Entrega intranasal de células madre terapéuticas a glioblastoma en un modelo de ratón

Resumen

Las células madre son portadores terapéuticos prometedores para tratar tumores cerebrales debido a su tropismo tumoral intrínseco. La administración intranasal no intrusiva de células madre evita la barrera hematoencefálica y demuestra un fuerte potencial para la traducción clínica. Este artículo resume los principios básicos de la entrega de células madre intranasales en un modelo de ratón de glioma.

Resumen

El tropismo intrínseco hacia las neoplasias malignas del cerebro hace que las células madre sean portadores prometedores de agentes terapéuticos contra los tumores malignos. El suministro de células madre terapéuticas a través de la vía intranasal es una estrategia alternativa descubierta recientemente, con un fuerte potencial de traducción clínica, debido a su naturaleza no invasiva en comparación con la implantación intracraneal o la administración a través de rutas sistémicas. La falta de barrera hematoencefálica refuerza aún más el potencial terapéutico de las células madre sometidas a la entrada intranasal cerebral. Este artículo resume las técnicas esenciales utilizadas en nuestros estudios y describe los principios básicos de la estrategia intranasal para la entrega de células madre utilizando un modelo de ratón de xenoinjertos de glioma intracraneal. Demostramos los procedimientos optimizados que generan resultados consistentes y reproducibles con parámetros experimentales predeterminados específicos y ofrecen pautas para el flujo de trabajo aerodinámico que garantizan una ejecución eficiente y un experime confiableResultado final. El artículo está diseñado para servir como base para una mayor personalización experimental basada en hipótesis, tipos de células madre o específicos de tumores.

Introducción

La baja toxicidad, la baja inmunogenicidad y el tropismo intrínseco del tumor cerebral de las células madre humanas son rasgos atractivos para el suministro de vehículos terapéuticos ¹ . Las nuevas terapias basadas en células madre para tumores cerebrales malignos son innovaciones prometedoras desarrolladas en los últimos años y la adaptación intranasal de esta estrategia terapéutica representa un salto hacia la traducción clínica, ya que la administración no invasiva y repetida podría reducir drásticamente la barrera para las aplicaciones de los pacientes y Puede ser adaptable para servicios ambulatorios sin anestesia general o servicio prolongado de pacientes hospitalizados asociados con procedimientos quirúrgicos invasivos ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Nosotros y otros hemos sido pioneros de la vía intranasal de la entrega de células madre a los tumores cerebrales y hemos puesto el trabajo en el suelo para algunos de los principios básicosDe la investigación traslacional utilizando xenoinjerto de ratón modelos ^{2 , 3 , 4} , así como se investigó la migración de células madre in vivo a través de resonancia magnética (MRI) portadores de reactivos [ ^2] . A través de estas exploraciones piloto, hemos acumulado una experiencia sustancial y adquirido perspicacia en la mejor manera de construir una estrategia robusta de evaluación preclínica utilizando modelos de ratón xenoenxerto (PDX) de glioma maligno bien establecidos, manteniendo la resolución de investigación para examinar la Detalles mecánicos matizados de los sofisticados fenómenos biológicos de la entrada cerebral intranasal de células madre terapéuticas entregadas a la cavidad nasal. Aquí, describimos los principios de un protocolo de trabajo estandarizado para demostrar el estado actual de las investigaciones experimentales utilizando una bien establecida línea de células madre neurales humanas HB1.F3.CD ^{5 , 6 , 7 , 8 , que es fácilmente modificable para adaptarse a modelos o estrategias tumorales específicos usando células madre humanas como portadores terapéuticos.}

Protocolo

Todos los procedimientos con animales deben ser aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucionales (IACUC) o equivalente. Si hay alguna incertidumbre con respecto a los procedimientos específicos descritos aquí, no proceda. Aclarar con el IACUC de la institución y un miembro del personal veterinario designado.

1. Asegurar la esterilidad de las células cultivadas y seguir los principios de las técnicas asépticas

1. Siga las buenas prácticas de laboratorio estándar en todos los procedimientos de cultivo celular y los requisitos de IACUC para la prueba celular y la confirmación del estado libre de patógenos antes de administrar a los ratones ^{9 , 10} .
2. Siga el requisito NIH para la autenticación de la célula para garantizar un resultado reproducible ¹¹ .
3. Seguir las técnicas asépticas de cirugía de animales pequeños establecidas en este manuscrito ⁴ .

2. Preparación de células de glioma para In Vivo Experimento ^{2 , 4}

1. Se utilizaron células de glioma de cultivo (GBM43, GBM6 y U87MG) en suero bovino fetal al 10% en suero bovino fetal al 10% (DMEM) o medio sin suero (medio Neurobasal con suplementos B27, N2, heparina, factor de crecimiento epidérmico [ EGF], factor de crecimiento fibroblástico básico [bFGF], antibióticos y L - glutamina ¹² ), en un incubador de cultivo de células de CO ₂ humidificado.
   1. Pruebe todas las líneas celulares a través del panel transparente del ratón ejecutado por los proveedores de servicios comerciales.
2. Recoger las células adherentes mediante la eliminación del medio de cultivo. Incubar con tripsina al 0,05% durante 5 min a temperatura ambiente (1 ml de tripsina para el matraz T25, 2 ml para el matraz T75, escala correspondiente para los frascos de cultivo con mayor área superficial) y luego lavar las células con fosfato libre de Ca ²⁺ y Mg ²⁺ Solución salina tamponada (PBS).
   1. Toque en elPara desalojar las células y neutralizar inmediatamente con un exceso de medio que contiene suero (8 - 9 ml). A continuación, utilice pipetas serológicas para aspirar la suspensión celular en tubos de centrífuga.
   2. Centrifugar la suspensión celular a 400 xg durante 5 min. Lavar la célula al menos dos veces con 10 ml de PBS mediante centrifugación repetida.
   3. Recoger las células de glioma cultivadas como esferas tumorales en medio libre de suero por centrifugación (la misma velocidad y duración que anteriormente); Disociar el sedimento celular por incubación en 1 - 2 ml de disolución de separación celular a 37 ° C durante 5 minutos antes de lavar dos veces con 10 ml de PBS por centrifugación (400 xgx 5 min).
   4. Volver a suspender glioma en solución salina estéril a una concentración de 50.000 - 200.000 células por 2,5 μ l. Los números de células utilizados para la inyección en el cerebro del ratón dependen de la tasa de crecimiento establecida para cada línea celular de glioma. En este caso, utilizar 25.000 y 100.000 para GBM43 y GBM6 pacientes derivados de las células tumorales, respectivamente.
   5. Prepare el doble de la cantidad necesariaSsary número de células para la implantación para dar cuenta de la pérdida de una fracción durante el procedimiento. Transferir la suspensión de células inyectables a un tubo de microcentrífuga estéril y colocar el tubo sobre hielo. Mantenga las células en el hielo durante 2 h máximo durante las cirugías, preparar el nuevo lote si se planean cirugías extendidas.

