JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Межклеточные соединения являются реквизитами для специфических функций и развития молочной железы. В этой рукописи содержится подробный протокол изучения белково-белковых взаимодействий (ИЦП) и совместной локализации с использованием мышиных молочных желез. Эти методы позволяют исследовать динамику физической связи между межклеточными переходами на разных стадиях развития.

Аннотация

Клеточные клетки играют ключевую роль в сохранении целостности тканей и барьера между различными отделениями молочной железы. Эти взаимодействия обеспечивают взаимодействующие белки, которые образуют нексусы между соседними клетками. Неправильная локализация белка и снижение физических ассоциаций с их партнерами по связыванию могут привести к потере функции и, следовательно, к дисфункции органов. Таким образом, идентификация локализации белка и белково-белковых взаимодействий (ИЦП) в нормальных и связанных с заболеванием тканях имеет важное значение для поиска новых доказательств и механизмов, ведущих к прогрессированию заболеваний или изменений в статусе развития. Эта рукопись представляет собой двухэтапный метод оценки ИПП в мышечных молочных железах. В разделе 1 протокола описывается способ проведения совместной иммунофлуоресценции (co-IF) с использованием антител, выращенных против представляющих интерес белков, с последующими вторичными антителами, меченными флуорохромами. Хотя со-IF всеДля демонстрации близости белков, это позволяет изучать их физические взаимодействия. Поэтому подробный протокол для совместного иммунопреципитации (со-IP) предоставляется в разделе 2 протокола. Этот метод используется для определения физических взаимодействий между белками, не подтверждая, являются ли эти взаимодействия прямыми или косвенными. В последние несколько лет методы совместного ИФ и со-IP продемонстрировали, что некоторые компоненты межклеточных соединений совместно локализуются и взаимодействуют друг с другом, создавая сценические взаимосвязи, которые изменяются в процессе развития молочной железы.

Введение

Рост и развитие молочной железы происходит в основном после рождения. Этот орган постоянно реконструируется в течение всей репродуктивной жизни млекопитающего 1 . Эпителий молочной железы взрослых состоит из внутреннего слоя эпителиальных клеток просвета и внешнего слоя базальных клеток, в основном состоящих из миоэпителиальных клеток, окруженных подвальной мембраной 2 . Для хорошего обзора структуры и развития молочной железы читатель может обратиться к Sternlicht 1 . Для нормального развития и функции железы 1 , 3 , 4 , 5 , 6 необходимы клеточные взаимодействия через щелевые (GJ), тесные (TJ) и адгезивные (AJ) переходы. Основными компонентами этих соединений в мышечной молочной железе являются Cx26, Cx30, Cx32 и Cx43 (GJ); Claudin-1, -3, -4 и -7 иZO-1 (TJ); И E-кадгерин, P-кадгерин и β-катенин (AJ) 7,8 . Уровни экспрессии этих различных белков-мишеней изменяются в зависимости от стадии в процессе развития молочной железы, что предполагает дифференциальное взаимодействие клеток с клетками 9 . GJ, TJ и AJ связаны структурно и функционально и связывают другие структурные или регуляторные белки с соседними сайтами соседних клеток, создавая, таким образом, функциональную связь 10 . Состав соединительной связи может влиять на мостик с основным цитоскелетом, а также на проницаемость и стабильность связи и может, следовательно, влиять на функцию железы 8 , 9 , 10 , 11 . Компоненты межклеточных соединений, находящихся в узловых связях или взаимодействующих друг с другом при разныхНедавно были проанализированы первые стадии развития развития молочной железы с использованием совместной иммунофлуоресценции (co-IF) и совместного иммунопреципитации (со-IP) 9 . В то время как другие методы позволяют оценить функциональную связь между белками, эти методы не представлены в этой рукописи.

