Visualización del patrón de proyección axonal de las neuronas motrices embrionarias<em&gt; Drosophila</em

Resumen

Este trabajo detalla un método de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de los embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. La preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la búsqueda de axones motores y el reconocimiento de dianas durante el desarrollo neural.

Resumen

El establecimiento de circuitos neuromusculares funcionales se basa en conexiones precisas entre los axones motores en desarrollo y los músculos diana. Las neuronas motoras extienden los conos de crecimiento para navegar a lo largo de caminos específicos, respondiendo a un gran número de guías de orientación del axón que emanan del entorno extracelular circundante. El reconocimiento del blanco del cono de crecimiento también juega un papel crítico en la especificidad neuromuscular. Este trabajo presenta un protocolo de inmunohistoquímica estándar para visualizar las proyecciones de neuronas motoras de embriones de Drosophila melanogaster de etapa tardía-16. Este protocolo incluye algunos pasos clave, incluyendo un procedimiento de genotipado, para clasificar los embriones mutantes deseados; Un procedimiento de inmunotinción, para marcar los embriones con el anticuerpo fasciclin II (FasII); Y un procedimiento de disección, para generar preparaciones en filetes a partir de embriones fijos. Las proyecciones axonales motoras y los patrones musculares en la periferia se visualizan mucho mejor en preparaciones planas de embriones fileteados que en whOle-mount embriones. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos teñidos con anticuerpos FasII proporciona una potente herramienta para caracterizar los genes necesarios para la detección del axón motor y el reconocimiento de diana, y también puede aplicarse tanto a las pantallas genéticas de pérdida de función como de ganancia de función .

Introducción

Las conexiones precisas y selectivas entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo embrionario son esenciales para la locomoción normal en larvas de Drosophila . El patrón embrionario de 30 fibras musculares en cada uno de los hemisegments abdominales A2-A7 se establece por la etapa 16 ¹ . Las 36 neuronas motoras que se generan en el cordón nervioso ventral extienden sus axones hacia la periferia para inervar los músculos diana específicos ² . La detección del axón motor y el reconocimiento del objetivo se pueden visualizar mediante inmunohistoquímica con un anticuerpo (anticuerpo monoclonal de ratón 1D4) ^{3 , 4} . Múltiples imágenes de los patrones de proyección del axón motor en embriones de tipo salvaje están disponibles en la web ⁵ . El anticuerpo 1D4 etiqueta todos los axones motores y tres fascículos axónicos longitudinales en cada lado de la línea media del sistema nervioso central embrionario (SNC) ^{4 , 6} ( Figura 1C y Figura 2A ). Por lo tanto, la inmunohistoquímica con el anticuerpo FasII proporciona una poderosa herramienta para identificar los genes necesarios para la conectividad neuromuscular para demostrar los mecanismos moleculares subyacentes axón motor orientación y reconocimiento de objetivos.

En cada uno de los hemisegmentos abdominales A2-A7, los axones motores se proyectan y se fasciculan selectivamente en dos ramas nerviosas principales, el nervio segmentario (SN) y el nervio intersectorial (ISN) ^{2 , 4} , y una rama nerviosa menor, el nervio transversal ) ⁷ . El SN defascicula selectivamente para dar lugar a dos ramas nerviosas llamadas SNa y SNc, mientras que el ISN se divide en tres ramas nerviosas llamadas ISN, ISNb e ISNd ^{2 , 4} . Entre ellos, ISN, ISNb, SNA y el axón motorLos patrones de proyección se visualizan con mayor precisión cuando los embriones de etapa 16 tardía se tiñen con anticuerpo FasII y se filetean ( Figura 1C y Figura 2A ). Las neuronas motoras ISN extienden sus axones para inervar los músculos dorsales 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 y 20 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). Las neuronas motoras ISNb inervan los músculos ventrolaterales 6, 7, 12, 13, 14, 28 y 30 ^{2 , 4} ( Figura 2A y 2B). La rama nerviosa SNa proyecta inervar los músculos laterales 5, 8, 21, 22, 23 y 24 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). El TN, que consiste en dos axones motores, proyecta ipsilateralmente a lo largo del borde segmentario para inervar el músculo 25 y hace sinapsis con la neurona dendrítica bipolar lateral (LBD) en elPeriferia ⁷ ( figura 2A ). Estas innervaciones musculares objetivo requieren no sólo la defasciculación selectiva de los axones motores en puntos específicos de elección, sino también el reconocimiento del músculo objetivo. Además, algunas putativo mesodermal guidepost células que actúan como objetivos intermedios se encontraron tanto en el ISN y SNa vías, pero no a lo largo de la vía ISNb [ ^4] . Esto podría sugerir que ISNb motor axon pathfinding puede ser regulado de una manera distinta en comparación con la ISN y SNa axón motor guía, y también indica que periféricos axón motor guía proporciona un atractivo modelo experimental para estudiar el diferencial o conservado funciones de una sola guía de referencia Molécula ⁸ .

Este trabajo presenta un método estándar para visualizar los patrones de proyección axonal de las neuronas motoras embrionarias en Drosophila . Los protocolos descritos incluyen cómo diseccionar embriones fijos teñidos con 1D4 aNtibody y procesados ​​en 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para preparaciones en filetes. Una ventaja crítica de las preparaciones planas de embriones fijos es la mejor visualización de las proyecciones axonales y patrones musculares en la periferia. Además, este trabajo también muestra cómo el genotipo de embriones fijos para ordenar los embriones mutantes deseados utilizando el método de tinción LacZ.

Protocolo

1. Preparación

1. Preparar 500 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con solución de t-octilfenoxipolietoxietanol (PBT) mediante la adición de 0,5 g de albúmina de suero bovino (BSA) y 0,5 ml de t-octilfenoxipolietoxietanol (véase la Tabla de Materiales) a 500 ml de PBS 1X Y agitando durante al menos 30 min. Almacenar a 4 ° C. Utilice cuando sea relativamente fresco y guarde la solución en una botella limpia.
2. Hacer 10 ml de paraformaldehído al 4% mediante la adición de 2,5 ml de una solución de paraformaldehído de reserva al 16% y 1 ml de PBS 10x a 6,5 ​​ml de agua desionizada. Almacenar a 4 ° C y utilizar en una semana.
   PRECAUCIÓN: Evite el contacto de la piel con la solución de paraformaldehído porque es altamente tóxico.
3. Hacer el sustrato X-Gal (X-Gal al 10% p / v en dimetilsulfóxido (DMSO)) disolviendo 0,1 g de sustrato X-Gal por 1 ml de DMSO. Almacenar a -20 ° C en alícuotas de 100 μl.
4. Hacer la solución de tinción X-Gal usando tampón fosfato 10 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, MgCl2 1 mM, 3 mMK4 [FeII (CN) ₆ ], 3 mM K3 [FeIII (CN) ₆ ] y 0,3% de t-octilfenoxipolietoxietanol. Conservar a 4 ° C en la oscuridad.
5. Hacer una solución de peróxido de hidrógeno al 3% diluyendo al 30% de agua oxigenada 1:10 con agua desionizada.
6. Hacer una solución de 3,3'-diaminobencidina (DAB) disolviendo completamente 1 comprimido (10 mg) de DAB en 35 ml de solución PBT fresca. Filtrar a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm y almacenar a -20 ° C en alícuotas de 910 μl.
   PRECAUCIÓN: Deseche todos los residuos DAB en lejía para destruir el DAB.
7. Hacer placas de huevo con jugo de manzana. Añadir 35 g de agar y 1 L de agua desionizada a un matraz de 2 l. Añadir 33 g de sacarosa, 2 g de tegosept y 375 ml de jugo de manzana a un matraz de 1 l. Derretirlos en autoclave durante 30 min. Deje que las dos soluciones se enfríen a unos 60 ° C. Combinar y mezclar bien estas soluciones con agitación. Vierta ~ 11 ml de solución combinada por plato de cultivo de 60 mm.
8. Haga la pasta de la levadura mezclando el panadero síSt en agua desionizada (proporción 1: 0.8) y almacenar a 4 ° C.

2. Colección de embriones (día 1)

1. Recoger las moscas jóvenes y las moscas macho (menores de 5 días), y durante 1-2 días, mantenerlas en una jaula de plástico con una placa de huevo (60 mm x 15 mm) que contiene una pequeña cantidad de pasta de levadura en el centro.
2. Para la recolección óptima de los embriones de la fase tardía-16, establecer una jaula de botellas con moscas (> 50) alrededor de las 5 PM y dejar que los huevos a 25 ° C durante 3 h.
3. Transferir las moscas a una botella de comida fresca.
4. Cerrar la placa de huevo con la tapa e incubarla al revés a 25 ° C en una incubadora humidificada (~ 70% de humedad) durante la noche.

3. Preparación de embriones para inmunotinción (día 2)

1. Añadir 1,8 mL de solución de PBT a la placa de huevo alrededor de 10:20 AM y utilizar un hisopo de algodón para aflojar los embriones de la placa mientras que la inclinación.
   Nota: Al macerar suavemente la pasta de levadura usando un cottEn un hisopo, disolverlo en caso de que se encuentre un gran número de embriones. Comience a recoger los embriones ~ 40 minutos antes de la fijación (alrededor de las 11:00 AM).
2. Transferir los embriones de la placa de huevo a un microtubo de 1,5 ml utilizando una punta de pipeta de 1 ml.
3. Permita que los embriones se establezcan y aspiren la solución de PBT lo más posible. Enjuague los embriones dos veces con 1 mL de solución de PBT. Aspirar la solución PBT lo más posible.
4. Llenar el tubo con 1 ml de lejía al 50% (diluido en agua desionizada) y decolorar los embriones incubándolos en un nutator durante 3 min a temperatura ambiente (RT).
   Nota: Este paso no mata a los embriones dechorionated.
5. Deje que los embriones dechorionated para establecerse, aspirar el blanqueador al 50% tanto como sea posible, y enjuague los embriones 3 veces con 1 mL de solución de PBT.
6. Añadir 0,5 ml de heptano y posteriormente añadir 0,5 ml de solución de paraformaldehído al 4% al tubo a la TA a las 11:00 horas aproximadamente.
7. Incubar elEmbriones en un nutator durante 15 min a RT.
8. Eliminar la solución de paraformaldehído al 4% (la capa inferior).
9. Añadir 0,5 ml de metanol al 100% y devitellinar los embriones agitando vigorosamente el tubo durante 30 s.
10. Retire el heptano ( es decir, la capa superior).
11. Añadir 0,5 ml de metanol al 100% y agitar vigorosamente el tubo durante 10 s.
12. Permita que los embriones se establezcan golpeando ligeramente el tubo y aspirando el metanol lo más posible. Enjuague los embriones con 1 ml de metanol al 100%, agitando durante menos de 10 s.
    Nota: La exposición prolongada al metanol destruye la actividad β-Gal.
13. Retire el metanol y enjuague los embriones devitellinizados 3 veces con 1 mL de solución de PBT.

4. Genotipificación de los embriones mediante tinción LacZ (día 2)

1. Añadir 1 ml de solución de PBT al tubo e incubar el tubo en un bloque de calor a 37 ° C o un baño de agua durante 15 min.
2. Durante la incubación, coloque la solución de tinción X-Gal (1 ml por tuBe) a 65 ° C en un baño de agua hasta que se enturbia. Incubar en un baño de agua a 37 ° C.
3. Aspirar la solución PBT y añadir 1 ml de solución de tinción X-Gal y 20 μL de sustrato X-Gal al tubo.
4. Incubar el tubo a 37 ° C con nutación hasta que un precipitado azul es evidente.
   Nota: El tiempo de incubación de los equilibradores azules ^2º y 3º en general oscila entre 2 y 4 h.
5. Quitar la solución de tinción X-Gal y enjuagar los embriones 3 veces con 1 mL de RT solución PBT.
6. Usando una sonda de aguja o fórceps, clasifique a mano los embriones del genotipo deseado ( es decir, embriones blancos no teñidos) con un microscopio de disección (objetivos 1.6X-2.5X).
   Nota: Dado que algunos equilibradores azules, como CyO, actina-LacZ y TM3, actina-LacZ , llevan una construcción transgénica que expresa β-Gal (LacZ) bacteriana bajo el control del promotor de actina , los embriones manchados de azul en forma omnipresente contienenUna o dos copias de los cromosomas azul equilibrador. Por lo tanto, los embriones blancos no teñidos son homocigóticos para el alelo letal deseado.

5. Inmunocoloración de embriones con anticuerpos anti-Fasciclin II (día 2-3)

1. Recoger y transferir los embriones del genotipo deseado ( es decir, embriones blancos no teñidos) a un microtubo de 0,5 ml usando una punta de pipeta de 1 ml.
   Nota: En este paso, los embriones pueden ser escalonados de acuerdo con criterios morfológicos, incluyendo los patrones de segmentación de la cutícula y las estructuras de la cabeza y la cola ⁹ . Durante la involución de la cabeza, entre 10 y 16 h después de la puesta de los huevos, el embrión sufre una pronunciada reducción del segmento más anterior ⁹ .
2. Lavar los embriones una vez con 0,4 ml de solución de PBT y añadir 0,3 ml de solución de bloqueo (5% de suero de cabra normal y 5% de DMSO en solución PBT).
3. Bloquear los embriones con nutation a RT durante 15 min.
4. Añadir 75 μL de anticuerpo anti-Fasciclin II e incubar el tubo con nutación a RT durante la noche.
5. Lavar los embriones 4 veces con 0,4 ml de solución de PBT durante al menos 20 minutos por lavado.
6. Añadir 0,3 ml de solución de bloqueo (suero de cabra normal al 5% en solución de PBT) que contiene anticuerpo anti-ratón-HRP de cabra (2 μg / ml) e incubar el tubo con nutación a RT durante la noche.
7. Lave los embriones 6 veces con 0,4 mL de solución de PBT durante al menos 20 minutos por lavado.
8. Añadir 0,3 ml de solución de DAB al tubo.
   PRECAUCIÓN: Use guantes y coloque todos los desechos / tubos / puntas DAB en el blanqueador.
9. Añadir 2 μl de peróxido de hidrógeno al 3% e incubar el tubo en la oscuridad con nutación a RT hasta producir la cantidad deseada de precipitado.
   Nota: El tiempo de incubación para la inmunohistoquímica 1D4 en general oscila entre 0,5-1 h.
10. Lavar los embriones 4 veces con 0,4 ml de solución de PBT.
    PRECAUCIÓN: Retire la solución DAB y los dos primeros lavados con una pipeta y diScard ellos en lejía.
11. Añadir 0,2 ml de solución de glicerol / PBS al 70% al tubo y almacenar a RT o 4ºC.
    Nota: Mantenga el tubo alejado de la luz. Se pueden obtener preparaciones más claras colocando los embriones en una solución de glicerol / PBS al 90% ¹⁰ . Sin embargo, es más difícil diseccionar los embriones eliminados en solución de glicerol / PBS al 90% que los eliminados en la solución de glicerol / PBS al 70% ¹⁰ .

6. Etapa, Disección, Montaje e Imaging de los Embriones (Día 4)

1. Para la estadificación, transfiera los embriones equilibrados con glicerol al 70% / PBS sobre un portaobjetos de vidrio.
2. Recolecte embriones de fase tardía-16 que tienen los nervios del segmento abdominal 7 (A7), A8 y A9 ISN que convergen para tocarse unos a otros y / o tener un intestino medio que se subdivide en tres bandas.
   Nota: Los embriones teñidos con anticuerpos 1D4 se pueden clasificar según los patrones de proyección de los axones motores ISN e ISNb. Después de salir del CNS, A7, A8 y A9 ISN neRves de última etapa-16 embriones convergen para tocarse mutuamente y posteriormente divergen para extenderse lejos a los músculos dorsales (flecha en la Figura 1A ). En los embriones de la etapa media-16, sin embargo, los nervios A7 ISN se extienden en paralelo con los nervios A8 / A9 (soporte cuadrado en la Figura 1B ). Además, los ejes de proyección de los nervios A6 ISNb (perpendiculares a los músculos ventrolaterales) en ambos hemisegmentos están aproximadamente alineados con el extremo posterior de los fascículos del axón longitudinal del SNC (flechas y una línea en la Figura 1C ). Estos criterios morfológicos varían algo entre los diferentes genotipos. Alternativamente, los embriones se pueden realizar en función de la morfología intestinal ^{9 , 11} . Antes de la etapa 17, el intestino medio tiene una forma de corazón, mientras que el intestino medio se subdivide en tres bandas por la etapa 17 ¹² .
3. Disecar los embriones.
   1. Usando un 1 mL, retire cada embrión de la gota de glicerol y coloque el embrión boca arriba. Corte la parte anterior a 1/4 de la longitud del cuerpo y la región más posterior que esté libre de axones motores.
   2. Usando una sonda de aguja, mueva el embrión de corte final de la gota de glicerol, ruede para orientarlo hacia arriba y colóquelo horizontalmente en el campo.
      Nota: Cuando el embrión se retira de la gota de glicerol, un poco de glicerol asociado con el embrión lo hace pegajoso.
   3. Corte el embrión a lo largo de la línea media dorsal utilizando una sola aguja de tungsteno muy fino ¹³ . Haga un pequeño corte en el extremo posterior del embrión y luego continúe cortando la línea media dorsal hacia la parte anterior; Corte en la dirección opuesta es también muy bien.
   4. Usando una sonda de aguja, mueva el embrión cortado a la línea media en la gota de glicerol, colóquelo de lado dorsal hacia arriba y separe el intestino de la pared del cuerpo desplegando cada pared del cuerpo en una dirección ventrolateral (diagonal) (2.5X objetivo).
      Nota: Asegúrese de que la línea media dorsal está completamente cortada, lo que resulta en la separación completa entre las paredes del cuerpo izquierdo y derecho.
   5. Con cuidado, mueva el embrión cortado de la línea media de la gota de glicerol y luego coloque dos solapas de la pared del cuerpo sobre el portaobjetos de vidrio usando una sonda de aguja fina (objetivo 2,5X).
   6. Usando una aguja de tungsteno muy fina, retire los órganos internos del embrión diseccionado empujándolos lateralmente (objetivo 5X).
      Nota: Una descripción más detallada de otro procedimiento de disección similar se puede encontrar en el sitio web ⁵ .
4. Para el montaje, añadir 2-3 μL de solución de glicerol / PBS al 70% a embriones limpios, disecados y, utilizando una sonda de aguja fina, transferirlos a una nueva diapositiva de vidrio sobre la cual se han extendido 8 μl de solución de glicerol / PBS al 70% El centro (objetivo 2.5X).
5. Póngase una cubreobjetos (18 mm x 18 mm). Selle los bordes del cubreobjetos con esmalte de uñas regular (ya seaClaro o coloreado está bien).
6. Capture imágenes a alta resolución (objetivos de inmersión en aceite 20X, 40X y 63X) bajo un microscopio de luz de contraste de interferencia diferencial (DIC), de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
   Nota: Se puede producir una mejor visualización y caracterización fenotípica, especialmente para los axones motores ISNb, utilizando un objetivo de inmersión en aceite 63X.

Resultados

Las conexiones precisas entre los axones motores y los músculos diana durante el desarrollo neural dependen de la repulsión selectiva del axón-axón y el reconocimiento del objetivo en puntos específicos de elección ⁴ . En Drosophila , la repulsión selectiva entre los axones motores está regulada en parte por la acción combinada de semahorinas de clase 1 y 2 (Semas), incluyendo Sema-1a, Sema-2a y Sema-2b ^{8 ,}

Discusión

Los detalles de los defectos de orientación del axón motor se anotan más rápido y con mayor precisión por la preparación en filetes de los embriones teñidos con DAB que por la microscopía confocal de escaneo con láser de los marcados fluorescentemente. Por lo tanto, la preparación en filetes de embriones fijos y teñidos con 1D4 es la más adecuada para la caracterización funcional de moléculas de guía. Cuatro clases principales de señales de guía, incluyendo netrinas, hendiduras, semaforinas (Semas), y e...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)