3. Implantación intracraneal para crear modelos de ratón xenoinjerto ( Figura 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Antes del día de la cirugía, esterilice todas las herramientas quirúrgicas en un autoclave y prepare todo el material de cuidado de animales antes y después de la cirugía según el protocolo aprobado por IACUC. Esterilizar el marco estereotáxico y el equipo periférico para asegurar condiciones asépticas intraoperatorias, minimizando así las complicaciones.
2. Organizar el área de operación para minimizar el desorden y la posibilidad de contaminación.
3. Vestirse con equipo de protección personal adecuado(PPE) por requerimiento de IACUC.
4. Establecer la cámara de recuperación postoperatoria adecuada. Asegúrese de que los anestésicos y analgésicos se preparan frescos utilizando reactivos no expirados. Establecer instrumentos adecuados de mantenimiento del calor corporal según el protocolo aprobado por IACUC.
5. Para establecer xenoinjertos de células de glioma derivadas de pacientes humanos para la prueba de la administración intranasal de NSCs humanos, utilice especies de ratón inmunocomprometidas tales como ratón nu / nu atímico de cualquier género aproximadamente a las 6 semanas de edad.
6. Anestesiar el animal en función del peso corporal utilizando los reactivos aprobados, es decir , mediante una inyección intraperitoneal (ip) de una mezcla de ketamina (50-100 mg / kg, consultar IACUC institucional para el rango de dosis aprobado) y xilazina (5-10 mg / Kg, consultar IACUC institucional para el rango de dosis aprobado) en 200-250 μ l de solución salina estéril, o vía 4-5% de anestesia con isoflurano utilizando un dispositivo de inhalación.
   1. Asegúrese de que el animal ha alcanzado el plano de anestesia quirúrgica bPellizco antes de la incisión cutánea. Aplique un amplio gel oftálmico estéril para asegurar el estado húmedo de las córneas del animal.
7. Esterilizar el cráneo usando toallitas circulares repetidas y alternas de betadina y alcohol isopropílico según Pritchett-Corning et al. ¹⁴ .
8. Suministre la analgesia previa a la incisión por inyección sc de Buprenex (0.05 - 2 mg / kg) antes de la incisión con la cuchilla quirúrgica.
9. Utilice un aplicador con punta de algodón esterilizado para ayudar al hemostático mientras se expone el cráneo; Use peróxido de hidrógeno al 3% para facilitar el aclaramiento del sangrado incidental.
10. Utilice un taladro eléctrico de bolígrafo (inferior a 1 mm de ancho) para crear un orificio a 2 mm lateral, ya sea a la izquierda oa la derecha, a la línea media ya 2 mm detrás del Bregma (las coordenadas de la posición se pueden personalizar según la base En el modelo de tumor destinado a un estudio particular).
11. Montar el animal al marco estereotáxico para el apropiadoE la postura de la cabeza, de modo que la micro seringa Hamilton insertada sea perpendicular a la superficie del cráneo alrededor del orificio de la fresa. Tenga cuidado de asegurarse de que el plano anestésico del animal está en buen estado por pellizcar el dedo. Observe la frecuencia respiratoria para asegurarse de que el animal no está bajo estrés por dolor durante los siguientes pasos.
    * No hacemos hincapié en las ubicaciones en la barra del oído porque:
    1. Hemos predispuesto el agujero de la rebaba para posicionar la aguja, y por lo tanto, coordenadas precisas del cráneo son innecesarias;
    2. Los canales del oído del ratón son frágiles, y la colocación precisa en el oído de las barras del oído requiere un entrenamiento más involucrado que no es relevante para nuestro propósito. Los riesgos de daño a los canales auditivos de los ratones son mayores que los beneficios de una colocación precisa;
    3. El apoyo de las mejillas es mucho más fácil de realizar y capaz de alcanzar los mismos niveles de estabilidad y equilibrio de la cabeza del ratón durante el posicionamiento. Es un beneficio añadido para múltiples cirugías sensibles al tiempo para asegurarFinalización oportuna con buena viabilidad celular.
12. Utilice las perillas estereotáxicas del bastidor para colocar la micro seringa de punta plana en el orificio de rebaba, luego bájela lentamente a 3 mm por debajo de la superficie de la duramadre. Retraiga 0,5 mm para mantener la punta de la aguja a 2,5 mm por debajo de la duramadre.
13. Inyectar 2,5 μL de células de glioma precargadas durante el período de 1 min. Deje que la aguja mantenga su posición durante otros 1-2 minutos antes de que lentamente, en el transcurso de 1 minuto, retirar la aguja del cerebro y teniendo cuidado de minimizar el reflujo celular. Aplique cera ósea estéril para evitar la proliferación extracraneal de tumores.
14. Cierre la herida utilizando clips de acero inoxidable (7 mm). Entregar una inyección subcutánea (sc) de 1 ml de solución de Ringer lactada estéril (precalentada a 37 ° C) y colocar el animal en una cámara de recuperación que está a medio camino en una almohadilla de calentamiento.
15. Devuelva los animales al estante ventilado una vez que recuperan la movilidad y siga los cuidados postoperatorios de rutina para asegurarseH de recuperación.

4. In Vivo Bioluminescence Imaging (BLI) de crecimiento tumoral ( Figura 1B ) ¹⁵

NOTA: Las células de glioma derivadas del paciente se modifican para expresar luciferasa de luciérnaga. Esto nos permite seguir la progresión tumoral después de la implantación intracraneal.

1. Administre a los animales una inyección ip de la sal de potasio D-luciferina (150 mg / kg) 10 min antes de la sesión de formación de imágenes.
2. Coloque inmediatamente los animales en una cámara de inducción oxigenada de isoflurano aprobada por el IACUC.
3. Coloque los animales dentro de la cámara de imagen caliente (37 ° C) para capturar la señal BLI usando los ajustes del software (para detalles, vea instrucciones del fabricante).

5. Irradiación Cerebral Completa ( Figura 1C ) ^{2 , 4 , 13}

NOTA: Para mejorar la migración de hNSCs administrados intranasalmente a tumores cerebrales, se puede utilizar la irradiación cerebral total de ratones que portan xenoinjertos de tumor intracraneal ⁴ .

1. Utilizar una inyección ip de una mezcla de ketamina y xilazina (50-100 mg / kg y 5-10 mg / kg respectivamente, consultar IACUC institucional para el rango de dosis aprobado) con un plano de anestesia subquirúrgica para inducir moderadamente la anestesia de ratones.
2. Utilice una bandeja de muestras para posicionar los ratones dentro de la cámara entre los bloques de blindaje de plomo, permitiendo la exposición de la cabeza solamente a la trayectoria de radiación ( Figura 2 ).
3. Administre ratones con una confirmación BLI positiva del crecimiento del tumor (normalmente al día 7-8 después de la implantación de las células de glioma) una dosis diaria de 2 Gy de irradiación durante 5 días consecutivos. Realizar la evaluación BLI del tumor después de la última dosis de irradiación.

6. Modificación Genética de Células Madre Neuronales Humanas (NSCs, FigurE 3A) ⁴

1. Mantener NSCs humanos (clones HB1.F3.CD) ^{6 , 7} en medio DMEM con 10% de FBS y 1% de penicilina-estreptomicina en un incubador humidificado a 37ºC bajo 95% de aire ambiente y 5% de CO ₂ ( ^N NSCs).
2. Realizar la sobreexpresión genética de los receptores quimiotaxicos, como el receptor de quimioquinas 4 CXC motif (CXCR4), en hNSCs por transducción con lentivirus que codifica para CXCR4 humano.
   1. Cuando NSCs están cerca de 75-80% de confluencia, añada el lentivirus CXCR4 al medio de cultivo junto con polybrene (8 μg / mL) e incube durante 8 h o durante la noche.
   2. Sustituir el medio que contiene el virus por un medio fresco que contenga blasticidina a 4 μg / ml para la selección positiva de las células transducidas.
   3. Validar el nivel de expresión de CXCR4 en hNSCs modificados ( ^CXCR4 NSCs) a través de citometría de flujo utilizando anticuerpo anti-CXCR4 y anticuerpo isotipo coincidente y viUna RT-PCR cuantitativa utilizando un par de cebadores amplificadores CXCR4 y gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) cDNAs [ ^4] .
   4. Generar NSCs de control de vectores ( ^VC NSCs) usando la misma estrategia, con RFP reemplazando al gen CXCR4, y verificar mediante microscopía o citometría de flujo debido a la presencia de fluorescencia RFP.

7. Precondicionamiento hipóxico de NSC humanos ( Figura 3A ) ⁴

1. Se cultivaron NSC en placas en matraces de cultivo T75 como se ha descrito anteriormente hasta alcanzar una confluencia del 90%.
2. Colocar los frascos de cultivo celular dentro de una cámara / incubadora de CO ₂ humidificada con niveles de O ₂ mantenidos durante 24 h, a través de un suministro de gas N2 controlado por un medidor de flujo interno automatizado. Estas células se denominan ^H NSC. Los NSC de control ^N se describen en el paso 7.1.

8. Carga de HuHombre NSCs con Oncolytic Virus ( Figura 3B -3H ) ⁵

1. 8.1.Infección ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs y ^CXCR4 NSCs con 50 adenovirus replicativos condicionales (CRAd) -S-pk7 partículas / célula viral ^{4 , 16} .
2. 8.2 Después de 2 h de incubación a temperatura ambiente con extracción periódica, lavar las células tres veces con medios para eliminar las partículas virales no unidas y suspender las células en solución salina estéril para inyección.
   PRECAUCIÓN: Lleve a cabo todos los procedimientos de cultivo celular in vitro relacionados con virus en instalaciones con la designación de nivel de bioseguridad apropiado, como BSL2. Los investigadores que manipulan el virus oncolítico deben llevar equipo de protección personal adecuado según las directrices de las instalaciones institucionales para animales ^{4 , 16} .

9. Carga de células madre con microÓxidos de hierro paramagnéticos de tamaño n (MPIO) para el seguimiento in vivo mediante imágenes de resonancia magnética (RMN, Figura 3B -3H ) ²

1. Para etiquetar células madre, añada MPIOs a cultivos de células madre a ~ 80% de confluencia, en presencia de reactivo de transfección para incubación durante la noche. La eficacia del etiquetado de células madre (NSCs ⁴ o MSCs ² ) con MPIOs (flash rojo conjugado) se determina mediante citometría de flujo.
2. Para visualizar la migración y distribución de células madre en los cerebros de los animales que reciben gliomas, adquiera ambas imágenes de eco de spin de alta resolución ajustadas a T2 y de torsión rápida (FLASH) Evaluar la estructura a través de ambos planos coronal y axial del cerebro del ratón [ ^2] .

10. Entrega intranasal de NSC terapéuticos ( Figuras 1D y Figura 3D ) ^{2 , 4}

1. Cultura y recolección de NSCs ( ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs y ^CXCR4 NSCs) según el protocolo descrito en la sección 3.
   PRECAUCIÓN: Todos los procedimientos con animales que impliquen NSCs cargados de OV deben ser llevados a cabo en instalaciones con la designación de nivel de bioseguridad apropiada, tales como instalaciones BL2 o BSL2.
2. Anestesiar ratones vía inyección ip de una mezcla de ketamina y xilazina de acuerdo con el paso 3.6.
3. Coloque los ratones en un paño limpio hacia arriba con una almohadilla de calefacción debajo para mantener la temperatura corporal. Ajuste una almohada acolchada hecha de toallas de papel enrolladas con cintas para asegurar el ángulo vertical de las fosas nasales cuando se coloca debajo de la cabeza del ratón.
   NOTA: El pretratamiento con hialuronidasa (total de 100 U como cuatro inoculaciones repetidas a intervalos de 5 min, 3 μl en cada fosa nasal) de la nasal ePithelium se describió anteriormente ^{2 , 17} .
4. Usando una micropipeta, dispensar 2 μL de suspensión NSC a cada fosa nasal del ratón. Confirme visualmente la aspiración de la gotita antes de pasar al siguiente ratón. El número total de células entregadas puede ser determinado por el usuario; Utilizar 62.500-125.000 células / μl, de tal manera que 0,5-1 millones de células puedan administrarse en dosis de 4 x 2 μl.
5. Utilice un temporizador para asegurar intervalos de 5 minutos entre cada administración de suspensión celular, hasta 4 veces.
6. Permitir a los animales recuperar la movilidad en una cámara de recuperación, con la posición supina mantenido en todo.

11. Análisis de supervivencia ( Figura 3E )

1. Introduzca los datos de duración de supervivencia de los animales en software estadístico y realice comparaciones estadísticas utilizando la prueba log-rank con las siguientes designaciones de significación: * p < 0,05, ** p <00,01, *** p <0,001.

12. Recolección de tejidos e histología / inmunocitoquímica Verificación de la entrada de cerebro de células madre intranasales ^{2 , 4}

1. Al final del estudio, eutanasia los ratones a través de los protocolos aprobados por el IACUC. Una práctica estándar es usar una cámara de CO ₂ controlada por flujo para sacrificar a los animales como la estrategia primaria de eutanasia seguida de exanguinación por fijación de perfusión.
2. Inmediatamente después de ser sacrificado, realizar una perfusión intracardíaca con PBS en el animal para asegurar la eliminación de residuos de sangre de los vasos sanguíneos y la preservación de los tejidos para su posterior análisis histológico.
3. Coloque el animal eutanizado con CO ₂ encima de una almohadilla absorbente en posición supina, proceda con una laparotomía para exponer el músculo diafragma, que se diseca junto con la caja torácica, para exponer el corazón.
4. Después de maRey un nick en el atrio derecho con un par de tijeras de disección, acelerar la exsanguinación con un 3-5 ml de inyección de PBS a través del ventrículo izquierdo en el ápice. Inyectar al 4% de paraformaldehído (PFA) helado en la circulación usando una jeringuilla; Los espasmos musculares periféricos proporcionan la confirmación visual de que no hay bloqueo importante en la circulación que impida la correcta fijación del tejido.
5. Quirúrgicamente quitar la cabeza de la carcasa y conservar en un tubo de centrífuga de 50 ml en 4% PFA a 4 ° C durante la noche. Cambiar la solución a 30% de sacarosa al día siguiente antes de la disección del tejido cerebral otras 24 h más tarde.
6. Incrusta el tejido cerebral en el compuesto OCT y congela instantáneamente el isopentano sobre hielo seco. Realizar criosección del bloque de tejido resultante para generar secciones de tejido de 10-20 μm para aplicaciones histológicas e inmunocitoquímicas.

Resultados

Tanto el pre-tratamiento hipóxico ( Figura 4A ) ⁴ como la sobreexpresión de CXCR4 ( Figuras 4B y 4C ) ⁴ aumentan significativamente la presencia de membrana celular de los receptores CXCR4 como se demuestra por citometría de flujo. El tropismo tumoral demostrado por NSCs (flechas azules), se muestra en la histología del tejido tumoral (círculo rojo). La presencia de célul...

Discusión

Aunque la vía intranasal de administración de fármacos ha sido ampliamente explorada para moléculas pequeñas, nanomedicinas y compuestos proteínicos ¹⁸ , la aplicación de células madre terapéuticas para la determinación intranasal de tumores cerebrales es muy nueva en el espectro de terapias de tumores cerebrales en desarrollo ^{2 , 4} . Existen complejidades intrínsecas involucradas con respecto a los comportamientos de las célu...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506