Поскольку белки действуют только один, чтобы работать, изучение белково-белковых взаимодействий (ИЦП), таких как трансдукция сигналов и биохимические каскады, важно для многих исследователей и может предоставить значительную информацию о функции белков. Co-IF и микроскопический анализ помогают оценить несколько белков, которые разделяют одно и то же субклеточное пространство. Однако количество мишеней ограничено антителами, которые должны быть выращены у разных животных, а также доступом к конфокальному микроскопу, оснащенному различными лазерными волнами длины и спектральным детектором для мультиплексирования. Co-IP подтверждает или показывает физическое взаимодействие с высоким сродством betwEen два или более белка, находящихся в белковом комплексе. Несмотря на разработку новых методов, таких как флуоресцентный резонансный перенос энергии (FRET) 12 и анализ лигирования близости (PLA) 13 , который может одновременно обнаруживать локализацию и взаимодействие белков, со-IP остается подходящим и доступным методом для изучения взаимодействий между Эндогенных белков.

Пошаговый метод, описанный в этой рукописи, облегчит изучение локализации белка и ИЦП и укажет на ловушки, чтобы избежать изучения эндогенных ИЦП в молочных железах. Методология начинается с представления различных процедур консервации тканей, необходимых для каждого метода. В части 1 показано, как изучать совместную локализацию белка в три этапа: i) секционирование молочных желез, ii) двойную или тройную маркировку различных белков с использованием метода co-IF, и iii) визуализациюЛокализация белка. В части 2 показано, как осадить эндогенный белок и идентифицировать его взаимодействующие белки в три этапа: i) препарат лизата, ii) иммунопреципитацию непрямого белка и iii) идентификацию связывающего партнера с помощью SDS-PAGE и Вестерн-блоттинга. Каждый шаг этого протокола оптимизирован для тканей молочной железы грызунов и генерирует высококачественные, специфичные и воспроизводимые результаты. Этот протокол также может быть использован в качестве отправной точки для исследований PPI в других тканях или клеточных линиях.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все протоколы животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Комитетом по уходу за животными в университете (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. Идентификация ко-локализации белка

  1. От ткани до микроскопических слайдов
    ПРИМЕЧАНИЕ. Ткани и секции следует обрабатывать на сухом льду.
    1. Акцизируйте молочные железы у животного (полное описание этой процедуры см. Plante et al. ). 14 .
    2. Вставьте вырезанную ткань в морозильную / крепежную среду на сухом льду. Добавьте достаточно среды, чтобы покрыть железу. Когда среда затвердевает, переносите ткани в морозильную камеру при -80 ° C для последующего использования. 9 .
    3. Используя криомикротома, установленную при ≤ -35 ​​° C, разрежьте ткани в секции толщиной 7-10 мкм и поместите их на слайды микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если возможно, поместите две секции на каждый слайд; Левая часть будет использоваться какНапример, для проверки специфичности антител и аутофлуоресценции ткани, тогда как правая сторона будет мечены антителами.
    4. Держите секции при -80 ° C для последующего использования.
  2. Краска Co-IF
    1. Извлеките подходящие микроскопические слайды из морозильника и сразу же зафиксируйте секции, погрузив их в формальдегид 4% в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
    2. Затем погрузите слайды в забуференный фосфатом физиологический раствор (PBS) при комнатной температуре. Оставьте слайды в PBS при RT до перехода к следующему шагу.
    3. Обведите кружочком каждую секцию слайда, используя коммерчески доступный гидрофобный барьер или водоотталкивающее лабораторное перо (см. Таблицу материалов ). Будьте осторожны, чтобы не коснуться ткани. Сразу же добавьте капли PBS в ткань и поместите слайд во влажную гистологическую камеру на оставшуюся часть процедуры.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Секции тканей должны оставаться увлажненными. альтернативаИспользуйте коробку с крышкой и поместите влажные бумажные полотенца на дно.
    4. Заблокируйте каждую секцию ткани 100-200 мкл 3% -ного буфера для сывороточного альбумина (BSA) -Tris-забуференного (TBS) -0,1% полисорбата 20 (см. Таблицу материалов ) в течение 30 минут при комнатной температуре . В то время как образцы блокируют, подготавливают первичные и вторичные растворы антител путем разбавления антител в TBS-0,1% полисорбате 20.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая концентрация для антитела предоставляется изготовителем; См. Таблицу материалов и рисунки 1 и 2 для примеров, а также Dianati et al. 9 . Хотя нет необходимости работать в темноте при использовании большинства конъюгированных с флуорофором антител, избегайте подвергать растворы антител или окрашенные ткани интенсивному яркому свету.
    5. Удалите блокирующий раствор путем аспирации и инкубируйте секции в 100-200 мкл разбавленного первичного антитела в течение 60 мин при комнатной температуре. AlternativelY, инкубируют с первичным антителом в течение ночи при 4 ° C.
    6. Удалите исходный раствор антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор путем аспирации и дважды повторите промывку.
    7. Удалите промывочный раствор путем аспирации и инкубируйте секции со 100-200 мкл подходящего вторичного антитела, конъюгированного с флуорофором, в течение 60 мин при комнатной температуре.
    8. Удалите раствор вторичного антитела путем аспирации и промойте секции 250-500 мкл TBS-0,1% полисорбата 20 в течение 5 мин. Удалите промывочный раствор и повторите дважды.
    9. Повторите шаг 2.5-2.8 с использованием соответствующей комбинации первичных и вторичных антител для последующего белка (ов), представляющих интерес.
    10. Удаляют промывочный раствор путем аспирации и проводят окрашивание ядер путем инкубации секции с 100-200 мкл 4 мг, 4-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) 1 мг / мл в TBS-0,1% полисорбате 20 в течение 5 мин приRT.
    11. Удалите раствор DAPI путем аспирации и смонтируйте слайды с использованием водорастворимой, не флуоресцирующей монтажной среды (см. Таблицу материалов ) и покровных. Выполните одно слайд за раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Инкубация пятна ядра более 5 мин не изменит интенсивность окрашивания. Альтернативно, удалите раствор DAPI на всех слайдах и инкубируйте ткани в PBS при установке слайдов.
    12. Поместите слайды в холодильник с температурой 4 ° C не менее 8 часов. Перейдите к флуоресцентной микроскопической визуализации (см. Рисунки 1 и 2 ).
  3. Микроскопическое изображение
    1. Визуализируйте вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, с использованием конфокального микроскопа, оборудованного различными лазерами, необходимыми для возбуждения флуорофоров на их конкретных длинах волн.
      Примечание. Чтобы иметь возможность визуализировать каналы и альвеолы, предлагается объектив 40X с числовой апертурой 0,95. ПримерE конкретных настроек приведена на рисунке 1 .
    2. Проверьте локализацию каждого белка индивидуально, сканируя изображение на одну длину волны в то время.
      Примечание. На этом этапе важно критически проанализировать локализацию соединительных белков. Чтобы иметь возможность образовывать узловые связи, эти белки должны локализоваться на плазматической мембране.
    3. Определите совместную локализацию белков путем слияния изображений, отсканированных с лазерами на разных длинах волн.
      Примечание. Совместная локализация белка может быть визуализирована путем изменения цвета в результате выброса двух или более флуорофоров в одном месте и может быть измерена с использованием соответствующего программного обеспечения ( рис. 1 и 2, а также см. Ссылку 9).

2. Изучение ИЦП

ПРИМЕЧАНИЕ. Брюшные молочные железы должны использоваться для изучения ИЦП, поскольку грудные железы находятся в тесной связи с грудныммышцы. Акцизируйте молочные железы (для полного описания этой процедуры, см. Plante et al .) 14 и держите их при -80 ° C для последующего использования.

