JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

צמתים בין-תאיים הם דרישות עבור פונקציות ספציפיות של בלוטת החלב והתפתחותן. כתב היד מספק פרוטוקול מפורט לחקר האינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI) לבין שיתוף לוקליזציה באמצעות בלוטות החלב Murine. טכניקות אלה מאפשרות לחקור את הדינמיקה של הקשר הפיזי בין צמתים בין-תאיים בשלבי התפתחות שונים.

Abstract

אינטראקציות תא סלולרי תפקיד מרכזי בשמירה על שלמות הרקמה ואת המכשול בין תאים שונים של בלוטת החלב. אינטראקציות אלה מסופקות על ידי חלבונים גנטיים המרכיבים נקסוס בין תאים סמוכים. מיצוקלציה של חלבון פונקציונאלי וירידה באסוציאציות פיזיות עם השותפים המחייבים שלהם עלולה לגרום לאובדן תפקוד, וכתוצאה מכך לתפקוד איברים. לכן, זיהוי לוקליזציה של חלבונים וחלבוני חלבונים (PPI) ברקמות הרגילות והמחלות, חיוניים למציאת עדויות ומנגנונים חדשים המביאים להתפתחות מחלות או שינויים במעמד ההתפתחותי. כתב היד מציג שיטה דו-שלבית להערכת PPIs בבלוטות החלב של Murine. בפרוטוקול סעיף 1, שיטה לבצע co- אימונופלורסנציה (שיתוף IF) באמצעות נוגדנים שהועלו נגד חלבונים של עניין, ואחריו נוגדנים משניים שכותרתו עם fluorochromes, מתואר. למרות שיתוף שיתוף IFבגלל ההוכחה של קרבת החלבונים, היא מאפשרת ללמוד את האינטראקציות הגופניות שלהם. לכן, פרוטוקול מפורט עבור שיתוף immunoprecipitation (שיתוף IP) מסופק בסעיף פרוטוקול 2. שיטה זו משמשת כדי לקבוע את האינטראקציות הגופניות בין חלבונים, מבלי לאשר אם אינטראקציות אלה הן ישירות או עקיפות. בשנים האחרונות, Co-IF ו- co-IP טכניקות הוכיחו כי רכיבים מסוימים של צמתים בין תאגידים שיתוף וליצור אינטראקציה יחד, יצירת תלויי שלב nexuses הגדילה המשתנים במהלך התפתחות בלוטת החלב.

Introduction

התפתחות בלוטת החלב ופיתוח מתרחשת בעיקר לאחר הלידה. איבר זה מתחדד ללא הרף לאורך כל חיי הפוריות של יונק 1 . האפיתל בבלוטת החלב הבוגרת מורכבת משכבה פנימית של תאי אפיתל לומינליים ושכבה חיצונית של תאים ביזליים, המורכבים בעיקר מתאי מיופתיטליים, מוקפים בקרום מרתף 2 . לבדיקה טובה על מבנה בלוטת החלב ופיתוח, הקורא יכול להתייחס Sternlicht 1 . תאים תא אינטראקציות דרך הפער (GJ), הדוק (TJ), והצמדות (AJ) צמתים הדרושים להתפתחות תקינה ותפקוד של בלוטה 1 , 3 , 4 , 5 , 6 . המרכיבים העיקריים של צמתים אלה בלוטת החלב Murine הם Cx26, Cx30, Cx32, ו Cx43 (GJ); קלודין -1, -3, -4, -7 וZO-1 (TJ); ו E-cadherin, P-cadherin, ו β-catenin (AJ) 7 , 8 . רמות הביטוי של אלה חלבונים ג 'וניקט שונים להשתנות באופן תלוי שלב במהלך התפתחות בלוטת החלב, מה שמציע אינטראקציה תא תא אינטראקציה הדרישות 9 . GJ, TJ ו- AJ קשורים באופן מבניים ופונקציונליים ומקיפים חלבונים מבניים או רגולטוריים אחרים לאתרים הסמוכים של תאים סמוכים, ובכך יוצרים קשר גנטי. ההרכב של הקשר הג'ונקטי יכול להשפיע על גישור עם cytoskeleton הבסיסית, כמו גם חדירות ויציבות nexus, ולכן יכול להשפיע על הפונקציה של בלוטת 8 , 9 , 10 , 11 . המרכיבים של צמתים בין תאים המתגוררים nexuses פונקציונלי או אינטראקציה אחד עם השני ב difבשלבים התפתחותיים של התפתחות בלוטת החלב נותחו לאחרונה באמצעות שיתוף immunofluorescence (שיתוף IF) ושיתוף אימונופרסיפיטיון (שיתוף IP) 9 . בעוד טכניקות אחרות מאפשרות להעריך את הקשר הפונקציונלי בין חלבונים, שיטות אלו אינן מוצגות בכתב היד הזה.

