta y recoger el lisado sin alterar el gránulo ni aspirar la capa lipídica. Alícuota del lisado en tubos previamente marcados sobre hielo (paso 2.1.11) y almacénelos a -80 ° C.
    13. Utilice una alícuota para cuantificar la concentración de proteína usando un kit comercial apropiado disponible (véase la Tabla de Materiales ).
  2. Inmunoprecipitación indirecta
    1. En hielo, descongelar dos alícuotas de los lisados ​​totales de glándula mamaria preparados previamente.
      NOTA: Se utilizará una alícuota para la IP de la proteína diana, mientras que la otra servirá como control negativo.
    2. Recoger 500-1.000 μ g del lisado y diluir en PBS para llegar a un volumen final de 200 μ l en cada 1,5 ml de tubo.
      NOTA: La cantidad de lisado a utilizar depende de la abundancia de la proteína de interés y de la eficacia del anticuerpo (véase la Figura 3 para unaN ejemplo, así como la Tabla de Materiales ). Para optimizar para cada blanco, deben usarse diferentes cantidades de lisado ( es decir, 500, 750 y 1.000 mu g) y anticuerpo ( es decir, 5, 10 y 20 mu g). Proceda con los siguientes pasos (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Añadir el anticuerpo contra el antígeno de interés para el primer tubo de lisado y mantenerlo en hielo.
      NOTA: La cantidad requerida suele ser sugerida en la hoja de instrucciones proporcionada por cada empresa (vea la Tabla de Materiales ).
    4. En el segundo tubo, preparar un control negativo mediante la adición de la misma concentración de isotipo IgG control que el anticuerpo utilizado en el paso 2.2.3.
    5. Incubar los tubos durante una noche a 4 ° C en un mezclador de rodillos de tubo a baja velocidad.
    6. Al día siguiente, añadir 50 μl de perlas magnéticas a nuevos tubos de 1,5 ml para el prelavado.
      1. Seleccione las perlas magnéticas de Proteína A o Proteína G basadas en la afinidad relativa con el anticuerpo.
      2. Es importante evitar el uso de cuentas agregadas; Mezcle suavemente la suspensión del talón hasta que se vuelva a suspender uniformemente antes de añadirlo a los tubos.
    7. Coloque los tubos que contienen las perlas en el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Retire el tampón de almacenamiento de las perlas utilizando una pipeta de 200 μl.
    8. Lavar las perlas mediante la adición de 500 μ l de PBS-0,1% polisorbato 20 y vórtice los tubos vigorosamente durante 10 s.
    9. Coloque los tubos de nuevo en el soporte magnético y permitir que los granos de migrar al imán.
    10. Retire el exceso de tampón de lavado pipeteando con una pipeta de 200 μl.
    11. Añadir el complejo de reacción (lisado-anticuerpo) del paso 2.2.5 a las perlas e incubar durante 90 minutos a RT en el mezclador de rodillos.
    12. Coloque los tubos sobre el soporte magnético y permita que las perlas migren al imán. Utilizando una pipeta de 200 μl, aspirar y descartar el lisado y colocar los tubos sobre hielo.
    13. Lavar el cordónS añadiendo 500 μl de PBS, colocando los tubos en el soporte magnético y retirando el líquido usando una pipeta de 200 μl. Repita este paso de lavado. Durante los pasos de lavado, evitar vórtex y mantener las muestras en hielo.
    14. Lavar las perlas una vez con PBS-0,1% de polisorbato 20 sin agitar en vórtice y descartar el último tampón de lavado usando una punta de pipeta de 200 mu l.
    15. Para eluir, añadir 20 μL de glicina ácida 0,2 M (pH = 2,5) a los tubos y agitarlos durante 7 min en el mezclador de rodillos.
    16. Centrifugar a alta velocidad durante unos segundos (centrifugado rápido) y recoger el sobrenadante en un tubo fresco helado.
    17. Repita los pasos 2.2.14 y 2.2.15 para cada tubo.
      NOTA: El volumen final será de 40 μl.
    18. Añadir 10 μl de tampón Laemmli 4x a la muestra eluida de 40 μl de la etapa 2.2.16.
      NOTA: El color se vuelve amarillo debido al pH ácido.
    19. Se añade inmediatamente Tris 1 M (pH = 8), una gota a la vez, a la muestra eluida del paso 2.2.18 hasta que su colorSe vuelve azul. Proceda a los tubos siguientes.
    20. Hervir las muestras de la etapa 2.2.18 a 70-90 ° C durante 10 min. Proceder inmediatamente a electroforesis en gel. Alternativamente, transfiera las muestras a un congelador a -80 ° C hasta su carga.
  3. Aplicación aguas abajo: electroforesis en gel seguido de Western blot
    1. Preparar separando y apilando geles de SDS-PAGE acrilamida (espesor de 1,5 mm) siguiendo los procedimientos estándar 15 .
      NOTA: La elección del gel (8-15% de acrilamida, gradiente: véase la Tabla de Materiales ) debe determinarse en base al tamaño molecular de la proteína a precipitar y de los posibles socios de unión a analizar. Estas proteínas deben resolverse entre sí para permitir una inmunodetección adecuada.
    2. Descongele las muestras de inmunoprecipitación (IP) (paso 2.2.20) sobre hielo.
    3. Preparar lisados ​​de proteínas de las mismas muestras (utilizadas para el procedimiento de IP anterior). Utilice 50 Mu g de lisado total y añadir tampón de muestra Laemmli 4X. Hervir las muestras a 70-90 ° C durante 5 min y colocar en hielo hasta la carga.
      NOTA: Estas muestras se cargarán junto a la muestra de IP eluida para demostrar la presencia de proteínas precipitadas en el lisado total.
    4. Cargar los lisados ​​preparados de la etapa 2.3.3 y las muestras precipitadas de la etapa 2.2.20 lado a lado en un gel de acrilamida y ejecutarlos en tampón de funcionamiento (10 x tampón de funcionamiento: 30,3 g de Tris, 144,1 g de glicina y 10 G de SDS en 1 L de agua destilada) a 100 V durante aproximadamente 95 min, o hasta que el borde de las proteínas migratorias alcance el fondo del gel.
    5. Transferir los geles a una membrana de nitrocelulosa o PVDF utilizando un protocolo estándar 9 , 15 .
    6. Bloquear la membrana durante 1 h en un balancín a baja velocidad en leche seca al 5% -TTBS (Tris 20 mM, NaCl 500 mM y polisorbato 20 al 0,05%).
    7. Identificar si la precipitación fue satisfactoriaExitosa.
      1. Examinar la membrana utilizando el primer anticuerpo contra la proteína precipitada, diluida en 5% de leche seca-TTBS a la concentración recomendada por el fabricante, durante la noche a 4 ° C sobre una plataforma de balanceo con agitación lenta.
        NOTA: Consulte la Tabla de Materiales para recomendaciones.
      2. Al día siguiente, se lava la membrana 3 veces durante 5 min cada una con TTBS sobre una plataforma basculante con alta agitación.
      3. Incubar la membrana en el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano (HRP), diluido en TTBS, durante 1 h a RT en una plataforma oscilante con agitación lenta.
        NOTA: Alternativamente, puede usarse un anticuerpo secundario conjugado con un fluorocromo si está disponible un aparato apropiado para detectar la señal.
      4. Realizar 3 a 6 lavados, cada uno durante 5 min, con TTBS en una plataforma de balanceo con alta agitación. Analizar la señal del anticuerpo secundario incubando la membrana con un anticuerpo comercial(Véase la tabla de materiales ) y siga las instrucciones del fabricante. Detectar la señal utilizando un sistema de imagen de quimioluminiscencia (véase la tabla de materiales ).
        NOTA: Para un protocolo detallado sobre el análisis de transferencia de Western, véase la Referencia 16.
    8. Para identificar proteínas que interactúan, realizar los pasos 2.3.7.1-2.3.7.4 usando los anticuerpos apropiados en la misma mancha.
      NOTA: Si las proteínas están interactuando, los compañeros de unión serán co-inmunoprecipitados con la proteína diana y, por tanto, serán detectables por transferencia Western. El paso 2.3.8 puede repetirse con más anticuerpos para determinar si otras proteínas residen en el mismo complejo de proteínas, siempre y cuando los pesos moleculares de las proteínas difieran lo suficiente como para estar bien separados en el gel y la membrana.
    9. Para confirmar que los interlocutores identificados no son artefactos, se debe realizar una IP recíproca.
      NOTA: Esto se realiza repitiendoPasos 2.2.1-2.2.20 con el mismo lisado pero precipitando uno de los socios de unión identificados en el paso 3.8. Después, los pasos 3.1-3.8 se repiten usando el anticuerpo primario contra la primera proteína de interés.