  1. Подготовка лизата
    1. Поместите взвешивающую бумагу и 2 мл микроцентрифужные пробирки на сухой лед, чтобы предварительно охладить их, прежде чем приступать к следующим шагам.
    2. Возьмите ткань молочной железы с -80 ° C и держите их на сухом льду.
    3. Взвесьте ткани на предварительно охлажденную взвешивающую бумагу, а затем перенесите ткань в 2 мл микроцентрифужные пробирки (ручка на сухом льду). Используйте от 50 до 100 мг ткани на образец. Держите ткань на сухом льду до стадии 2.1.5.
    4. Подготовьте необходимое количество тройного моющего лизисного буфера, дополненного NaF, NaVO 3 и ингибитором протеазы / фосфатазы, как указано в таблице материалов , с использованием следующих формул. Мыши: требуемый буфер (мкл) = масса мышиной массы (мг) х 3; Крыса: требуетсяБуфер (мкл) = масса ткани крысы (мг) х 5.
    5. Добавьте необходимое количество ледяного буфера для лизиса (рассчитанное на этапе 2.1.4) в пробирку объемом 2 мл, содержащую ткань.
      ПРИМЕЧАНИЕ. На этапах 2.1.5-2.1.6 приступайте к одной пробирке за раз.
    6. Гомогенизируйте ткань в течение 30-40 с, используя непрерывную гомогенизацию на тканевой мельнице; Всегда держите трубку на льду. Настройте гомогенизатор ткани на среднюю скорость и осторожно перемещайте мясорубку вверх и вниз внутри трубки.
    7. Повторите шаги 1.6 и 1.7 с другими пробирками.
    8. Инкубируйте лизаты на льду в течение 10-30 мин.
    9. Центрифугируйте пробирки при 170 × g в течение 10 мин при 4 ° C.
    10. Между тем, идентифицируйте 6-10 микроцентрифужных пробирок (0,6 мл) для каждого образца и держите их на льду.
    11. После центрифугирования проверьте трубы. Убедитесь, что они содержат верхний слой жировых, прозрачных, желто-розовых лизатов (в зависимости от стадии разработки) и гранулы.
    12. Создайте отверстие в липидном слоеИспользуя наконечник пипетки 200 мкл для доступа к жидкой фазе. Измените наконечник и собирайте лизат, не нарушая осадок или не аспирируя липидный слой. Выровняйте лизат в предварительно меченых пробирках на льду (шаг 2.1.11) и храните их при -80 ° C.
    13. Используйте аликвоту для количественной оценки концентрации белка с использованием соответствующего коммерчески доступного набора (см. Таблицу материалов ).
  2. Косвенная иммунопреципитация
    1. На льду оттаивают две аликвоты общего лизата молочной железы, приготовленные ранее.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Одна аликвота будет использоваться для IP целевого белка, тогда как другая будет служить отрицательным контролем.
    2. Соберите 500-1000 мкг лизата и разбавьте его в PBS, чтобы достичь конечного объема 200 мкл в каждой пробирке 1,5 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Количество используемого лизата зависит от обилия интересующего белка и эффективности антитела (см . Рисунок 3 дляN пример, а также таблица материалов ). Для оптимизации каждой мишени следует использовать различные количества лизата ( то есть 500, 750 и 1000 мкг) и антитела ( то есть 5, 10 и 20 мкг). Выполните следующие шаги (2.2.3-2.3.7.4).
    3. Добавьте антитело против интересующего антигена к первой трубке лизата и держите его на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Требуемая сумма обычно предлагается в инструкциях каждой компании (см . Таблицу ).
    4. Во второй трубке подготавливают отрицательный контроль, добавляя ту же концентрацию изотипа IgG в качестве антитела, используемого на этапе 2.2.3.
    5. Инкубируйте трубки в течение ночи при 4 ° С на трубчатом роликовом смесителе с низкой скоростью.
    6. На следующий день добавьте 50 мкл магнитных шариков в новые 1,5 мл пробирки для предварительной стирки.
      1. Выбирайте магнитные бусины Protein A или Protein G на основе относительной аффинности к антителу.
      2. Важно избегать использования агрегированных гранул; Осторожно смешайте суспензию шариков, пока она не будет равномерно перемотана перед добавлением ее в пробирки.
    7. Поместите трубки, содержащие шарики, на магнитную подставку и позвольте гранулам мигрировать к магниту. Удалите буфер хранения из бусинок с помощью пипетки 200 мкл.
    8. Вымойте гранулы, добавив 500 мкл PBS-0,1% полисорбата 20 и энергично встряхивайте пробирки в течение 10 с.
    9. Поместите трубки обратно на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту.
    10. Удалите избыточный промывочный буфер пипетированием пипеткой 200 мкл.
    11. Добавьте реакционный комплекс (лизат-антитело) из стадии 2.2.5 к гранулам и инкубируйте в течение 90 мин при комнатной температуре на роликовом смесителе.
    12. Поместите трубки на магнитную подставку и позвольте шарикам мигрировать к магниту. Используя пипетку 200 мкл, аспирируйте и отбросьте лизат и поместите трубки на лед.
    13. Вымойте шарикС добавлением 500 мкл PBS, помещения труб на магнитную подставку и удаления жидкости с использованием пипетки 200 мкл. Повторите эту операцию стирки. Во время стирки избегайте завихрения и держите образцы на льду.
    14. Вымойте гранулы один раз с помощью полисорбата 20 PBS-0,1% без завихрения и отбросьте последний промывочный буфер, используя наконечник пипетки 200 мкл.
    15. Для элюирования добавьте 20 мкл 0,2 М кислого глицина (pH = 2,5) в пробирки и встряхните их в течение 7 минут на роликовом смесителе.
    16. Центрифуга на высокой скорости в течение нескольких секунд (быстрое вращение) и собирать супернатант в свежей ледяной пробирке.
    17. Повторите шаги 2.2.14 и 2.2.15 для каждой трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Конечный объем будет составлять 40 мкл.
    18. Добавить 10 мкл 4x буфера Laemmli в 40-литровый элюированный образец с этапа 2.2.16.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Цвет станет желтым из-за кислотного рН.
    19. Сразу же добавьте 1 М Трис (pH = 8), по одной капле за раз, к элюированному образцу с этапа 2.2.18 до его цветаСтановится синим. Перейдите к следующим пробиркам.
    20. Кипятите образцы с этапа 2.2.18 при 70-90 ° С в течение 10 мин. Немедленно приступить к гелевому электрофорезу. В качестве альтернативы, перенесите образцы в морозильную камеру при -80 ° C до загрузки.
  3. Нижеследующее применение: гель-электрофорез, затем вестерн-блот
    1. Подготовьте отделение и укладку акриламидных гелей SDS-PAGE (толщина 1,5 мм) в соответствии со стандартными процедурами 15 .
      ПРИМЕЧАНИЕ. Выбор геля (8-15% акриламида, градиент: см. Таблицу материалов ) должен определяться на основе молекулярного размера осаждаемого белка и анализируемых потенциальных партнеров связывания. Эти белки должны быть разрешены друг от друга, чтобы обеспечить надлежащее иммунодетекцию.
    2. Оттепель образцов с иммунопреципитацией (IP) (шаг 2.2.20) на льду.
    3. Подготовьте белковые лизаты из одних и тех же образцов (используется для процедуры IP выше). Использовать 50Мкг общего лизата и добавить буфер образца образца 4X Laemmli. Кипятите образцы при 70-90 ° С в течение 5 мин и поместите на лед до загрузки.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Эти образцы будут загружены рядом с элюированным образцом IP, чтобы продемонстрировать присутствие осажденных белков в общем лизате.
    4. Загрузите подготовленные лизаты из стадии 2.3.3 и осажденные образцы из стадии 2.2.20 бок о бок в акриламидном геле и запустите их в бегущем буфере (10-бетонный буфер: 30,3 г Триса, 144,1 г глицина и 10 Г SDS в 1 л дистиллированной воды) при 100 В в течение приблизительно 95 мин или до тех пор, пока край мигрирующих белков не достигнет дна геля.
    5. Перенесите гели на нитроцеллюлозу или мембрану PVDF, используя стандартный протокол 9 , 15 .
