Визуализация шаблона аксонной проекции эмбриональных моторных нейронов в<em&gt; Drosophila</em

Резюме

В этой работе подробно описан метод иммуногистохимии для визуализации проекций моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Филеарный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, представляет собой мощный инструмент для характеристики генов, необходимых для отслеживания моторного аксона и распознавания мишеней при развитии нервной системы.

Аннотация

Установление функциональных нервно-мышечных схем основано на точном соединении между развивающимися двигательными аксонами и мышцами мишени. Моторные нейроны расширяют конусы роста, чтобы перемещаться по определенным путям, реагируя на большое количество сигналов аксонов, которые исходят из окружающей внеклеточной среды. Признание цели конуса роста также играет критическую роль в нервно-мышечной специфичности. В этой работе представлен стандартный протокол иммуногистохимии для визуализации прогнозов моторных нейронов эмбрионов Drosophila melanogaster поздней стадии 16. Этот протокол включает в себя несколько ключевых шагов, включая процедуру генотипирования, для сортировки желаемых мутантных эмбрионов; Иммуноокрашивание, для маркировки эмбрионов с антителом fasciclin II (FasII); И процедуру вскрытия, для получения филе готовых препаратов из фиксированных эмбрионов. Прогнозы монокристалла и мышечные структуры на периферии гораздо лучше визуализируются в плоских препаратах филе эмбрионов, чем в whOle-mount эмбрионов. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных эмбрионов, окрашенных антителом FasII, является мощным инструментом для характеристики генов, необходимых для отслеживания траектории моторного аксона и распознавания мишеней, а также может быть применен как к генетическим экранам с потерей функции, так и к генетическим характеристикам ,

Введение

Точные и селективные связи между аксонами мотора и мышцами мишени во время эмбрионального развития необходимы для нормальной локомоции у личинок дрозофилы . Эпизодическое моделирование 30 мышечных волокон в каждом из абдоминальных полушарий A2-A7 устанавливается на этапе 16 ¹ . 36 двигательных нейронов, которые генерируются в брюшном нервном шнуре, расширяют свои аксоны на периферию, чтобы иннервировать определенные мышцы мишени ² . Обнаружение пути мокрого аксона и распознавание мишени можно визуализировать с помощью иммуногистохимии с помощью антитела (мышиного моноклонального антитела 1D4) ^{3 , 4} . В Интернете доступно несколько изображений моделей проекции аксонных моторов у эмбрионов дикого типа ⁵ . 1D4-антитело обозначает все моторные аксоны и три продольных аксонных пучка на каждой стороне средней линии эмбриональной центральной нервной системы (ЦНС) ^{4 , 6} ( рис. 1С и рис. 2А ). Поэтому иммуногистохимия с антителом FasII обеспечивает мощный инструмент для идентификации генов, необходимых для нейромышечной связи, для демонстрации молекулярных механизмов, лежащих в основе руководства аксоном двигателя и распознавания цели.

В каждом из абдоминальных гемосегментов A2-A7 двигательные аксоны проектируются и выборочно пущены в две главные нервные ветви, сегментный нерв (SN) и межсегментный нерв (ISN) ^{2 , 4} и небольшая нервная ветвь, поперечный нерв (TN ) ⁷ . SN выборочно обезвреживает образование двух нервных ветвей, называемых SNa и SNc, тогда как ISN разбивается на три нервные ветви, называемые ISN, ISNb и ISNd ^{2 , 4} . Среди них ISN, ISNb и SNa моторный аксонПроекции наиболее точно визуализируются, когда эмбрионы поздней стадии 16 окрашиваются антителом FasII и филе ( фиг. 1С и фиг. 2А ). Моторные нейроны ISN расширяют свои аксоны до иннервирования дорсальных мышц 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 и 20 ^{2 , 4} ( фиг. 2A ). Моторные нейроны ISNb иннервируют вентролатеральные мускулы 6, 7, 12, 13, 14, 28 и 30 ^{2 , 4} ( фиг. 2A и 2B). Отделение нервной системы SNa предназначено для иннервирования боковых мышц 5, 8, 21, 22, 23 и 24 ^{2 , 4} ( рисунок 2A ). TN, состоящая из двух моторных аксонов, реализует ipsilaterally вдоль сегментарной границы до иннервирующей мышцы 25 и делает синапсы с боковым биполярным дендритным нейроном (LBD) вПериферия ⁷ ( рисунок 2A ). Эти целевые мышечные иннервации требуют не только выборочной деасцикуляции моторных аксонов в определенных точках выбора, но и распознавания мишеней мышц. Кроме того, некоторые предполагаемые клетки мезодермального ориентира, которые выступают в качестве промежуточных целей, были обнаружены как в пути ISN, так и SNa, но не по пути ISNb ⁴ . Это может указывать на то, что отслеживание пути аксонов двигателя ISNb может быть отрегулировано в явном виде по сравнению с руководством по аксону с двигателем ISN и SNa, а также указывает на то, что руководство по аксону в периферийном двигателе обеспечивает привлекательную экспериментальную модель для изучения дифференциальных или консервативных ролей одного указательного указателя Молекула ⁸ .

Эта работа представляет собой стандартный метод визуализации аксонных проекционных рисунков эмбриональных моторных нейронов у Drosophila . Описанные протоколы включают в себя как рассекать фиксированные эмбрионы, окрашенные 1D4 aИ обрабатывали в 3,3'-диаминобензидине (DAB) для филе готовых препаратов. Одним из важных преимуществ плоских препаратов фиксированных эмбрионов является лучшая визуализация аксонных выступов и мышечных структур на периферии. Кроме того, эта работа также показывает, как генотипировать фиксированные эмбрионы для сортировки желаемых мутантных эмбрионов с использованием метода окрашивания LacZ.

протокол

1. Подготовка

1. Подготовьте 500 мл фосфатно-буферного солевого раствора (PBS) раствором t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (PBT), добавив 0,5 г бычьего сывороточного альбумина (BSA) и 0,5 мл t-октилфеноксиполиэтоксиэтанола (см. Таблицу материалов) к 500 мл 1X PBS И перемешивание в течение по меньшей мере 30 мин. Хранить при температуре 4 ° C. Используйте, когда относительно свежий, и храните раствор в чистой бутылке.
2. Сделайте 10 мл 4% параформальдегида, добавив 2,5 мл 16% раствора параформальдегида и 1 мл 10x PBS до 6,5 мл деионизированной воды. Хранить при температуре 4 ° C и использовать в течение одной недели.
   ПРЕДУПРЕЖДЕНИЕ. Избегайте контакта с раствором параформальдегида, потому что он очень токсичен.
3. Получают субстрат X-Gal (10% мас. / Об. X-Gal в диметилсульфоксиде (ДМСО)) путем растворения 0,1 г субстрата X-Gal на 1 мл ДМСО. Хранить при -20 ° С в аликвотах по 100 мкл.
4. Получают раствор окрашивания X-Gal с использованием 10 мМ фосфатного буфера (рН 7,2), 150 мМ NaCl, 1 мМ MgCl ₂ , 3 мMK ₄ [FeII (CN) ₆ ], 3 мМ K ₃ [FeIII (CN) ₆ ] и 0,3% трет-октилфеноксиполиэтоксиэтанола. Хранить при температуре 4 ° C в темноте.
5. Сделайте 3% раствор перекиси водорода путем разбавления 30% перекиси водорода 1:10 с деионизированной водой.
6. Сделайте раствор 3,3'-диаминобензидина (DAB), полностью растворяя 1 таблетку (10 мг) DAB в 35 мл свежего раствора PBT. Фильтруют через 0,2-мкм фильтр шприца и хранят при -20 ° С в аликвотах по 910 мкл.
   ВНИМАНИЕ: Утилизируйте все отходы DAB в отбеливателе, чтобы уничтожить DAB.
7. Сделайте яйцо с яблочным соком. Добавить 35 г агара и 1 л деионизированной воды в 2-литровую колбу. Добавить 33 г сахарозы, 2 г тегосепта и 375 мл яблочного сока в 1-литровую колбу. Растопить их автоклавированием в течение 30 мин. Дайте обоим растворам остыть примерно до 60 ° C. Смешайте и смешайте эти растворы, помешивая. Залить ~ 11 мл комбинированного раствора на 60 мм культуральную чашку.
8. Сделайте дрожжевую пасту смешением пекаря даВ деионизированную воду (соотношение 1: 0,8) и хранить при 4 ° С.

2. Коллекция эмбрионов (День 1)

1. Соберите молодых самцов и самцов (моложе 5 дней) и в течение 1-2 дней поддерживайте их в клетке из пластикового стакана с яичной пластинкой (60 мм x 15 мм), которая содержит небольшое количество дрожжевой пасты в центре.
2. Для оптимального сбора эмбрионов поздней стадии-16, создайте бутылочную клетку с мухами (> 50) примерно в 5 часов вечера и дайте им отложить яйца при 25 ° C в течение 3 часов.
3. Перенесите мух в бутылку с свежими продуктами.
4. Закройте пластинку с крышкой и инкубируйте ее вверх ногами при 25 ° C в увлажненном инкубаторе (~ 70% влажности) в течение ночи.

3. Подготовка эмбрионов для иммуноокрашивания (второй день)

1. Добавьте 1,8 мл раствора ПБТ к пластине с яйцом около 10:20 утра и используйте ватный тампон, чтобы ослабить эмбрионы с пластины при наклоне.
   Примечание: осторожно вымачивая дрожжевую пасту с помощью котаНа тампон, растворите его, если на нем обнаружено большое количество эмбрионов. Начните собирать эмбрионы за 40 минут до фиксации (около 11:00).
2. Перенесите эмбрионы из яичной пластины в 1,5-мл микротрубочку, используя наконечник пипетки 1 мл.
3. Позвольте эмбрионам оседать и аспирировать раствор PBT как можно больше. Промойте эмбрионы дважды 1 мл раствора PBT. Аспирируйте раствор PBT как можно больше.
4. Заполните пробирку 1 мл 50% -ного отбеливателя ( то есть, разбавленного в деионизированной воде) и дефорируют эмбрионы, инкубируя их на нутаторе в течение 3 мин при комнатной температуре (RT).
   Примечание. Этот шаг не убивает дехризованные эмбрионы.
5. Позвольте дефорированным эмбрионам оседать, как можно больше аспирируйте 50% отбеливатель и 3 раза промывайте эмбрионы 1 мл раствора PBT.
6. Добавить 0,5 мл гептана и затем добавить 0,5 мл 4% раствора параформальдегида в пробирку при комнатной температуре около 11:00.
7. ИнкубируйтеЭмбрионов на нутаторе в течение 15 мин при комнатной температуре.
8. Удалите 4% раствор параформальдегида (нижний слой).
9. Добавить 0,5 мл 100% метанола и деителлинизировать эмбрионы, энергично встряхивая пробирку в течение 30 с.
10. Удалите гептан ( то есть верхний слой).
11. Добавить 0,5 мл 100% метанола и интенсивно встряхивать пробирку в течение 10 с.
12. Позвольте эмбрионам успокоиться, постукивая по трубе и как можно больше аспирируйте метанол. Промыть эмбрионы 1 мл 100% метанола, встряхивая в течение менее 10 с.
    Примечание. Длительное воздействие метанола разрушает активность β-Gal.
13. Удалите метанол и промойте деителлинизированные эмбрионы 3 раза 1 мл раствора PBT.

4. Генотипирование эмбрионов с использованием окрашивания LacZ (день 2)

1. Добавить 1 мл раствора PBT в пробирку и инкубировать эту трубку в термостате 37 ° C или водяной бане в течение 15 минут.
2. Во время инкубации поместите X-Gal-окрашивающий раствор (1 мл на ту) При температуре 65 ° C на водяной бане до тех пор, пока не станет облачно. Инкубируйте его на водяной бане на 37 ° C.
3. Аспирируйте раствор PBT и добавьте 1 мл раствора окрашивания X-Gal и 20 мкл подложки X-Gal в трубку.
4. Инкубируйте пробирку при 37 ° С с нутацией до тех пор, пока не станет видно синее осаждение.
   Примечание. Время инкубации для 2 ^-го и 3 ^-го синих балансиров обычно составляет от 2 до 4 часов.
5. Удалите раствор окрашивания X-Gal и промойте эмбрионы 3 раза 1 мл раствора RT PBT.
6. Используя игольчатый зонд или щипцы, вручную сортируйте эмбрионы желаемого генотипа ( то есть, не окрашенные белые эмбрионы) с помощью светочувствительного микроскопа (цели 1,6X-2,5X).
   Примечание: Поскольку некоторые синие балансиры, такие как CyO, actin-LacZ и TM3, актин-LacZ , несут трансгенную конструкцию, экспрессирующую бактериальный β-Gal (LacZ) под контролем активатора актина , эмбрионы, окрашенные в синий цвет повсеместно, содержатОдна или две копии синих балансирующих хромосом. Поэтому не окрашенные белые эмбрионы являются гомозиготными по желаемому летальному аллелю.

5. Иммуноокрашивание эмбрионов антителами против Fasciclin II (2-3-й день)

1. Собирают и переносят эмбрионы желаемого генотипа ( то есть не окрашенных белых эмбрионов) в 0,5 мл микротрубочки с использованием наконечника пипетки 1 мл.
   Примечание: на этом этапе эмбрионы могут быть грубо поставлены в соответствии с морфологическими критериями, включая модели сегментации кутикулы и структуры головы и хвоста ⁹ . Во время инволюции головы, между 10 и 16 ч после укладки яиц, эмбрион подвергается значительному сокращению самого переднего сегмента ⁹ .
2. Вымойте эмбрионы один раз 0,4 мл раствора PBT и добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной сыворотки коз и 5% ДМСО в растворе PBT).
3. Заблокируйте эмбрионы нутацией при комнатной температуре в течение 15 мин.
4. Добавить 75 мкл анти-Fasciclin II антитела и инкубировать пробирку с нутацией при RT в течение ночи.
5. Промывайте эмбрионы 4 раза с помощью 0,4 мл раствора PBT в течение по меньшей мере 20 минут на промывку.
6. Добавьте 0,3 мл блокирующего раствора (5% нормальной козьего сыворотки в PBT-раствор), содержащего антитело против кошки против мыши-HRP (2 мкг / мл) и инкубируйте пробирку с нутацией при RT в течение ночи.
7. Вымойте эмбрионы 6 раз с 0,4 мл раствора PBT в течение по меньшей мере 20 минут на промывку.
8. Добавить 0,3 мл раствора DAB в пробирку.
   ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Наденьте перчатки и поместите все отходы / трубки / наконечники DAB в отбеливатель.
9. Добавьте 2 мкл 3% перекиси водорода и инкубируйте пробирку в темноте с нутацией при комнатной температуре до получения желаемого количества осадка.
   Примечание. Время инкубации для иммуногистохимии 1D4 в целом составляет 0,5-1 ч.
10. Вымойте эмбрионы 4 раза с помощью 0,4 мл раствора PBT.
    ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: Удалите раствор DAB и первые две промывки пипеткой и диОшпаривают их в отбеливатель.
11. Добавить 0,2 мл 70% -ного раствора глицерина / PBS в пробирку и хранить при комнатной температуре или 4 ° C.
    Примечание. Держите трубку подальше от света. Более чистые препараты могут быть получены путем помещения эмбрионов в 90% раствор глицерина / PBS ¹⁰ . Однако сложнее рассекать эмбрионы, очищенные в 90% растворе глицерина / PBS, чем те, которые очищены в 70% растворе глицерина / PBS ¹⁰ .

6. Проведение, рассечение, установка и визуализация эмбрионов (день 4)

1. Для постановки операции переносите эмбрионы, уравновешенные 70% глицерина / PBS, на стеклянный предмет.
2. Собирайте эмбрионы поздней стадии 16, у которых абдоминальный сегмент 7 (A7), A8 и A9 нервы ISN сходятся, чтобы касаться друг друга или / и имеют среднюю кишку, которая подразделяется на три группы.
   Примечание. Эмбрионы, окрашенные 1D4-антителом, могут быть организованы на основе проекционных рисунков моторных аксонов ISN и ISNb. После выхода из CNS, A7, A8 и A9 ISN neRves эмбрионов поздней стадии-16 сходятся, чтобы коснуться друг друга и впоследствии расходиться, чтобы простираться далеко до дорзальных мышц (стрелка на рис. 1А ). Однако у эмбрионов середины-16 нервы A7 ISN распространяются параллельно с нервами A8 / A9 (квадратная скобка на рисунке 1B ). Кроме того, проекционные оси нервов A6 ISNb (перпендикулярно вентролатеральным мышцам) в обоих полушариях грубо выровнены с задним концом продольных аксонных пучков CNS (стрелки и линия на рисунке 1C ). Эти морфологические критерии несколько различаются между различными генотипами. Альтернативно, эмбрионы могут быть организованы на основе морфологии кишечника ^{9 , 11} . До этапа 17 средняя кишка имеет сердечную форму, тогда как средняя кисть подразделяется на три полосы по этапу 17 ¹² .
3. Рассеивайте эмбрионы.
   1. Использование 1 мL, переместите каждый эмбрион из глицериновой капли и поместите эмбрион вентрально вверх. Отрежьте переднюю часть на 1/4 длины тела и самую заднюю область, свободную от моторных аксонов.
   2. Используя игольчатый зонд, переместите вырезанный эмбрион из глицериновой капли, чтобы ориентировать его дорзальной стороной вверх и поместить его горизонтально в поле.
      Примечание: Когда эмбрион перемещается из глицериновой капли, немного глицерина, связанного с эмбрионом, делает его липким.
   3. Вырежьте эмбрион вдоль спинной срединной линии, используя одну очень тонкую вольфрамовую иглу ¹³ . Сделайте небольшой разрез на заднем конце эмбриона, а затем продолжайте резать спинную среднюю линию к передней; Резка в противоположном направлении также прекрасна.
   4. Используя игольчатый зонд, переместите срединный срезанный эмбрион в каплю глицерина, поместите его дорзальной стороной вверх и отсоедините кишечник от стенки корпуса, развернув каждую стенку тела в вентролатеральном (диагональном) направлении (2.5X).
      Примечание. Убедитесь, что спинная средняя линия полностью отрезана, что приводит к полному разделению между левой и правой стенками корпуса.
   5. Осторожно перемещайте эмбрион с срединной средой из глицериновой капли, а затем положите два лоскута стенки тела на стеклянную ползунь с помощью тонкого иглодержателя (цель 2.5X).
   6. Используя очень тонкую вольфрамовую иглу, удалите внутренние органы из расчлененного эмбриона, нажимая их в поперечном направлении (объектив 5X).
      Примечание. Более подробное описание другой аналогичной процедуры вскрытия можно найти на веб-сайте ⁵ .
4. Для монтажа добавьте 2-3 мкл 70% раствора глицерина / PBS для очистки, рассечения эмбрионов и, используя тонкий иглопробивной аппарат, перенесите их на новый стеклянный предмет, на который 8 мкл 70% раствора глицерина / PBS Центр (цель 2.5X).
5. Наденьте покровное (18 мм x 18 мм). Уплотните края покровного стекла обычным лаком для ногтей (либоПрозрачный или цветной).
6. Захват изображений с высоким разрешением (20X, 40X и 63X маслонаполняющих целей) под микроскопом с дифференциальным помеховым контрастом (DIC) в соответствии с инструкциями производителя.
   Примечание. Лучшая визуализация и фенотипическая характеристика, особенно для аксонов двигателя ISNb, могут быть получены с использованием объекта 63X для погружения масла.

Результаты

Точные соединения между аксонами мотора и мышцами мишени при развитии нервной системы зависят от селективного отталкивания аксонов и аксонов и распознавания цели в определенных точках выбора ⁴ . У дрозофилы селективное отталкивание между моторными...

Обсуждение

Детали дефектов наведения аксонов двигателя оцениваются быстрее и с большей точностью путем филеарного приготовления эмбрионов, окрашенных DAB, чем лазерная сканирующая конфокальная микроскопия флуоресцентно меченных. Таким образом, филеобразный препарат фиксированных и 1D4-окрашенн...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)