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Resultados

Para determinar si los componentes de GJ, AJ y TJ pueden interactuar juntos en la glándula mamaria, se realizaron primero ensayos de co-IF. Cx26, una proteína GJ, y β-Catenina, una proteína AJ, se probaron con anticuerpos específicos y se revelaron usando anticuerpos de ratón-647 (verde, pseudocolor) y cabra-568 (rojo) conjugados con fluoróforo, respectivamente ( Figura 1B y C ) . Los datos mostraron que co-localizar en la membrana celular de cél...

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Discusión

Las interacciones célula-célula a través de las uniones son necesarias para el correcto funcionamiento y desarrollo de muchos órganos, como la glándula mamaria. Los estudios han demostrado que las proteínas de unión pueden regular la función y la estabilidad de unos a otros y activar la transducción de señales al atarse mutuamente en la membrana celular [ 10] . Los protocolos presentados en el actual manuscrito han proporcionado interesantes descubrimientos sobre la proteína de unión ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que declarar.

Agradecimientos

IP es financiado por una beca del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería del Canadá (NSERC # 418233-2012); Un Fondo de Investigación de Quebec-Santé (FRQS), un premio de carrera de la Fundación de Cáncer de Mama de Quebec y una subvención de Leader Founds de la Fundación Canadiense para la Innovación. ED recibió una beca de la Fundación universitaria Armand-Frappier.

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Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

Referencias

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