כאשר חלבונים פועלים רק לבדם לתפקוד, לימוד אינטראקציות בין חלבונים לחלבון (PPI), כגון טרנספורמציות אותות ומפליות ביוכימיות, הוא חיוני לחוקרים רבים ויכול לספק מידע משמעותי על תפקוד החלבונים. Co-IF וניתוח מיקרוסקופי לעזור להעריך כמה חלבונים החולקים את אותו חלל תת-תאי. עם זאת, מספר מטרות מוגבל על ידי נוגדנים, אשר חייב להיות הרים בעלי חיים שונים, ועל ידי גישה מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים אורך גלאי ספקטרלי עבור ריבוב. Co-IP מאשרת או מגלה זיקה גבוהה פיזית אינטראקציות betwEen שני חלבונים או יותר המתגוררים בתוך קומפלקס חלבון. למרות הפיתוח של טכניקות חדשניות, כגון העברת אנרגיה תהודה הקרינה (סריג) 12 ו assay קשירת הקרבה (PLA) 13 , אשר יכול לזהות בו זמנית את לוקליזציה ואינטראקציות של חלבונים, שיתוף IP נשאר טכניקה נאותה ובמחיר סביר ללמוד אינטראקציות בין חלבונים אנדוגניים.

שיטת צעד אחר צעד המתוארת בכתב יד זה יקל על המחקר של לוקליזציה חלבון PPIs להצביע על מלכודות להימנע בעת חקר PPIs אנדוגני בבלוטות החלב. המתודולוגיה מתחילה בהצגת הליכי השימור השונים לרקמות הנדרשות לכל טכניקה. חלק 1 מציג כיצד ללמוד חלבון שיתוף לוקליזציה בשלושה שלבים: 1) חתך של בלוטות החלב, ii) פעמיים או משולשת תיוג של חלבונים שונים באמצעות טכניקה שיתוף IF, ו- iii) הדמיה שללוקליזציה של חלבונים. חלק 2 מראה כיצד להאיץ חלבון אנדוגני ולזהות חלבונים אינטראקציה שלה בשלושה שלבים: i) הכנה lysate, ii) immunoprecipitation חלבון עקיף, ו- iii) זיהוי שותף מחייב על ידי SDS-PAGE כתם המערבי. כל צעד של פרוטוקול זה הוא מותאם עבור מכרסמים בלוטות הבלוטות החלב ומייצר באיכות גבוהה, ספציפי, תוצאות לשחזור. פרוטוקול זה יכול לשמש גם כנקודת מוצא ללימודי PPI ברקמות אחרות או שורות תאים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוטוקולים של בעלי החיים ששימשו במחקר זה אושרו על ידי הוועדה לטיפול בבעלי חיים של האוניברסיטה (INRS-Institut Armand-Frappier, Laval, Canada).

1. זיהוי חלבון שיתוף לוקליזציה

  1. מ רקמות לשקופיות מיקרוסקופיות
    הערה: יש לטפל רקמות וסעיפים על קרח יבש.
    1. בלו את בלוטות החלב מבעל חיים (עבור תיאור מלא של הליך זה, עיין Plante et al. ) 14 .
    2. הטמע את הרקמה הוסרה במדיום מקפיא / הרכבה על קרח יבש. הוסף בינוני מספיק כדי לכסות את הבלוטה. כאשר המדיום הוא solidified, להעביר את הרקמות למקפיא ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר 9 .
    3. באמצעות cryomicrotome מוגדר על 35 ° C, לחתוך את הרקמות לתוך 7-10 חלקים מיקרומטר עבה ומניחים אותם על שקופיות מיקרוסקופ.
      הערה: במידת האפשר, הנח שני קטעים בכל שקף. החלק השמאלי ישמש כשליטה אקטיבית כדי לאמת את הספציפיות של הנוגדנים ואת autofluorescence של הרקמה, בעוד הצד הימני יהיה שכותרתו עם הנוגדנים.
    4. שמור את הסעיפים ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.
  2. Co-IF מכתים
    1. לאחזר את השקופיות מיקרוסקופיים המתאים מן המקפיא מיד לתקן את הסעיפים על ידי שקוע אותם פורמלדהיד 4% למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
    2. לאחר מכן לטבול את השקופיות ב מלוחים זרחן מלוחים (PBS) ב RT. השאירו את השקופיות PBS ב RT עד לשלב הבא.
    3. מעגל כל קטע של השקופית באמצעות מחסום הידרופובי זמין מסחרית או עט מעבדה דוחה מים (ראה טבלה של חומרים ). היזהר לא לגעת ברקמה. מיד להוסיף טיפות של PBS לרקמה ומניחים את השקופית בתא histology לח למשך שארית ההליך.
      הערה: קטעי הרקמה חייבים להישאר לחים. חֲלוּפָהLy, להשתמש בקופסה עם מכסה ומניחים מגבות נייר רטובות בתחתית.
    4. בלוק כל סעיף רקמות עם μL 100-200 של 3% אלבומין בסרום שור (BSA) - טריס שנאגרו מלוחים (TBS) -0.1% polysorbate 20 (ראה טבלה של חומרים ) במשך 30 דקות ב RT. בעוד הדגימות חוסמות, להכין את הפתרונות נוגדנים ראשוניים ומשניים על ידי דילול הנוגדנים ב polysorbate TBS-0.1% 20.
      הערה: הריכוז הנדרש עבור הנוגדנים מסופק על ידי היצרן; ראה טבלה של חומרים ותמונות 1 ו -2 עבור דוגמאות, כמו גם Dianati et al. 9 . אמנם אין צורך לעבוד בחושך בעת שימוש רוב נוגדנים fluorophore מצומדות, למנוע חשיפת פתרונות נוגדן או רקמות מוכתמות לאור חזק, בהיר.
    5. הסר את הפתרון חסימה על ידי שאיפה דגירה הקטעים μL 100-200 של נוגדן ראשוני מדולל למשך 60 דקות ב RT. אלטרנטיבY, דגירה עם הנוגדן העיקרי לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
    6. הסר את הפתרון נוגדנים ראשוניים על ידי שאיפה לשטוף את הסעיפים עם 250-500 μL של TBS-0.1% polysorbate 20 במשך 5 דקות. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה לחזור על לשטוף פעמיים.
    7. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה דגירה הקטעים עם μL 100-200 של הנוגדן המתאים fluorophore מצומדות משני עבור 60 דקות ב RT.
    8. הסר את הפתרון נוגדנים משני על ידי שאיפה לשטוף את הסעיפים עם 250-500 μL של TBS-0.1% polysorbate 20 במשך 5 דקות. הסר את הפתרון לשטוף וחזור פעמיים.
    9. חזור על שלב 2.5-2.8 באמצעות השילוב המתאים של נוגדנים ראשוניים ומשניים עבור חלבון (ים) הבאים של עניין.
    10. הסר את הפתרון לשטוף על ידי שאיפה ולבצע את מכתים גרעיני ידי דוגרים את החלק עם μL 100-200 של 1 מ"ג / מ"ל ​​4, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) ב TBS-0.1% polysorbate 20 דקות 5 בRT
    11. הסר את הפתרון DAPI על ידי שאיפה הר שקופיות באמצעות מסיס במים, שאינו זורם בינוני גובר (ראה טבלה של חומרים ) ו coverslips. המשך שקופית אחת בכל פעם.
      הערה: דגירה את הכתם בגרעין במשך יותר מ 5 דקות לא ישנה את עוצמת מכתים. לחלופין, להסיר את הפתרון DAPI על כל שקופיות דגירה הרקמות PBS בעת הרכבה שקופיות.
    12. מניחים את השקופיות שטוח במקרר 4 מעלות צלזיוס לפחות 8 שעות. המשך אל הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטי (ראה איורים 1 ו -2 ).
  3. הדמיה מיקרוסקופית
    1. דמיינו את הנוגדנים משני fluorophore מצומדות משני באמצעות מיקרוסקופ confocal מצויד לייזרים שונים הדרושים כדי לעורר את fluorophores באורכי גל ספציפיים שלהם.
      הערה: כדי להיות מסוגלים לדמיין צינורות ואלוולי, המטרה 40X עם צמצם המספרי של 0.95 הוא הציע. בחינהE של הגדרות ספציפיות מסופק באיור 1 .
    2. בדוק את לוקליזציה של כל חלבון בנפרד על ידי סריקת התמונה גל אחד באותו זמן.
      הערה: בשלב זה, חשוב לנתח בצורה ביקורתית את לוקליזציה של חלבונים ג 'וניקטיביים. כדי להיות מסוגל ליצור nexuses junctional, חלבונים אלה חייב להיות מקומי על קרום הפלזמה.
    3. קביעת שיתוף לוקליזציה של חלבונים על ידי מיזוג התמונות סרקו עם לייזרים באורכי גל שונים.
      הערה: ניתן לראות את הלוקליזציה המשותפת לחלבון על ידי שינוי הצבע הנובע מפליטת שני פלואורופורים או יותר באותו מיקום וניתן למדוד אותם באמצעות התוכנה המתאימה ( תרשימים 1 ו -2 , ראה גם סימוכין 9).

2. לימוד PPIs

הערה: בלוטות החלב הבטן יש להשתמש כדי ללמוד PPIs, כמו בלוטות החזה נמצאים בקשר הדוק עם החזהשרירים. בלו את בלוטות החלב (עבור תיאור מלא של הליך זה, עיין Plante et al .) 14 ולשמור אותם ב -80 מעלות צלזיוס לשימוש מאוחר יותר.

  1. הכנת Lysate
    1. מניחים נייר במשקל 2 צינורות microcentrifuge מ"ל על קרח יבש מראש מגניב אותם לפני שתמשיך עם השלבים הבאים.
    2. קח את הרקמה בלוטת החלב מ -80 מעלות צלזיוס ולשמור אותם על קרח יבש.
    3. לשקול את הרקמות על ניירות שקילה מראש צונן ולאחר מכן להעביר את הרקמה ל 2 צינורות microcentrifuge מ"ל (לטפל על קרח יבש). השתמש בין 50 ל 100 מ"ג של רקמה לדגימה. שמור את הרקמה על קרח יבש עד שלב 2.1.5.
    4. הכן את הכמות הנדרשת של חיץ משולש תמוגה חיץ בתוספת NaF, NaVO 3 , ו פרוטאז / phosphatase inhibitor, כפי שצוין בטבלה של חומרים , תוך שימוש בנוסחאות הבאות. עכברים: חיץ נדרש (μL) = משקל רקמת העכבר (מ"ג) x 3; Rat: נדרשחיץ (μL) = משקל רקמת חולדה (מ"ג) x 5.
    5. מוסיפים את הכמות הנדרשת של חיץ תמוגה קר כקרח (מחושב בשלב 2.1.4) לצינור 2 מ"ל המכיל את הרקמה.
      הערה: בצעדים 2.1.5-2.1.6, המשך עם צינור אחד בכל פעם.
    6. Homogenize הרקמה של 30-40 s באמצעות homogenization מתמשך על מטחנת רקמות; תמיד לשמור את הצינור על הקרח. התאם את homogenizer רקמות במהירות בינונית בעדינות להזיז את המטחנה למעלה ולמטה בתוך הצינור.
    7. חזור על שלבים 1.6 ו -1.7 עם צינורות אחרים.
    8. דגירה lysates על הקרח 10-30 דקות.
    9. צנטריפוגה צינורות ב XG 170 במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.
    10. בינתיים, לזהות 6-10 צינורות microcentrifuge (0.6 מ"ל) עבור כל מדגם ולשמור אותם על הקרח.
    11. לאחר צנטריפוגה נעשה, לבדוק את צינורות. ודא כי הם מכילים שכבת העליון של שומן, ברור, צהוב lysates lysates (בהתאם לשלב של פיתוח) ו גלולה.
    12. צור חור בשכבת השומניםבאמצעות טיפ פיפטה 200 μL לגשת לשלב נוזלי. לשנות את קצה ולאסוף את lysate מבלי להפריע גלולה או aspirating את השכבה. Aliquot lysate ב מראש שכותרתו צינורות על הקרח (שלב 2.1.11) ולאחסן אותם -80 ° C.
    13. השתמש aliquot לכמת את ריכוז החלבון באמצעות ערכת זמין מסחרית מתאימה (ראה טבלה של חומרים ).
  2. אימונופרסיפיקציה עקיפה
    1. על הקרח, להפשיר שני aliquots של סך lysates בלוטת החלב שהוכן בעבר.
      הערה: אחד aliquot ישמש את ה- IP של חלבון היעד, ואילו השני ישמש שליטה שלילית.
    2. איסוף 500-1,000 מיקרוגרם של lysate ו לדלל אותו PBS להגיע נפח סופי של 200 μL בצינור 1.5 מ"ל כל.
      הערה: כמות lysate לשמש תלוי בשפע של חלבון של עניין ואת היעילות של הנוגדן (ראה איור 3 עבורN למשל, כמו גם את לוח החומרים ). כדי לייעל עבור כל יעד, כמויות שונות של lysate ( כלומר, 500, 750, ו 1000 מיקרוגרם) ו נוגדן ( כלומר, 5, 10, ו 20 מיקרוגרם) יש להשתמש. המשך בשלבים הבאים (2.2.3-2.3.7.4).
    3. מוסיפים את הנוגדן נגד האנטיגן של עניין הצינור הראשון של lysate ולשמור אותו על הקרח.
      הערה: הסכום הנדרש מוצע בדרך כלל על פי גיליון ההוראות שסופק על ידי כל חברה (ראה טבלת החומרים ).
    4. בצינור השני, להכין שליטה שלילית על ידי הוספת ריכוז זהה של איגוטפ IgG שליטה כמו הנוגדן בשימוש בשלב 2.2.3.
    5. דגירה צינורות לילה ב 4 מעלות צלזיוס על צינורית רולר מיקסר במהירות נמוכה.
    6. למחרת, להוסיף 50 μL של חרוזים מגנטיים צינורות חדשים 1.5 מ"ל עבור טרום כביסה.
      1. בחר חלבון או חלבון G חרוזים מגנטיים המבוססים על זיקה יחסית הנוגדן.
        2. חשוב להימנע משימוש בחרוזים מצטברים; בעדינות לערבב את השעיה חרוז עד שהוא אחיד מושעה מחדש לפני הוספת אותו צינורות.
    7. מניחים את צינורות המכילים את החרוזים על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט. הסר את המאגר אחסון מן החרוזים באמצעות פיפטה 200 μL.
    8. שטפו את החרוזים על ידי הוספת 500 μL של polysorbate PBS-0.1% 20 ו מערבולת צינורות במרץ עבור 10 s.
    9. שים את הצינורות בחזרה על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט.
    10. הסר את החיץ לשטוף עודף ידי pipetting עם פיפטה 200 μL.
    11. הוסף את התגובה מורכבת (lysate נוגדן) משלב 2.2.5 חרוזים ו דגירה של 90 דקות ב RT על מערבל הרים.
    12. מניחים את הצינורות על המעמד המגנטי ולאפשר חרוזים להגר אל המגנט. באמצעות פיפטה 200 μL, לשאוב ולזרוק lysate ומניחים את הצינורות על הקרח.
    13. שטפו את החרוזS על ידי הוספת 500 μL של PBS, הצבת צינורות על המעמד המגנטי, והסרת הנוזל באמצעות פיפטה 200 μL. חזור על צעד זה לשטוף. במהלך השלבים לשטוף, להימנע vortexing ולשמור על דגימות על הקרח.
    14. לשטוף את החרוזים פעם אחת עם PBS-0.1% polysorbate 20 ללא vortexing וזורקים למאגר לשטוף האחרון באמצעות טיפ 200 פיפטה μL.
    15. כדי elute, להוסיף 20 μL של 0.2 M חומצה גליצין (pH = 2.5) כדי צינורות ולנער אותם במשך 7 דקות על מיקסר רולר.
    16. צנטריפוגה במהירות גבוהה למשך כמה שניות (ספין מהיר) ולאסוף את supernatant בצינור קרח קר חדש.
    17. חזור על שלבים 2.2.14 ו 2.2.15 עבור כל צינור.
      הערה: נפח הסופי יהיה 40 μL.
    18. הוסף 10 μL של חיץ Laemmli 4x למדגם eluted 40 μL משלב 2.2.16.
      הערה: הצבע יהפוך צהוב בשל חומציות pH.
    19. מיד להוסיף 1 M Tris (pH = 8), טיפה אחת בכל פעם, כדי מדגם eluted משלב 2.2.18 עד צבע שלההופך כחול. המשך אל הצינורות הבאים.
    20. מרתיחים את הדגימות משלב 2.2.18 ב 70-90 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להמשיך מיד ג'ל אלקטרופורזה. לחלופין, להעביר את דגימות למקפיא ב -80 מעלות צלזיוס עד הטעינה.
  3. יישום downstream: ג'ל אלקטרופורזה ואחריו כתם המערבי
    1. הכנת הפרדה וערימה SDS-PAGE ג'ל acrylamide (1.5 מ"מ עובי) בעקבות הליכים סטנדרטיים 15 .
      הערה: הבחירה של ג'ל (8-15% acrylamide, שיפוע: לראות את טבלת החומרים ) צריך להיקבע על בסיס גודל מולקולרי של החלבון להיות זירז של שותפים מחייב פוטנציאל להיות מנותח. חלבונים אלה חייבים להיפתר אחד מהשני כדי לאפשר immunodetection תקין.
    2. להפשיר את immunoprecipitation (IP) דגימות מרחוק (שלב 2.2.20) על הקרח.
    3. הכן lysates חלבון מן דגימות אותו (המשמש את ההליך IP לעיל). השתמש ב- 50מיקרוגרם של סך lysate ולהוסיף חיץ מדגם 4X Laemmli. מרתיחים את הדגימות ב 70-90 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ומניחים על הקרח עד הטעינה.
      הערה: דגימות אלה יטענו ליד מדגם IP eluted כדי להדגים את נוכחותם של חלבונים זירז סך lysate.
    4. טען את lysates מוכן משלב 2.3.3 ואת דגימות זירז משלב 2.2.20 זה לצד זה בג'ל acrylamide ולהפעיל אותם במאגר פועל (10x חיץ פועל: 30.3 גרם של Tris, 144.1 גרם של גליצין, ו 10 G של SDS ב 1 L של מים מזוקקים) ב 100 V עבור 95 דקות בקירוב, או עד קצה החלבונים נודדים מגיע לתחתית של ג'ל.
    5. מעבירים את הג'לים ל nitrocellulose או קרום PVDF באמצעות פרוטוקול סטנדרטי 9 , 15 .
    6. לחסום את הממברנה במשך 1 שעות על נדנדה על מהירות נמוכה ב 5% חלב יבש-TTBS (20 מ"מ טריס, 500 מ"מ NaCl, ו 0.05% polysorbate 20).
    7. זהה אם המשקעים היו סוכברכות.
      1. בדוק את הממברנה באמצעות הנוגדן הראשון נגד חלבון זירז, בדילול של 5% חלב יבש- TTBS בריכוז המומלץ על ידי היצרן, לילה ב 4 ° C על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה איטית.
        הערה: ראה טבלת חומרים להמלצות.
      2. למחרת, לשטוף את הממברנה 3 פעמים במשך 5 דקות כל אחד עם TTBS על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה גבוהה.
      3. דגירה של קרום נוגדנים משני המתאים מצומדות עם חזרת peroxidase (HRP), מדולל TTBS, במשך שעה 1 ב RT על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה איטית.
        הערה: לחלופין, נוגדנים משניים מצומדות עם fluorochrome ניתן להשתמש אם המנגנון המתאים כדי לזהות את האות זמין.
      4. בצע 3 עד 6 שוטף, כל 5 דקות, עם TTBS על פלטפורמת נדנדה עם תסיסה גבוהה. לנתח את האות של הנוגדן משני על ידי דוגרים את הממברנה עם מסחרית אVailable luminol פתרון (ראה טבלה של חומרים ) ופעל לפי הוראות היצרן. זיהוי האות באמצעות מערכת הדמיה chemiluminescence (ראה טבלה של חומרים ).
        הערה: לקבלת פרוטוקול מפורט על ניתוח כתם המערבי, ראה התייחסות 16.
    8. כדי לזהות חלבונים אינטראקטיביים, בצע את השלבים 2.3.7.1-2.3.7.4 באמצעות הנוגדנים המתאימים על אותו כתם.
      הערה: אם חלבונים הם אינטראקציה, השותפים מחייב יהיה שיתוף immunoprecipitated עם חלבון היעד ולכן יהיה לזיהוי על ידי סופג המערבי. שלב 2.3.8 ניתן לחזור עם נוגדנים יותר כדי לקבוע אם חלבונים אחרים מתגוררים באותו חלבונים מורכבים, כל עוד משקולות מולקולריות של חלבונים שונים מספיק כדי להיות מופרדים היטב על ג 'ל וקרום.
    9. כדי לאשר כי שותפים מחייב זיהו אינם חפצים, IP הדדי צריך להתבצע.
      הערה: פעולה זו מבוצעת על ידי חזרהצעדים 2.2.1-2.2.20 עם lysate אותו אבל מזרז אחד השותפים המחייבים המזוהים בשלב 3.8. לאחר מכן, צעדים 3.1-3.8 חוזרים על עצמם באמצעות הנוגדן העיקרי נגד החלבון הראשון של עניין.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

כדי לקבוע אם GJ, AJ, ו TJ רכיבים יכולים לתקשר יחד בלוטת החלב, co-IF מבחני בוצעו לראשונה. Cx26, חלבון GJ, ו- β-Catenin, חלבון AJ, נבדקו באמצעות נוגדנים ספציפיים וגילו באמצעות נוגדנים של עכבר פלואורופורי-מצומדות (647, ירוק, pseudocolor) ועז-568 (אדום), בהתאמה ( איור 1B ו-

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

תאים תאים אינטראקציות באמצעות צמתים נדרשים לתפקוד תקין ופיתוח של איברים רבים, כגון בלוטת החלב. מחקרים הראו כי חלבונים פונקציונליים יכולים לווסת את הפונקציה ואת היציבות של אחד אחר ולהפעיל transduction האות על ידי קשירה זה לזה בקרום התא 10 . הפרוטוקולים שהוצגו ב?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה להכריז.

Acknowledgements

IP ממומן על ידי מדעי הטבע והנדסה מועצת המחקר של מענק קנדה (NSERC # 418233-2012); פונדס דה Recherche du Québec-Santé (FRQS), פרס קריירה לסרטן השד של קוובק, ומענק למנהיגים מייסד הקרן הקנדית לחדשנות. א.ד. קיבל מלגה מארגון ארנדנד-פריייר.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Mice strain and stageSt. Constant, Quebec, CanadaC57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada 
PBS 10x (stock)1) Dissolve 80 g NaCl (F.W.: 58.44), 2 g KCl (F.W. 74.55), 26.8 g Na2HPO4·7H2O (F.W. 268.07) and 2.4 g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800 mL distilled water;
2) Adjust the PH to 7.4;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
TBS 10x (stock)1) Dissolve 60.5 g TRIS, 87.6 g NaCl in 800 mL distilled water;
2) Adjust the pH to 7.5;
3) Add water to reach to the 1 L final volume.
Part 1: Immunofluorescence
Freezing mediaVWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada95067-840VMR frozen sections compound 
MicrotomeMississauga, ON, Canada956640Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115 V 60 Hz
BladesC.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, CanadaBLM1001CHigh profile gold coated blades
Pap penCedarlane, Burlington, ON, Canada8899Super PAP Pen, Thermo fisher scientific
Microscopic slidesFisher Scientific, Burlington, ON, Canada12-550-15Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides
FormaldehydeBioShop Canada Inc, Burlington, ON, CanadaFOR201.1Forlmadehyde
Bovine Serum Albumin (BSA)Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA
Blocking solution3% BSA in TBS
Wash solutionTBS-Tween 20 0.1%
Polysorbate 20Oakville, ON, CanadaP 9416Tween 20, Sigma-Aldrich
Mounting mediaCedarlane, Burlington, ON17984-25(EM)Fluoromount-G
First & secondary antibodiesCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling 
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsClaudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) 
First & secondary antibodies Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada See Commentsβ-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific)
First & secondary antibodies Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsConnexin26  (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) 
Nuclei stainFisher Scientific, Burlington, ON, CanadaD1306DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1,000 in PBS
Fluorescent microscopeNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector 
Software of IF images analysisNikon Canada, Mississauga, On, CanadaNIS-elements software (version 4)
Part 2: Immunoprecipitation
Triple-detergent Lysis buffer (100 mL) pH=8.01) Mix 50 mM TRIS (F.W.: 121.14), 150 mM NaCl (F.W.: 58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80 mL distilled H2O.
2) Adjust the pH to 8.0 with HCl 6 N (~0.5 mL).
3) Adjust the volume to 100 mL. Keep it in fridge.
At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer:
Sodium Fluoride (stock) solution 1.25 M (F.W.: 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1 M (F.W.: 183.9)
Protease/phosphatase inhibitorFisher Scientific, Burlington, ON78441Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100x)
Protein dosageThermo Scientific, Rockford, Illinois, USA23225Pierce BCA protein assay kit 
Tissue grinderFisher Scientific, Burlington, ONFTH-115Power 125, Model FTH-115
Magnetic beads and standMillipore, Etobicoke, ON, CanadaPureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02)
Wash solution for IPPBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsIgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationSigma-Aldrich, Oakville, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µL/200 µL
Primary antibodies for immunoprecipitationCell Signaling, Beverly, MA, USASee CommentsE-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µL/200 µL
Laemmli buffer BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada16107474x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation)
Acidic glycine Fisher Scientific, Burlington, ONPB381-50.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl 
Tris Fisher Scientific, Burlington, ONBP152-11 M (pH=8) 
SDS-PAGE acrylamide gels BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1610180 -5TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%)
Running buffer 10x BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272Tris 30.3 g/glycine 144.1 g /SDS 10 g in 1 L distilled water
MembranesBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704272PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit
Transfer methodBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1704155Trans-Blot Turbo Transfer System
Dry MilkSmucker Food of Canada Co, Markham, ON, CanadaFat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation
Blocking solution for blots5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1%
Washing solutions for blotsTBS-Tween 20 0.1%
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsConnexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2,500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsE-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1,000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Primary and secondary antibodies for blots (10 mL)Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, CanadaSee CommentsClaudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1,000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5,000 (Abcam, Toronto, ON, Canada)
Luminol solution for signal detection on blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1705061Clarity Western ECL Blotting Substrate
Imaging blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, Canada1708280ChemiDoc MP imaging system
Analayzing blotsBIO-RAD, Mississauga, ON, CanadaImageLab 5.2 software 

References

  1. Sternlicht, M. D. Key stages in mammary gland development: the cues that regulate ductal branching morphogenesis. Breast Cancer Res. 8 (1), 201(2006).
  2. Oakes, S. R., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  3. Stein, T., Hilton, H. N., Ormandy, C. J. The alveolar switch: coordinating the proliferative cues and cell fate decisions that drive the formation of lobuloalveoli from ductal epithelium. Breast Cancer Res. 8 (2), 207(2006).
  4. El-Sabban, M. E., Abi-Mosleh, L. F., Talhouk, R. S. Developmental regulation of gap junctions and their role in mammary epithelial cell differentiation. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 8 (4), 463-473 (2003).
  5. Hennighausen, L., Robinson, G. W. Information networks in the mammary gland. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (9), 715-725 (2005).
  6. Gudjonsson, T., Adriance, M. C., Sternlicht, M. D., Petersen, O. W., Bissell, M. J. Myoepithelial cells: their origin and function in breast morphogenesis and neoplasia. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 10 (3), 261-272 (2005).
  7. Nguyen, D. A., Neville, M. C. Tight junction regulation in the mammary gland. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 3 (3), 233-246 (1998).
  8. Stewart, M. K., Simek, J., Laird, D. W. Insights into the role of connexins in mammary gland morphogenesis and function. Reproduction. 149 (6), R279-R290 (2015).
  9. Dianati, E., Poiraud, J., Weber-Ouellette, A., Connexins Plante, I., E-cadherin, Claudin-7 and beta-catenin transiently form junctional nexuses during the post-natal mammary gland development. Dev Biol. 416 (1), 52-68 (2016).
  10. Derangeon, M., Spray, D. C., Bourmeyster, N., Sarrouilhe, D., Herve, J. C. Reciprocal influence of connexins and apical junction proteins on their expressions and functions. Biochim Biophys Acta. 1788 (4), 768-778 (2009).
  11. Hernandez-Blazquez, F. J., Joazeiro, P. P., Omori, Y., Yamasaki, H. Control of intracellular movement of connexins by E-cadherin in murine skin papilloma cells. Exp Cell Res. 270 (2), 235-247 (2001).
  12. Kiyokawa, E., Hara, S., Nakamura, T., Matsuda, M. Fluorescence (Forster) resonance energy transfer imaging of oncogene activity in living cells. Cancer Sci. 97 (1), 8-15 (2006).
  13. Gustafsdottir, S. M., et al. Proximity ligation assays for sensitive and specific protein analyses. Anal Biochem. 345 (1), 2-9 (2005).
  14. Plante, I., Stewart, M. K., Laird, D. W. Evaluation of mammary gland development and function in mouse models. J Vis Exp. (53), (2011).
  15. Green, M. R., Sambrook, J., Sambrook, J. Molecular cloning: a laboratory manual. , 4th ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2012).
  16. Taylor, S. C., Berkelman, T., Yadav, G., Hammond, M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 55 (3), 217-226 (2013).
  17. Oxford, E. M., et al. Molecular composition of the intercalated disc in a spontaneous canine animal model of arrhythmogenic right ventricular dysplasia/cardiomyopathy. Heart Rhythm. 4 (9), 1196-1205 (2007).
  18. Wang, X., Li, S. Protein mislocalization: mechanisms, functions and clinical applications in cancer. Biochim Biophys Acta. 1846 (1), 13-25 (2014).
  19. Bertocchi, C., et al. Nanoscale architecture of cadherin-based cell adhesions. Nat Cell Biol. 19 (1), 28-37 (2017).
  20. Bajar, B. T., Wang, E. S., Zhang, S., Lin, M. Z., Chu, J. A Guide to Fluorescent Protein FRET Pairs. Sensors (Basel). 16 (9), (2016).
  21. Fredriksson, K., et al. Proteomic analysis of proteins surrounding occludin and claudin-4 reveals their proximity to signaling and trafficking networks. PLoS One. 10 (3), e0117074(2015).
  22. Weibrecht, I., et al. Proximity ligation assays: a recent addition to the proteomics toolbox. Expert Rev Proteomics. 7 (3), 401-409 (2010).
  23. Malovannaya, A., et al. Streamlined analysis schema for high-throughput identification of endogenous protein complexes. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (6), 2431-2436 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved