ויזואליזציה של דפוס היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים ב<em&gt; תסיסנית</em

Summary

עבודה זו מפרטת שיטת אימונוהיסטוכימיה סטנדרטית כדי לדמיין תחזיות נוירונים מוטוריים של שלב מאוחר 16 תסיסנית עוברי melanogaster . הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתמים נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון המנוע ואת ההכרה היעד במהלך התפתחות עצבית.

Abstract

הקמת מעגלים neuromuscular תפקודית מסתמך על קשרים מדויקים בין פיתוח אקסונים המנוע השרירים היעד. נוירונים מוטוריים מרחיבים את קונוסים הצמיחה לנווט לאורך נתיבים ספציפיים על ידי תגובה למספר רב של רמזים הדרכה האקסון הנובעים מהסביבה החוץ תאיים שמסביב. זיהוי קונוס יעד הכרה גם משחק תפקיד קריטי neuromuscular הספציפיות. עבודה זו מציגה פרוטוקול אימונוהיסטוכימיה סטנדרטי לדמיין תחזיות נוירון המנוע של מאוחר בשלב 16 תסיסנית עוברי melanogaster . פרוטוקול זה כולל כמה שלבים עיקריים, כולל הליך genotyping, כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי; הליך immunostaining, כדי לתייג עוברי עם פאסיקלין II (FasII) נוגדן; ו הליך לנתיחה, כדי לייצר ההכנות filleted מעוברים קבועים. תחזיות האקסון מוטוריים דפוסי שרירים בפריפריה הם דמיינו הרבה יותר טוב בהכנות שטוחות של עוברים filleted מאשר whOLE-mount עוברי. לכן, הכנת הפילה של עוברי קבוע מוכתם נוגדן FasII מספק כלי רב עוצמה כדי לאפיין את הגנים הנדרשים עבור pathoninding האקסון pathfinding וזיהוי היעד, וזה יכול להיות מיושם גם אובדן של פונקציה ואת הרווח של תפקוד גנטי מסכי .

Introduction

חיבורים מדויקים וסלקטיביים בין אקסונים המנוע ושרירי היעד במהלך התפתחות עובריים חיוניים לתנועה רגילה בזחלים תסיסנית . דפוס עוברי של 30 סיבי שריר בכל אחת hemisements הבטן A2-A7 הוקמה על ידי שלב 16 ¹ . 36 נוירונים המוטוריים הנוצרים חוט העצבים הגחון להרחיב את האקסונים שלהם לתוך הפריפריה כדי innervate מטרה ספציפית השרירים ² . מנוע pathoninding האקסון וזיהוי היעד יכול להיות דמיינו על ידי אימונוהיסטוכימיה עם נוגדן (נוגדנים עכבר חד שבטיים 1D4) ^{3 , 4} . תמונות מרובות של דפוסי המנוע האקסון היטל בעוברים wildtype זמינים באינטרנט ⁵ . תווית 1D4 תוויות כל אקסונים המנוע שלושה קווים האקסון האורך על כל צד של קו האמצע של מערכת העצבים המרכזית העצבית (CNS) ^{4 , 6} ( איור 1C ו איור 2 א ). לכן, אימונוהיסטוכימיה עם נוגדנים FasII מספק כלי רב עוצמה לזיהוי גנים הדרושים עבור קישוריות neuromuscular להפגין את המנגנונים המולקולריים בבסיס הדרכה האקסון המנוע ואת ההכרה היעד.

בכל אחד מההתעמלות הבטן A2-A7, פרוייקט האקסונים המוטוריים, ונסלק באופן סלקטיבי לשני ענפים עצביים עיקריים, העצב הסגמנטלי (SN) והעצב הבין-גופי (ISN) ^{, 2 , 4} וענף עצבים קטן, העצב הרוחבי (TN ) ⁷ . ה- SN מבטל באופן סלקטיבי ליצור שני ענפים עצביים הנקראים SNa ו- SNC, בעוד שה- ISN מתחלק לשלושה ענפים עצביים הנקראים ISN, ISNb ו- ISNd ^{2 , 4} . ביניהם, ISN, ISNb, ו SNA המנוע האקסוןדפוסי הקרנה הם דמיינו במדויק כאשר בשלב מאוחר 16 עוברי מוכתמים נוגדן FasII והם filleted ( איור 1C ו איור 2 א ). נוירונים המנוע ISN להרחיב את האקסונים שלהם innervate שרירי הגב 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19, ו 20 ^{2 , 4} ( איור 2 א ). הנוירונים המנוע ISNb innervate השרירים ventrolateral 6, 7, 12, 13, 14, 28, ו 30 ^{2 , 4} ( איור 2 א ו -2 ב). הענף SNa עצב פרויקטים innervate השרירים לרוחב 5, 8, 21, 22, 23, ו 24 ^{2 , 4} ( איור 2 א ). TN, אשר מורכב משני אקסונים המנוע, פרויקטים ipsilaterally לאורך הגבול המגזרי כדי innervate שריר 25 ועושה סינפסות עם נוירון דנדריטי דו קוטבית לרוחב (LBD) בפריפריה ⁷ ( איור 2 א ). אלה entervations שרירים היעד דורשים לא רק defasciculation סלקטיבי של אקסונים המנוע בנקודות בחירה ספציפיות, אלא גם לכוון הכרה שריר. בנוסף, חלק מהמסלולים של ה- ISN ו- SNa, אך לא לאורך מסלול ISNb. זה עשוי להצביע על כך ISNb המנוע axon pathfinding יכול להיות מוסדר באופן שונה לעומת ISN ו SNA המנוע האקסון הדרכה, והוא גם מציין כי ההנחיה האקסון המנוע ההיקפי מספק מודל ניסיוני אטרקטיבי ללמוד את ההפרש או שימור תפקידים של רמז הדרכה אחת מולקולה ⁸ .

עבודה זו מציגה שיטה סטנדרטית כדי לדמיין את דפוסי היטל אקסונל של נוירונים מוטוריים עובריים תסיסנית . הפרוטוקולים המתוארים כוללים כיצד לנתח עוברי קבוע מוכתם 1D4 אNtibody ומעובד ב -3.3 'diaminobenzidine (DAB) להכנת ההכנות. יתרון קריטי אחד של ההכנות השטוח של עוברי קבוע הוא הדמיה טובה יותר של תחזיות axonal ודפוסי שרירים בפריפריה. יתר על כן, עבודה זו גם מראה כיצד גנוטיפ עוברי קבוע כדי למיין את העוברים מוטציה הרצוי באמצעות שיטת מכתים LacZ.

Protocol

1. הכנה

1. הכן 500 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עם תמיסת t-Octylphenoxipolyethoxyethoxyethoxol (PBT) על ידי הוספת 0.5 גרם של אלבומין בסרום בסרום (BSA) ו 0.5 מ"ל של t-Octylphenoxypolyethoxyethanol (ראה טבלה של חומרים) ל 500 מ"ל של 1X PBS ו ערבוב לפחות 30 דקות. חנות ב 4 ° C. השתמש כאשר טרי יחסית לאחסן את הפתרון בבקבוק נקי.
2. הפוך 10 מ"ל של paraformaldehyde 10% על ידי הוספת 2.5 מ"ל של פתרון המניה paraformaldehyde 16% ו 1 מ"ל של 10x PBS ל 6.5 מ"ל של מים deionized. חנות ב 4 ° C ולהשתמש בתוך שבוע.
   זהירות: הימנע מגע עור עם פתרון paraformaldehyde כי זה רעיל מאוד.
3. הפוך X-Gal המצע (10% w / v X-Gal ב sulfoxide דימתיל (DMSO)) על ידי המסת 0.1 גרם של המצע X-Gal לכל 1 מ"ל של DMSO. חנות ב -20 מעלות צלזיוס ב 100 aliquots μL.
4. הפוך X-Gal מכתים פתרון באמצעות 10 חיץ פוספט מ"מ (pH 7.2), 150 מ"מ NaCl, 1 מ"מ MgCl ₂ , 3 מ 'ח"כ ₄ [FeII (CN) ₆ ], 3 מ"מ K ₃ [FeIII (CN) ₆ ], ו- 0.3% t-Octylphenoxypolyethoxyethoxol. חנות ב 4 ° C בחושך.
5. הפוך 3% מי חמצן פתרון על ידי דילול 30% מימן מי חמצן 01:10 עם מים deionized.
6. הפוך את הפתרון של D3 3-diaminobenzidine (DAB) על ידי התמוססות מלאה של טבליה אחת (10 מ"ג) של DAB ב -35 מ"ל של תמיסת PBT טרייה. מסנן דרך מסנן 0.2-מיקרומטר מזרק ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס ב 910 aliquots μL.
   זהירות: השלך את כל פסולת ה- DAB באקונומיקה כדי להרוס את ה- DAB.
7. להכין צלחות ביצה עם מיץ תפוחים. הוסף 35 גרם של אגר ו 1 ליטר של מים deionized בקבוק 2 L. הוסף 33 גרם סוכרוז, 2 גרם של tegosept, ו 375 מ"ל של מיץ תפוחים בקבוק 1 - L. ממיסים אותם על ידי מעוקר במשך 30 דקות. אפשר לשני הפתרונות להתקרר לכ -60 מעלות צלזיוס. שלב ומערבבים את הפתרונות הללו היטב על ידי ערבוב. יוצקים ~ 11 מ"ל של פתרון משולב לכל צלחת 60 מ"מ תרבות.
8. הכנת שמרים על ידי ערבוב בייקר yeaSt לתוך מים deionized (יחס 1: 0.8) ולאחסן ב 4 ° C.

2. אוסף העובר (יום 1)

1. איסוף זבובים צעירים זכר ונקבה (מתחת 5 ימים), ולמשך 1-2 ימים, לשמור אותם בכלוב כוס פלסטיק עם צלחת ביצה (60 מ"מ x 15 מ"מ) המכיל כמות קטנה של להדביק שמרים במרכז.
2. עבור האוסף המיטבי של העוברים בשלב 16 מאוחר, להקים כלוב בקבוק עם זבובים (> 50) בסביבות 5 בערב ולתת להם להטיל ביצים על 25 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
3. מעבירים את הזבובים לבקבוק מזון טרי.
4. סגור את צלחת ביצה עם המכסה דגירה אותו במהופך על 25 מעלות צלזיוס חממה humidified (~ 70% לחות) בן לילה.

3. הכנת עוברים עבור Immunostaining (יום 2)

1. הוסף 1.8 מ"ל של פתרון PBT על צלחת ביצה בסביבות 10:20 בבוקר ולהשתמש צמר גפן כדי לשחרר את העוברים מהצלחת תוך הטיה זה.
   הערה: על ידי בעדינות מוחץ את הדבק שמרים באמצעות cottעל ספוגית, להמיס אותו למקרה מספר רב של עוברים נמצאים על זה. להתחיל לאסוף את העוברים ~ 40 דקות לפני קיבעון (בסביבות 11:00 בבוקר).
2. מעבירים את העוברים מהצלחת ביצה ל microtube 1.5 מ"ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
3. אפשר העוברים להתיישב ולשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר. שוטפים את העוברים פעמיים עם 1 מ"ל של פתרון PBT. לשאוב את הפתרון PBT ככל האפשר.
4. ממלאים את הצינור עם 1 מ"ל של אקונומיקה 50% ( כלומר, מדולל במים deionized) ו dechorionate העוברים על ידי דוגרים אותם על nutator במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: שלב זה אינו הורג את העוברים dechorionated.
5. אפשר עוברים dechorionated להתיישב, לשאוב את אקונומיקה 50% ככל האפשר, ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT.
6. הוסף 0.5 מ"ל של heptane ולאחר מכן להוסיף 0.5 מ"ל של פתרון paraformaldehyde 4% לצינור בשעה RT בסביבות 11:00 בבוקר.
7. דגירהעוברי על nutator במשך 15 דקות ב RT.
8. הסר את הפתרון paraformaldehyde 4% (השכבה התחתונה).
9. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול 100% ו devitellinize את העוברים על ידי רועד את הצינור במרץ עבור 30 s.
10. הסר את heptane ( כלומר, השכבה העליונה).
11. הוסף 0.5 מ"ל של מתנול 100% ולנער את הצינור במרץ עבור 10 s.
12. אפשר העוברים להתיישב על ידי הקשה על הצינור לשאוב את המתנול ככל האפשר. שוטפים את העוברים עם 1 מ"ל של מתנול 100%, רועד במשך פחות מ 10 s.
    הערה: חשיפה ממושכת למתנול הורסת פעילות β-Gal.
13. הסר את המתנול ולשטוף את העוברים devitellinized 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT.

4. Genotyping עוברים באמצעות מכתים LacZ (יום 2)

1. הוסף 1 מ"ל של פתרון PBT לצינור דגירה הצינור בבלוק חום 37 מעלות צלזיוס או אמבט מים במשך 15 דקות.
2. במהלך הדגירה, במקום X-Gal מכתים פתרון (1 מ"ל לכל tuלהיות) על 65 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שהוא מקבל מעונן. דגירה אותו אמבט מים 37 מעלות צלזיוס.
3. לשאוב את הפתרון PBT ולהוסיף 1 מ"ל של פתרון X-Gal מכתים ו 20 μL של המצע X-Gal לצינור.
4. דגירה הצינור על 37 מעלות צלזיוס עם האגוז עד משקע כחול ניכרת.
   הערה: זמן הדגירה של 2 ^nd ו 3 Balders כחול כחול באופן כללי נע בין 2-4 שעות.
5. הסר את הפתרון X-Gal מכתים ולשטוף את העוברים 3 פעמים עם 1 מ"ל של פתרון PBT RT.
6. באמצעות בדיקה מחט או מלקחיים, יד למיין את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) עם מיקרוסקופ אור לנתח (מטרות 1.6X-2.5X).
   הערה: מאז כמה Balancers כחול, כגון CyO, actin-LacZ ו TM3, actin-LacZ , לשאת מבנה מהונדס להביע חיידקים β-Gal (LacZ) תחת שליטתו של האמרגן אקטין , עוברים מוכתמים כחול בכל מקום להכילעותק אחד או שניים של כרומוזומים של איזון כחול. לכן, לא מוכתמים לבן עוברי הם הומוזיגיים עבור אלל הרצח הרצוי.

5. Immunostaining של עוברים עם אנטי פסיקלין II נוגדנים (יום 2-3)

1. איסוף ולהעביר את העוברים של הגנוטיפ הרצוי ( כלומר, עוברי לבן מוכתם) כדי microtube 0.5 מ"ל באמצעות טיפ פיפטה 1 מ"ל.
   הערה: בשלב זה, העוברים יכולים להיות מבוים בערך על פי קריטריונים מורפולוגיים, כולל דפוסי פילוח של לציפורן ואת המבנים של הראש והזנב ⁹ . במהלך פיתול הראש, בין 10 ל 16 שעות לאחר הביצים מוטלות, העובר עובר ירידה בולטת של קטע הקדמי ביותר ⁹ .
2. שטפו את העוברים פעם עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT ולהוסיף 0.3 מ"ל של תמיסת חסימה (5% בסרום עזים נורמלי 5% DMSO בפתרון PBT).
3. לחסום את העוברים עם אגוז ב RT במשך 15 דקות.
4. הוסף 75 μL של נוגדן אנטי Fasciclin II ו דגירה הצינור עם האגוז ב RT לילה.
5. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף.
6. הוסף 0.3 מ"ל של פתרון חסימה (5% בסרום עזים נורמלי ב PBT פתרון) המכיל עז נגד נוגדנים העכבר HRP (2 מיקרוגרם / מ"ל) ו דגירה של הצינור עם אגוז ב RT לילה.
7. שטפו את העוברים 6 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT לפחות 20 דקות לכל לשטוף.
8. הוסף 0.3 מ"ל של תמיסת DAB לצינור.
   זהירות: ללבוש כפפות ולמקם את כל DAB פסולת / צינורות / טיפים אקונומיקה.
9. הוסף 2 μL של מי חמצן 3% ו דגירה הצינור בחושך עם אגוז ב RT עד הכמות הרצויה של משקע מיוצר.
   הערה: זמן הדגירה של 1D4 אימונוהיסטוכימיה נע בין 0.5-1 h.
10. שטפו את העוברים 4 פעמים עם 0.4 מ"ל של פתרון PBT.
    זהירות: הסר את הפתרון DAB ואת שני שוטף הראשון עם פיפטה ו diלגרד אותם אקונומיקה.
11. הוסף 0.2 מ"ל של הרכבה 70% גליצרול / פתרון PBS לצינור חנות ב- RT או 4 ° C.
    הערה: הרחק את הצינור מהאור. תכשירים ברורים ניתן להשיג על ידי הנחת העוברים ב 90% גליצרול / פתרון PBS ¹⁰ . עם זאת, קשה יותר לנתח את העוברים מנקה ב תמיסת גליצרול 90% / PBS מאשר אלה מנקה ב גליצרול 70% / פתרון PBS ¹⁰ .

6. בימוי, ניתוח, הרכבה והדמיה של העוברים (יום 4)

1. עבור הזמני, להעביר את העוברים equilibrated עם גליצרול 70% / PBS על שקופית זכוכית.
2. איסוף בשלב מאוחר 16 עוברי כי יש קטע בטן 7 (A7), A8, ו A9 ISN עצבים מתכנסים לגעת אחד את השני או / ו יש midgut כי הוא מחולק לשלוש להקות.
   הערה: עוברי מוכתם 1D4 נוגדן יכול להיות מבוים על בסיס דפוסי היטל של ISN ו ISNb המנוע אקסונים. לאחר היציאה CNS, A7, A8, ו A9 ISN neRves של שלב מאוחר 16 עוברי להתכנס אחד את השני ולאחר מכן לסטות להרחבת הרחק החוצה את שרירי הגב (חץ בתרשים 1A ). באמצע שלב 16 עוברי, לעומת זאת, A7 עצבי ISN להרחיב במקביל עם A8 / A9 עצבים (סוגר מרובע באיור 1B ). בנוסף, הצירים ההקרנה של A6 עצבים ISNb (בניצב את השרירים ventrolateral) בשני hemisements מיושרים בערך עם הקצה האחורי של CNS אורך האקסון fascicles (החצים וקו בתרשים 1C ). קריטריונים מורפולוגיים אלה משתנים במקצת בין גנוטיפים שונים. לחלופין, עוברי יכול להיות מבוים מבוסס על המעי הגס ^{9 , 11} . לפני שלב 17, midgut יש צורה דמוית לב, ואילו midgut מחולק לשלוש להקות עד שלב 17 ¹² .
3. לנתח את העוברים.
   1. באמצעות 1 מ 'L מזרק, להעביר כל העובר מתוך טיפת גליצרול במקום העובר הגחון- face כלפי מעלה. חותכים את החלק הקדמי על 1/4 של אורך הגוף ואת האזור האחורי ביותר ללא של אקסונים המנוע.
   2. באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך סוף מתוך ירידה גליצרול, רול לכוון אותו הגבי בצד למעלה, ומניחים אותו אופקית בשדה.
      הערה: כאשר העובר מועבר מתוך ירידה גליצרול, קצת גליצרול הקשורים העובר עושה את זה דביק.
   3. חותכים את העובר לאורך קו האמצע הגבי באמצעות מחט טונגסטן אחת יפה מאוד ¹³ . לעשות חתך קטן בקצה האחורי של העובר ולאחר מכן להמשיך לחתוך את קו האמצע הגב לכיוון הקדמי; חיתוך בכיוון ההפוך הוא גם בסדר.
   4. באמצעות בדיקה מחט, להזיז את העובר לחתוך קו האמצע לתוך טיפת גליצרול, למקם אותו בצד הגבי למעלה, לנתק את המעיים מקיר הגוף על ידי נפרש כל קיר הגוף בכיוון ventrolateral (אלכסוני) (2.5X אובייקטיבי).
      הערה: ודא כי קו האמצע הגבי הוא לחתוך באופן מלא, וכתוצאה מכך ההפרדה המוחלטת בין הקירות השמאלי והימני הגוף.
   5. בזהירות להזיז את העובר לחתוך קו האמצע מתוך טיפת גליצרול ולאחר מכן שכב שני דשי של קיר הגוף על שקופית הזכוכית באמצעות בדיקה מחט בסדר (אובייקטיבי 2.5X).
   6. באמצעות מחט טונגסטן דק מאוד, להסיר את האיברים הפנימיים מהעובר גזור על ידי דחיפת אותם רוחבית (אובייקטיבי 5X).
      הערה: תיאור מפורט יותר של הליך דומה לנתיחה ניתן למצוא באתר ⁵ .
4. עבור הרכבה, להוסיף 2-3 μL של תמיסת גליצרול 70% / PBS לנקות, עוברי גזור ו, באמצעות בדיקה מחט בסדר, להעביר אותם שקופית זכוכית חדשה אל אילו μL 8 של פתרון גליצרול 70% / PBS כבר התפשט את המרכז (אובייקטיבי 2.5X).
5. לשים על coverslip (18 מ"מ x 18 מ"מ). חותם את הקצוות של coverslip עם לק קבוע מסמר (אוברור או צבע בסדר).
6. לכידת תמונות ברזולוציה גבוהה (20X, 40X, ו 63X מטרות טבילה שמן) תחת מיקרוסקופ אור דיפרנציאלי בניגוד (DIC) אור, על פי הוראות היצרן.
   הערה: הדמיה טובה יותר אפיון פנוטיפי, במיוחד עבור אקסונים המנוע ISNb, יכול להיות מיוצר באמצעות 63X שמן טבילה המטרה.

תוצאות

חיבורים מדויקים בין האקסונים המנועיים ושרירי היעד במהלך התפתחות העצבים תלויים בדחייה סלקטיבית של אקסון האקסון ובזיהוי מטרה בנקודות בחירה ספציפיות ⁴ . ב תסיסנית , דחייה סלקטיבית בין האקסונים המנוע הוא מוסדר בחלקו על ידי פעולה משול?...

Discussion

הפרטים של פגמים ההנחיה האקסון המנוע הם הבקיע מהר יותר עם דיוק טוב יותר על ידי הכנת filleted של עוברי DAB מוכתם מאשר על ידי לייזר סריקה מיקרוסקופיה confocal של אלה שכותרתו fluorescently. לכן, הכנת filleted של עוברי קבוע 1D4 מוכתם הוא המתאים ביותר עבור אפיון פונקציונלי של מולקולות הדרכה cue. א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)