Murin Makat Boğazlarında Gap, Sıkı ve Aderans Bağlantılarının Bileşenleri Arasındaki Protein-Protein Etkileşimlerinin ve Ortak Lokalizasyon Analizleri

Özet

Hücre içi kavşak, meme bezi aşamasına özgü fonksiyonlar ve gelişim için şarttır. Bu el yazması, protein-protein etkileşimlerinin (PPI'lar) çalışılması ve murin meme bezlerinin birlikte lokalizasyonu için ayrıntılı bir protokol sunmaktadır. Bu teknikler, farklı gelişim evrelerinde hücre-içi kavşaklar arasındaki fiziksel ilişkinin dinamiklerinin araştırılmasına olanak tanır.

Özet

Hücre-hücre etkileşimleri doku bütünlüğünü ve meme bezinin farklı bölmeleri arasındaki bariyerin korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bu etkileşimler, komşu hücreler arasında bağlar oluşturan bağlantılı proteinler tarafından sağlanmaktadır. Junctional protein mislokalizasyonu ve bağlanma partnerleriyle fiziksel birleşmelerin azalması, fonksiyon kaybına ve dolayısıyla organ işlev bozukluğuna neden olabilir. Bu nedenle, normal ve hastalıkla ilişkili dokulardaki protein lokalizasyonunu ve protein-protein etkileşimlerini (PPI'leri) tanımlamak, gelişme durumundaki hastalıkların veya değişikliklerin ilerlemesine yol açan yeni kanıt ve mekanizmalar bulmak için gereklidir. Bu el yazması, murin meme bezlerinde PPI'ları değerlendirmek için iki aşamalı bir yöntem sunmaktadır. Protokol bölüm 1'de, ilgilenilen proteinlere karşı geliştirilen antikorları, ardından florokromlarla etiketlenmiş ikincil antikorları kullanarak birlikte immünofloresans (co-IF) gerçekleştirmek için bir yöntem anlatılmıştır. Hep birlikte olsa daProteinlerin yakınlığının gösterilmesi için, fiziksel etkileşimlerini incelemeyi mümkün kılar. Bu nedenle, birlikte immüno çökelme (co-IP) için ayrıntılı bir protokol, protokol bölüm 2'de sağlanmaktadır. Bu yöntem, bu etkileşimlerin doğrudan veya dolaylı olup olmadığını teyit etmeden proteinler arasındaki fiziksel etkileşimleri belirlemek için kullanılır. Son birkaç yılda birlikte-IF ve birlikte IP teknikleri, hücrelerarası kavşaklardaki belirli bileşenlerin birlikte nöbetleşip birbirleriyle etkileşimde bulunduğunu ve meme bezi gelişiminde değişen aşamaya bağlı bileşke bağları oluşturduğunu göstermiştir.

Giriş

Meme bezi büyüme ve gelişme esas olarak doğumdan sonra gerçekleşir. Bu organ, bir memelinin üreme hayatında kendisini sürekli olarak yeniden şekillendirir ¹ . Yetişkin meme bezi epitelyumu luminal epitelyal hücrelerin bir iç tabaka ve esasen miyoepitelyal hücrelerden oluşan, bazal membranla çevrili ² bir bazal hücre tabakasından oluşur. Meme bezi yapısı ve gelişimiyle ilgili iyi bir inceleme için, okuyucu Sternlicht ^1'e başvurabilir. Boşluk (GJ), sıkı (TJ) ve adherens (AJ) kavşakları yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, bezin normal gelişimi ve fonksiyonu için ^{1 ,}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan protokolleri, Üniversite Hayvan Bakımı Komitesi tarafından onaylanmıştır (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Kanada).

1. Proteinlerin birlikte lokalizasyonunu tanımlama

1. Dokudan mikroskopik slaytlara
   NOT: Dokular ve bölümler kuru buz üzerinde ele alınmalıdır.
   1. Memede bezlerini bir hayvandan tüketin (bu prosedürün tam açıklaması için, Plante ve diğerlerine başvurun). ¹⁴ .
   2. Çıkarılan dokuyu dondurma / kurulum ortamında kuru buz üzerine katıştırın. Bezi kapatacak kadar orta ekleyin. Ortam katılaştığında, dokuları daha son....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

GJ, AJ ve TJ bileşenlerinin meme bezinde birlikte etkileşip etkileşip etkileşip değişime uğramayacağını belirlemek için, ilk önce co-IF testleri gerçekleştirildi. Bir GJ protein olan Cx26 ve bir AJ proteini olan β-Catenin, spesifik antikorlarla araştırıldı ve sırasıyla florofor konjuge fare-647 (yeşil, sahte renkler) ve keçi-568 (kırmızı) antikorları kullandıklarını ortaya koydu ( Şekil 1B ve C ) . Veriler, sarı renkli ( <.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bağırsak yoluyla hücre-hücre etkileşimleri, meme bezi gibi birçok organın düzgün işleyişi ve gelişimi için gereklidir. Araştırmalar junctional proteinlerin birbirlerinin işlev ve istikrarını düzenleyebildiğini ve sinyal iletimini hücre zarı ^10'da birbirine bağlayarak aktive edebildiğini göstermiştir. Mevcut el yazmasında sunulan protokoller, normal fare bezi gelişiminde junctional protein diferansiyel ifadesi, lokalizasyonu ve etkileşimi hakkında ilginç bulgular.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mice strain and stage	St. Constant, Quebec, Canada		C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada
PBS 10x (stock)			1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water; 2) Adjust the PH to 7.4; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)			1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water; 2) Adjust the pH to 7.5; 3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing media	VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada	95067-840	VMR frozen sections compound
Microtome	Mississauga, ON, Canada	956640	Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
Blades	C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada	BLM1001C	High profile gold coated blades
Pap pen	Cedarlane, Burlington, ON, Canada	8899	Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slides	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	12-550-15	Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
Formaldehyde	BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada	FOR201.1	Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution			3% BSA in TBS
Wash solution			TBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20	Oakville, ON, Canada	P 9416	Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting media	Cedarlane, Burlington, ON	17984-25(EM)	Fluoromount-G
First & secondary antibodies	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling
First & secondary antibodies	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling)
First & secondary antibodies	Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada	See Comments	β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies	Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	Connexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s)
Nuclei stain	Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada	D1306	DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscope	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector
Software of IF images analysis	Nikon Canada, Mississauga, On, Canada		NIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.0			1) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O. 2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL). 3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitor	Fisher Scientific, Burlington, ON	78441	Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosage	Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA	23225	Pierce BCA protein assay kit
Tissue grinder	Fisher Scientific, Burlington, ON	FTH-115	Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and stand	Millipore, Etobicoke, ON, Canada		PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IP			PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada	See Comments	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitation	Cell Signaling, Beverly, MA, USA	See Comments	E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer	BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada	1610747	4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine	Fisher Scientific, Burlington, ON	PB381-5	0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl
Tris	Fisher Scientific, Burlington, ON	BP152-1	1 M (pH=8)
SDS-PAGE acrylamide gels	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1610180 -5	TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
Membranes	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704272	PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer method	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1704155	Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry Milk	Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada		Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots			5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blots			TBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)	Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada	See Comments	Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1705061	Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada	1708280	ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blots	BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada		ImageLab 5.2 software