    6. Заблокируйте мембрану в течение 1 часа на качалке на низкой скорости в 5% сухого молока TTBS (20 мМ Трис, 500 мМ NaCl и 0,05% полисорбата 20).
    7. Определите, было ли достигнуто осадковплодотворный.
      1. Пробейте мембрану, используя первое антитело против осажденного белка, разведенного в 5% сухого молока TTBS в концентрации, рекомендованной производителем, в течение ночи при 4 ° C на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ. См. Таблицу материалов для рекомендаций.
      2. На следующий день промыть мембрану 3 раза в течение 5 минут каждый с помощью TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием.
      3. Инкубируйте мембрану в соответствующем вторичном антителе, конъюгированном с пероксидазой хрена (HRP), разбавленной в TTBS, в течение 1 часа при комнатной температуре на качающейся платформе с медленным перемешиванием.
        ПРИМЕЧАНИЕ. Альтернативно, вторичное антитело, конъюгированное с флуорохромом, можно использовать, если доступно соответствующее устройство для обнаружения сигнала.
      4. Выполните от 3 до 6 промывок, каждый в течение 5 минут, с TTBS на качающейся платформе с высоким перемешиванием. Проанализируйте сигнал вторичного антитела путем инкубации мембраны с помощью(См. Таблицу материалов ) и следуйте инструкциям производителя. Обнаружение сигнала с использованием системы хемилюминесцентной визуализации (см. Таблицу материалов ).
        ПРИМЕЧАНИЕ. Подробный протокол анализа вестерн-блоттинга см. В ссылке 16.
    8. Чтобы идентифицировать взаимодействующие белки, выполните шаги 2.3.7.1-2.3.7.4 с использованием соответствующих антител на одном и том же блоте.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Если белки взаимодействуют, партнеры по связыванию будут совместно иммунопреципитированы целевым белком и, таким образом, будут детектироваться с помощью Вестерн-блоттинга. Шаг 2.3.8 можно повторить с большим количеством антител, чтобы определить, находятся ли другие белки в одном и том же комплексе белков, если молекулярные массы белков достаточно различны, чтобы быть хорошо разделенными на геле и мембране.
    9. Чтобы подтвердить, что идентифицированные связывающие партнеры не являются артефактами, должен выполняться обратный IP.
      ПРИМЕЧАНИЕ. Это выполняется путем повторенияШаги 2.2.1-2.2.20 с тем же самым лизатом, но осаждающие один из партнеров по связыванию, определенных на этапе 3.8. Затем шаги 3.1-3.8 повторяют с использованием первичного антитела против первого представляющего интерес белка.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы определить, могут ли компоненты GJ, AJ и TJ взаимодействовать друг с другом в молочной железе, сначала выполнялись анализы ко-IF. Cx26, белок GJ и β-катенин, белок AJ, зондировали специфическими антителами и выявляли с использованием флуорофороконъюгированных антител мы?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Клеточные клетки взаимодействий через соединения необходимы для правильной функции и развития многих органов, таких как молочная железа. Исследования показали, что функциональные белки могут регулировать функцию и стабильность друг друга и активировать передачу сигнала путем соеди...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторам нечего объявлять.

Благодарности

ИС финансируется Советом по научным исследованиям в области естественных наук и инженерных исследований Канады (NSERC # 418233-2012); Fonds de Recherche du Québec-Santé (FRQS), карьера в области рака молочной железы в Квебеке и грант Лидера на получение гранта Канадского фонда поддержки инноваций. ED получил стипендию от Universidire Fandation Armand-Frappier.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

Ссылки

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены