Visualisation du modèle de projection axonale des neurones du moteur embryonnaire dans<em&gt; Drosophila</em

Résumé

Ce travail décrit une méthode d'immunohistochimie standard pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. La préparation en filets d'embryons fixés colorés à l'aide d'un anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes requis pour le suivi des axones motrices et la reconnaissance des cibles lors du développement neuronal.

Résumé

L'établissement de circuits neuromusculaires fonctionnels repose sur des liens précis entre le développement des axones moteurs et les muscles cibles. Les neurones moteurs étendent les cônes de croissance pour naviguer selon des voies spécifiques en répondant à un grand nombre de repères d'axones qui émanent de l'environnement extracellulaire environnant. La reconnaissance de la cible de cône de croissance joue également un rôle critique dans la spécificité neuromusculaire. Ce travail présente un protocole standard d'immunohistochimie pour visualiser les projections de neurones moteurs d'embryons de Drosophila melanogaster en phase finale 16. Ce protocole comprend quelques étapes clés, y compris une procédure de génotypage, pour trier les embryons mutants désirés; Une procédure d'immunocoloration, pour marquer les embryons avec un anticorps fasciclin II (FasII); Et une procédure de dissection, pour générer des préparations en filets à partir d'embryons fixes. Les projections d'axones moteurs et les modèles musculaires dans la périphérie sont mieux mieux visualisés dans des préparations plates d'embryons en filets que dans whEmbryons montés à l'huile. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés colorés avec de l'anticorps FasII fournit un outil puissant pour caractériser les gènes nécessaires à la détection des axones et à la reconnaissance des cibles des axones, et peut également être appliqué à la fois aux écrans génétiques de perte de fonction et de gain de fonction .

Introduction

Des liaisons précises et sélectives entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement embryonnaire sont essentielles pour la locomotion normale dans les larves de Drosophila . Le modèle embryonnaire de 30 fibres musculaires dans chacun des hémisogravages abdominaux A2-A7 est établi par étape 16 ¹ . Les 36 neurones moteurs qui sont générés dans le cordon nerveux ventral étendent leurs axones à la périphérie pour inerver les muscles cibles spécifiques ² . L'identification par voie axonale motrice et la reconnaissance des cibles peuvent être visualisées par immunohistochimie avec un anticorps (anticorps monoclonal de souris 1D4) ^{3 , 4} . Des images multiples des modèles de projection d'axones moteurs dans des embryons de type sauvage sont disponibles sur le Web ⁵ . L'anticorps 1D4 marque tous les axones moteurs et trois fascicules axonaux longitudinaux de chaque côté de la ligne médiane du système nerveux central embryonnaire (SNC) ^{4 , 6} ( Figure 1C et Figure 2A ). Par conséquent, l'immunohistochimie avec l'anticorps FasII fournit un outil puissant pour identifier les gènes nécessaires à la connectivité neuromusculaire pour démontrer les mécanismes moléculaires sous-jacents à la direction de l'axone moteur et à la reconnaissance des cibles.

Dans chacun des hémisogravages abdominaux A2-A7, les axones moteurs se projettent et sélectivement fasciculent en deux branches nerveuses principales, le nerf segmentaire (SN) et le nerf intersegmentaire (ISN) ^{2 , 4} et une branche nerveuse mineure, le nerf transversal (TN ) ⁷ . Le SN sélectivement défascecte pour donner naissance à deux branches nerveuses appelées SNa et SNc, alors que l'ISN se divise en trois branches nerveuses appelées ISN, ISNb et ISNd ^{2 , 4} . Parmi eux, l'axon moteur ISN, ISNb et SNaLes profils de projection sont visualisés avec précision lorsque les embryons de phase 16 sont colorés avec des anticorps FasII et sont filetés ( Figure 1C et Figure 2A ). Les neurones moteurs ISN étendent leurs axones pour innerver les muscles dorsaux 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 et 20 ^{2 , 4} ( figure 2A ). Les neurones moteurs ISNb inervent les muscles ventrolatéraux 6, 7, 12, 13, 14, 28 et 30 ^{2 , 4} ( Figure 2A et 2B). La branche nerveuse SNa projette d'innerver les muscles latéraux 5, 8, 21, 22, 23 et 24 ^{2 , 4} ( figure 2A ). Le TN, qui se compose de deux axones moteurs, projette de manière ipsilatéralement le long de la bordure segmentaire pour innerver le muscle 25 et fait des synapses avec le neurone dendritique bipolaire latéral (LBD)Périphérie ⁷ ( figure 2A ). Ces insuffisances musculaires cibles exigent non seulement la défascication sélective des axones moteurs à des points de choix spécifiques, mais aussi la reconnaissance musculaire cible. De plus, certaines cellules putatives de piste de guidage mésodermiques qui agissent comme des cibles intermédiaires ont été trouvées dans les voies ISN et SNa, mais pas le long de la voie ISNb ⁴ . Cela pourrait suggérer que le guidage de l'axone du moteur ISNb peut être réglé de manière distincte par rapport au guidage de l'axone du moteur ISN et SNa, et indique également que le guidage axonal du moteur périphérique fournit un modèle expérimental attrayant pour étudier les rôles différentiels ou conservés d'un seul guidage Molécule ⁸ .

Ce travail présente une méthode standard pour visualiser les modèles de projection axonale des neurones moteurs embryonnaires dans Drosophila . Les protocoles décrits incluent la façon de disséquer des embryons fixés colorés avec 1D4 aNtibody et traité en 3,3'-diaminobenzidine (DAB) pour les préparations en filets. Un avantage critique des préparations plates d'embryons fixes est la meilleure visualisation des projections axonales et des modèles musculaires dans la périphérie. En outre, ce travail montre également comment génotyper des embryons fixes pour trier les embryons mutants souhaités en utilisant la méthode de coloration LacZ.

Protocole

1. Préparation

1. Préparer 500 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec une solution de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (PBT) en ajoutant 0,5 g de sérumalbumine bovine (BSA) et 0,5 ml de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol (voir la Table des matières) à 500 ml de PBS 1X Et en remuant pendant au moins 30 minutes. Conserver à 4 ° C. Utiliser quand il s'agit relativement frais et conserver la solution dans une bouteille propre.
2. Faire 10 ml de paraformaldéhyde à 4% en ajoutant 2,5 ml de solution de paraformaldehyde stock à 16% et 1 ml de PBS 10x à 6,5 ml d'eau désionisée. Conserver à 4 ° C et utiliser dans une semaine.
   ATTENTION: Évitez le contact avec la peau avec la solution de paraformaldéhyde car elle est très toxique.
3. Faire du substrat X-Gal (10% p / v de X-Gal dans du diméthylsulfoxyde (DMSO)) en dissolvant 0,1 g de substrat X-Gal par 1 ml de DMSO. Conserver à -20 ° C dans des aliquotes de 100 μL.
4. Faire une solution de coloration au X-Gal en utilisant un tampon phosphate 10 mM (pH 7,2), NaCl 150 mM, MgCl ₂ 1 mM, 3 mMK ₄ [FeII (CN) ₆ ], 3 mM de K3 [FeIII (CN) ₆ ] et 0,3% de t-octylphénoxypolyéthoxyéthanol. Conserver à 4 ° C dans l'obscurité.
5. Faire une solution à 3% de peroxyde d'hydrogène en diluant 30% de peroxyde d'hydrogène stock 1:10 avec de l'eau désionisée.
6. Faire une solution de 3,3'-diaminobenzidine (DAB) en dissolvant complètement 1 comprimé (10 mg) de DAB dans 35 ml de solution de PBT fraîche. Filtrer par un filtre à seringue de 0,2 μm et conserver à -20 ° C dans des aliquotes de 910 μL.
   ATTENTION: Éliminer tous les déchets DAB dans l'eau de Javel pour détruire le DAB.
7. Faire des œufs au jus de pomme. Ajouter 35 g d'agar et 1 L d'eau désionisée dans un flacon de 2 L. Ajouter 33 g de saccharose, 2 g de tegose et 375 ml de jus de pomme dans un flacon de 1 L. Les faire fondre en autoclave pendant 30 min. Permettre aux deux solutions de refroidir à environ 60 ° C. Combinez et mélangez ces solutions bien en remuant. Verser ~ 11 ml de solution combinée par plat de culture de 60 mm.
8. Faire de la levure en mélangeant au boulangerEn eau désionisée (rapport 1: 0,8) et conserver à 4 ° C.

2. Collection d'embryon (jour 1)

1. Recueillir de jeunes mouches femelles et mâles (moins de 5 jours) et pendant 1 à 2 jours, les maintenir dans une cage de bécher en plastique avec une plaque d'oeuf (60 mm x 15 mm) qui contient une petite quantité de levure dans le centre.
2. Pour la collecte optimale des embryons à la fin de l'étape 16, mettre en place une cage de bouteille avec des mouches (> 50) vers 5 heures et laisser reposer des œufs à 25 ° C pendant 3 h.
3. Transférer les mouches dans une bouteille de nourriture fraîche.
4. Fermer la plaque d'oeuf avec le couvercle et l'incuber à l'envers à 25 ° C dans un incubateur humidifié (~ 70% d'humidité) pendant la nuit.

3. Préparation des embryons pour l'immunocoloration (jour 2)

1. Ajouter 1,8 ml de solution PBT à la plaque d'oeufs vers 10 h 20 et utiliser un coton-tige pour dégager les embryons de la plaque tout en la basculant.
   Note: En foulant doucement la pâte de levure à l'aide d'un cottSur l'écouvillon, dissolvez-le au cas où un grand nombre d'embryons y serait trouvé. Commencer à collecter les embryons ~ 40 min avant la fixation (vers 11h00).
2. Transférer les embryons de la plaque d'oeufs à un microtube de 1,5 ml en utilisant une pointe de pipette de 1 ml.
3. Permettre aux embryons de s'installer et d'aspirer la solution PBT autant que possible. Rincer les embryons deux fois avec 1 mL de solution de PBT. Aspirez la solution PBT autant que possible.
4. Remplir le tube avec 1 mL d'eau de Javel à 50% ( c.-à-d., Dilué dans de l'eau désionisée) et déchorioner les embryons en les incubant sur un nutator pendant 3 min à température ambiante (RT).
   Note: Cette étape ne tue pas les embryons déchorés.
5. Autoriser les embryons déchorés à s'installer, aspirer le blanchisseur à 50% autant que possible et rincer les embryons 3 fois avec 1 ml de solution de PBT.
6. Ajouter 0,5 ml d'heptane et ensuite ajouter 0,5 ml de solution de paraformaldehyde à 4% au tube à la température ambiante d'environ 11 h.
7. Incuber leEmbryons sur un nutator pendant 15 min à la RT.
8. Enlevez la solution de 4% de paraformaldéhyde (la couche inférieure).
9. Ajouter 0,5 ml de methanol à 100% et dévélifier les embryons en agitant vigoureusement le tube pendant 30 s.
10. Retirez l'heptane ( c'est-à-dire la couche supérieure).
11. Ajouter 0,5 ml de methanol à 100% et agiter vigoureusement le tube pendant 10 s.
12. Laissez les embryons s'installer en tapotant le tube et aspirer le méthanol autant que possible. Rincer les embryons avec 1 ml de methanol à 100%, secouer pendant moins de 10 s.
    Note: L'exposition prolongée au méthanol détruit l'activité β-Gal.
13. Enlever le méthanol et rincer les embryons dévéloïdés 3 fois avec 1 ml de solution de PBT.

4. Génotypage des embryons utilisant la coloration LacZ (jour 2)

1. Ajouter 1 mL de solution de PBT au tube et incuber le tube dans un bloc de chaleur de 37 ° C ou un bain d'eau pendant 15 min.
2. Pendant l'incubation, placez la solution de coloration X-Gal (1 mL par tuÊtre) à 65 ° C dans un bain-marie jusqu'à ce qu'il soit nuageux. Incuber le dans un bain-marie à 37 ° C.
3. Aspirer la solution PBT et ajouter 1 ml de solution de coloration au X-Gal et 20 μL de substrat X-Gal au tube.
4. Incuber le tube à 37 ° C avec nutation jusqu'à ce qu'un précipité bleu soit évident.
   Note: Le temps d'incubation pour les 2 ^e et 3 ^e balanciers bleus en général varie de 2-4 h.
5. Retirez la solution de coloration X-Gal et rincez les embryons 3 fois avec 1 mL de solution de RT PBT.
6. À l'aide d'une sonde à aiguilles ou d'une pince, trier à la main les embryons du génotype désiré ( c'est-à-dire des embryons blancs non colorés) avec un microscope à dissection légère (objectifs de 1,6 x 2,5x).
   Note: Étant donné que certains équilibreurs bleus, tels que CyO, acttin-LacZ et TM3, acttin -LacZ , portent une construction transgénique exprimant la β-Gal bactérienne (LacZ) sous le contrôle du promoteur d' actine , les embryons teints au bleu de façon omniprésente contiennentUne ou deux copies de chromosomes bleus d'équilibrage. Par conséquent, les embryons blancs non colorés sont homozygotes pour l'allèle létale désiré.

5. L'immunocoloration des embryons avec des anticorps anti-Fasciclin II (jour 2-3)

1. Recueillir et transférer les embryons du génotype souhaité ( c.-à-d., Des embryons blancs non colorés) à un microtube de 0,5 mL en utilisant une pointe de pipette de 1 ml.
   Note: Dans cette étape, les embryons peuvent être organisés en fonction de critères morphologiques, y compris les schémas de segmentation de la cuticule et les structures de la tête et de la queue ⁹ . Pendant l'involution de la tête, entre 10 et 16 h après l'introduction des œufs, l'embryon subit une réduction prononcée du segment le plus antérieur ⁹ .
2. Laver les embryons une fois avec 0,4 ml de solution de PBT et ajouter 0,3 ml de solution de blocage (5% de sérum de chèvre normal et 5% de DMSO dans une solution de PBT).
3. Bloquer les embryons avec nutation à la RT pendant 15 min.
4. Ajouter 75 μL d'anticorps anti-Fasciclin II et incuber le tube avec une nutation à la RT pendant une nuit.
5. Laver les embryons 4 fois avec 0,4 ml de solution PBT pendant au moins 20 minutes par lavage.
6. Ajouter 0,3 ml de solution bloquant (5% de sérum de chèvre normal dans une solution de PBT) contenant des anticorps anti-souris-HRP de chèvre (2 μg / mL) et incuber le tube avec une nutation à TA pendant une nuit.
7. Laver les embryons 6 fois avec 0,4 ml de solution PBT pendant au moins 20 minutes par lavage.
8. Ajouter 0,3 ml de solution DAB au tube.
   ATTENTION: porter des gants et placer tous les déchets / tubes / conseils DAB dans de l'eau de Javel.
9. Ajouter 2 μl de peroxyde d'hydrogène à 3% et incuber le tube dans l'obscurité avec une nutation à TA jusqu'à ce que la quantité souhaitée de précipité soit produite.
   Note: Le temps d'incubation pour l'immunohistochimie 1D4 en général varie de 0,5 à 1 h.
10. Laver les embryons 4 fois avec 0,4 ml de solution de PBT.
    ATTENTION: Retirez la solution DAB et les deux premières lavages avec une pipette et diScardez-les dans de l'eau de javel.
11. Ajouter 0,2 ml de solution à 70% de glycérol / PBS au tube et conserver à la température ambiante ou à 4 ° C.
    Remarque: retirez le tube de la lumière. Des préparations plus claires peuvent être obtenues en plaçant les embryons dans une solution à 90% de glycérol / PBS ¹⁰ . Cependant, il est plus difficile de disséquer les embryons dans une solution à 90% de glycérol / PBS que ceux éliminés dans une solution de glycérol à 70% / PBS ¹⁰ .

6. Mise en scène, dissection, montage et imagerie des embryons (jour 4)

1. Pour la mise en scène, transférer les embryons équilibrés avec 70% de glycérol / PBS sur une lame de verre.
2. Recueillir des embryons de stade 16 avancés qui ont des nerfs abdominaux du segment 7 (A7), A8 et A9 qui convergent pour se toucher ou / et ont un ventre moyen qui est subdivisé en trois bandes.
   Note: Les embryons colorés avec un anticorps 1D4 peuvent être organisés en fonction des modèles de projection des axones moteurs ISN et ISNb. Après avoir quitté le CNS, A7, A8 et A9 ISN neLes embryons de la fin de l'étape-16 convergent pour se toucher et ensuite divergent pour s'étendre loin vers les muscles dorsaux (flèche de la figure 1A ). Dans les embryons de mi-stade 16, cependant, les nerfs A7 ISN s'étendent parallèlement aux nerfs A8 / A9 (crochets de la figure 1B ). En outre, les axes de projection des nerfs A6 ISNb (perpendiculaires aux muscles ventrolatéraux) dans les deux hémisaments sont approximativement alignés avec l'extrémité postérieure des fascicules de l'axone longitudinal CNS (flèches et une ligne de la figure 1C ). Ces critères morphologiques varient quelque peu entre les différents génotypes. Alternativement, les embryons peuvent être organisés en fonction de la morphologie intestinale ^{9 , 11} . Avant l'étape 17, le intestin moyen a une forme semblable à un coeur, alors que le intestin moyen est subdivisé en trois bandes par la scène 17 ¹² .
3. Dissectez les embryons.
   1. En utilisant 1 mL, déplacez chaque embryon de la goutte de glycérol et placez l'embryon face ventrale vers le haut. Couper la partie antérieure à 1/4 de la longueur du corps et la région la plus postérieure exempte d'axones moteurs.
   2. À l'aide d'une sonde à aiguille, déplacez l'embryon coupé fin de la goutte de glycérol, roulez pour orienter le côté dorsal vers le haut et placez-le horizontalement dans le champ.
      Remarque: Lorsque l'embryon est déplacé hors de la goutte de glycérol, un peu de glycérol associé à l'embryon le rend collant.
   3. Couper l'embryon le long de la ligne médiane dorsale à l'aide d'une seule aiguille très fine en tungstène ¹³ . Faire une petite coupe à l'extrémité postérieure de l'embryon, puis continuer à réduire la ligne médiane dorsale vers l'antérieur; Couper dans la direction opposée est également bien.
   4. À l'aide d'une sonde à aiguille, déplacez l'embryon coupé vers le milieu dans la goutte de glycérine, placez le côté dorsal vers le haut et détachez l'intestin de la paroi du corps en déployant chaque paroi du corps dans une direction ventrolatérale (diagonale) (2Objectif .5X).
      Remarque: Assurez-vous que la ligne médiane dorsale est complètement découpée, ce qui entraîne la séparation complète entre les parois du corps gauche et droit.
   5. Déplacez soigneusement l'embryon coupé au milieu de la goutte de glycérol, puis posez deux volets de la paroi du corps vers le bas sur la glissière en verre à l'aide d'une sonde à aiguille fine (objectif 2.5X).
   6. En utilisant une aiguille de tungstène très fine, retirez les organes internes de l'embryon disséqué en les poussant latéralement (objectif 5X).
      Remarque: Une description plus détaillée d'une autre procédure de dissection similaire peut être trouvée sur le site Web ⁵ .
4. Pour le montage, ajouter 2-3 μL de solution de glycérol / PBS à 70% pour nettoyer les embryons disséqués et, en utilisant une sonde à aiguille fine, les transférer sur une nouvelle glissière en verre sur laquelle 8 μL de solution de glycérol / PBS à 70% ont été étalés Le centre (objectif 2.5X).
5. Mettez une lamelle (18 mm x 18 mm). Scellez les bords de la lamelle avec un vernis à ongles régulier (soitClair ou coloré est bien).
6. Capturez des images à haute résolution (objectifs d'immersion d'huile 20X, 40X et 63X) sous un microscope optique à contraste interférentiel différentiel (DIC), conformément aux instructions du fabricant.
   Remarque: une meilleure visualisation et une caractérisation phénotypique, en particulier pour les axones moteurs ISNb, peuvent être produites en utilisant un objectif d'immersion au pétrole 63X.

Résultats

Les connexions précises entre les axones moteurs et les muscles cibles pendant le développement neuronal dépendent de la répulsion axon-axonique sélective et de la reconnaissance de cible à des points de choix spécifiques ⁴ . Chez Drosophila , la répulsion sélective entre les axones moteurs est en partie régie par l'action combinée des semaphorines de classe 1 et 2 (Semas), y compris Sema-1a, Sema-2a et Sema-2b ⁸

Discussion

Les détails des défauts de guidage de l'axone motrice sont évalués plus rapidement et avec une meilleure précision par la préparation en filets d'embryons colorés au DAB que par microscopie confocale à balayage laser d'étiquettes fluorescentes. Par conséquent, la préparation en filets d'embryons fixés et colorés au 1D4 convient le mieux à la caractérisation fonctionnelle des molécules de guidage. Quatre grandes classes de repères d'orientation, y compris les netrins, les fentes, les ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)