Intranasale consegna delle cellule staminali terapeutiche a Glioblastoma in un modello di mouse

Riepilogo

Le cellule staminali sono promettenti vettori terapeutici per curare i tumori cerebrali a causa del loro tropismo tumorale intrinseco. La consegna delle cellule staminali intranasali non invasive bypassa la barriera del cervello e dimostra un forte potenziale per la traduzione clinica. Questo articolo riassume i principi fondamentali della consegna delle cellule staminali intranasali in un modello di topo di glioma.

Abstract

Il tropismo intrinseco verso malignità del cervello rende le cellule staminali come vettori promettenti di agenti terapeutici contro tumori maligni. La consegna di cellule staminali terapeutiche attraverso il percorso intranasale è una strategia alternativa scoperta di recente, con un forte potenziale di traduzione clinica, a causa della sua natura non invasiva rispetto all'intestazione intracranica o alla consegna attraverso percorsi sistemici. La mancanza di barriera sanguigna del sangue rafforza ulteriormente il potenziale terapeutico delle cellule staminali sottoposte a entrata intranasale del cervello. Questo articolo riassume le tecniche essenziali utilizzate nei nostri studi e delinea i principi fondamentali della strategia intranasale per la consegna delle cellule staminali usando un modello di mouse degli xenograft intracranici degli gliomi. Eseguiamo le procedure ottimizzate che generano risultati coerenti e riproducibili con specifici parametri sperimentali predeterminati e offrono linee guida per un flusso di lavoro semplificato che garantisca un'efficace esecuzione e un'esperienza affidabileRisultato ntal. L'articolo è stato progettato per servire da base per un'ulteriore personalizzazione sperimentale basata su ipotesi, tipi di cellule staminali o specifiche tumorali.

Introduzione

Bassa tossicità, bassa immunogenicità e tropismo tumorale intrinseco del cervello di cellule staminali umane sono tratti attraenti per la consegna di veicoli terapeutici ¹ . Le nuove terapie a base di cellule staminali per tumori cerebrali maligni sono promettenti innovazioni sviluppate negli ultimi anni e l'adattamento intranasale di questa strategia terapeutica rappresenta un salto verso la traduzione clinica, in quanto la somministrazione non invasiva e ripetuta potrebbe ridurre drasticamente la barriera per le applicazioni del paziente e Può essere adattabile per i servizi out-patient senza anestesia generale o un lungo servizio in pazienti associati a procedure chirurgiche invasive ^{1 , 2 , 3 , 4} .

Noi ed altri abbiamo introdotto la via intranasale di consegna delle cellule staminali nei tumori del cervello e abbiamo posto il terreno per alcuni dei principi fondamentaliDella ricerca traslazionale usando i modelli xenograft ^{2 , 3 e 4} del mouse, oltre a studiare la migrazione di cellule staminali in vivo tramite i rivelatori di risonanza magnetica (MRI) ² . Attraverso queste esplorazioni pilota, abbiamo accumulato un'esperienza notevole e abbiamo approfittato di come costruire una robusta strategia di valutazione pre-clinica usando modelli di topi xenograft (PDX) di pazienti derivanti da malattie degli amiomi maligni, pur mantenendo la risoluzione investigativa per esaminare I dettagli meccanici più sfumati dei fenomeni biologici sofisticati dell'ingresso cervello intranasale delle cellule staminali terapeutiche consegnate alla cavità nasale. Qui descriviamo i principi di un protocollo operativo standardizzato per dimostrare lo stato attuale di indagini sperimentali utilizzando una linea di cellule staminali neurali umane ben consolidate HB1.F3.CD ^{5 , 6 , 7 , 8 , che è facilmente modificabile adattarsi a modelli o strategie tumorali specifici che utilizzano cellule staminali umane come portatori terapeutici.}

Protocollo

Tutte le procedure animali devono essere approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) o equivalente. Se esiste qualche incertezza riguardo alle procedure specifiche descritte qui sopra, non procedere. Chiarire con l'IACUC dell'istituzione e un membro del personale veterinario designato.

1. Garantire la sterilità delle cellule coltivate e seguire i principi delle tecniche asettiche

1. Seguire le pratiche standard di laboratorio in tutte le procedure di coltura cellulare e requisiti IACUC per la sperimentazione delle cellule e la conferma di stato senza patogeni prima della somministrazione ai topi ^{9 , 10} .
2. Seguire il requisito di NIH per l'autenticazione delle celle per assicurare il risultato riproducibile ¹¹ .
3. Seguire le tecniche asettiche di chirurgia estetica stabilite stabilite in questo manoscritto ⁴ .

2. Preparazione delle cellule Glioma per Esperto in vivo ^{2 , 4}

1. Le cellule degli gliomi di cultura (GBM43, GBM6 e U87MG) in siero contenenti 10% di siero fetale bovino nel mezzo di Dulbecco's Modified Eagle [DMEM]) o in un siero-libero medium (Neurobasal medium con integratori B27, N2, eparina, fattore di crescita epidermica [ EGF], fattore di base di crescita del fibroblasto [bFGF], antibiotici e L-glutamina ¹² ), in un incubatore di coltura di cellule CO ₂ umidificato.
   1. Prova tutte le linee cellulari attraverso il pannello di pulizia del mouse eseguito da fornitori di servizi commerciali.
2. Raccogliere le cellule aderenti rimuovendo il mezzo di coltura. Incubare con 0,05% di trysina per 5 minuti a temperatura ambiente (1 mL di trypsina per la tampone T25, 2 mL per la fiala T75, scalare di conseguenza per i flaconi di coltura con superficie più grande) e quindi lavare le cellule con Ca ²⁺ e Mg ²⁺ Salina tamponata (PBS).
   1. Clicca ilPallone per dispiegare le cellule e neutralizzare immediatamente con un eccesso di terreno contenente siero (8 - 9 ml). Quindi utilizzare pipette sierologiche per aspirare la sospensione cellulare in tubi di centrifuga.
   2. Centrifugare la sospensione cellulare a 400 xg per 5 min. Lavare la cellula almeno due volte con 10 ml di PBS mediante centrifugazione ripetuta.
   3. Raccogliere le cellule degli gliomi coltivate come sfere tumorali nel mezzo libero di siero mediante centrifugazione (stessa velocità e durata come sopra); Dissociare il pellet cellulare mediante incubazione in 1 - 2 ml di soluzione di distacco cellulare a 37 ° C per 5 minuti prima di lavare due volte con 10 ml di PBS per centrifugazione (400 xgx 5 min).
   4. Rieccendere lo glioma in soluzione salina sterile ad una concentrazione di 50.000 - 200.000 cellule per 2,5 μL. I numeri delle cellule utilizzati per l'iniezione nel cervello del mouse dipendono dal tasso di crescita stabilito per ogni linea di cellule degli gliomi. Qui usa 25.000 e 100.000 per le cellule tumorali derivate dal paziente GBM43 e GBM6 rispettivamente.
   5. Preparare il doppio della quantità del neceNumero di cellule ssary per l'impianto per rappresentare la perdita di una frazione durante la procedura. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga sterile e posizionare il tubo sul ghiaccio. Mantenere le celle sul ghiaccio per massimo 2 ore durante gli interventi chirurgici, preparare il nuovo batch se sono previsti interventi di estensione.

3. Impianto Intracranico per la creazione di modelli di topi Xenograft ( Figura 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Prima della giornata di chirurgia, sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici in autoclave e preparare tutto il materiale precoce e post-chirurgico per la protezione degli animali per protocollo approvato dalla IACUC. Sterilizzare il telaio stereotatico e le apparecchiature periferiche per garantire condizioni asettiche intraoperatorie, minimizzando così le complicazioni.
2. Organizzare l'area operativa per ridurre al minimo lo smarrimento e la possibilità di contaminazione.
3. Vestire in equipaggiamento protettivo personale appropriato(PPE) per IACUC requisito.
4. Impostare una camera di recupero post-operativa appropriata. Assicurarsi che gli anestetici e gli analgesici siano preparati freschi utilizzando reagenti inesperti. Impostare gli appropriati strumenti di manutenzione del calore del corpo per protocollo approvato da IACUC.
5. Per stabilire xenografts di cellule degli gliomi derivate dal paziente umano per la sperimentazione della consegna intranasale di NSC umane, utilizzare specie di topo immunocompromettate come il topo atmico nu / nu di qualsiasi genere a circa 6 settimane di età.
6. Anestetizzare l'animale in base al peso corporeo utilizzando i reagenti approvati, ovvero mediante un'iniezione intraperitoneale (ip) di una miscela di ketamina (50-100 mg / kg; consulta IACUC istituzionale per gamma di dosaggio approvata) e xilazina (5-10 mg / Kg, consultare l'IACUC istituzionale per l'intervallo di dosaggio approvato) in 200-250 μL di soluzione salina sterile o attraverso 4-5% di anestesia isoflurana utilizzando un dispositivo inalatorio.
   1. Assicurarsi che l'animale abbia raggiunto il piano di anestesia chirurgica bY toe pinza prima dell'incisione della pelle. Applicare ampio gel oftalmico sterile per garantire lo stato umido delle cornee dell'animale.
7. Sterilizzare il cranio utilizzando salviette circolari ripetute e alternate di betadina e alcool isopropilico per Pritchett-Corning et al. ¹⁴ .
8. Fornire l'analgesia pre-incisione mediante iniezione di Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) prima dell'incisione usando la lama chirurgica.
9. Utilizzare un applicatore sterilizzato a cotone per aiutare l'emostato esponendo il cranio; Utilizzare il perossido di idrogeno al 3% per facilitare la clearance del sanguinamento accidentale.
10. Utilizzare un foro a sfera elettrico palmare a batteria (inferiore a 1 mm di larghezza) per creare un foro di sbavamento a 2 mm laterale, a sinistra oa destra, alla linea mediana e 2 mm dietro il Bregma (le coordinate di posizione possono essere personalizzate Sul modello tumorale destinato ad un determinato studio).
11. Montare l'animale al telaio stereotaxicico a quello appropriatoE che la siringa micro Hamilton inserita sia perpendicolare alla superficie del cranio intorno al foro della burrata. Fare attenzione a garantire che il piano anestetico dell'animale sia in buona condizione da pizzicamento del piede. Osservare la frequenza respiratoria per assicurarsi che l'animale non sia sotto stress durante le seguenti fasi.
    * Non sottolineiamo i posizionamenti in barra degli orecchi perché:
    1. Abbiamo preforato il foro di bavaggio per posizionare l'ago e pertanto precise coordinate del cranio non sono necessarie;
    2. I canali dell'orecchio del mouse sono fragili e il posizionamento preciso degli orecchini auricolari richiede una formazione più coinvolgente che non sia pertinente al nostro scopo. I rischi di danneggiamento dei canali uditivi murini superano i vantaggi di un posizionamento preciso;
    3. Il supporto per le guance è molto più semplice da eseguire e in grado di raggiungere gli stessi livelli di stabilità e bilanciamento della testa del mouse durante il posizionamento. È un vantaggio aggiunto per più operazioni chirurgiche sensibili al tempoCompletamento tempestivo con buona mobilità cellulare.
12. Utilizzare le manopole stereotossiche per posizionare la siringa liscia a punta piatta fino al foro della burrata, quindi abbassarla lentamente a 3 mm sotto la superficie dura. Ritirare 0,5 mm per mantenere la punta dell'ago a 2,5 mm sotto la dura.
13. Iniettare 2,5 μL di cellule glioma precaricate per un periodo di 1 min. Lasciare che l'ago mantenga la sua posizione per altri 1-2 minuti prima lentamente, nel corso di 1 minuto, prelevando l'ago dal cervello e facendo attenzione a minimizzare il flusso di cellule. Applicare la cera ossea sterile per evitare la crescita del tumore extracranico.
14. Chiudere la ferita utilizzando fermagli in acciaio inox (7 mm). Fornire un'iniezione sottocutanea (sc) di 1 ml di soluzione ringer lattata sterile (pre-riscaldata a 37 ° C) e mettere l'animale in una camera di recupero che è a metà su un tampone di riscaldamento.
15. Rimetti gli animali alla cremagliera ventilata una volta riconquistati la mobilità e seguite la cura post-op di routine per assicurare lo smootsoH recupero.

4. In Vivo Bioluminescenza Imaging (BLI) della crescita tumorale ( Figura 1B ) ¹⁵

NOTA: Le cellule del glioma derivate dal paziente vengono modificate per esprimere luciferasi a fiamma. Questo ci permette di seguire la progressione tumorale dopo l'impianto intracranico.

1. Dare agli animali un'iniezione ip di D luciferina, sale di potassio (150 mg / kg) 10 minuti prima della sessione di imaging.
2. Immediatamente mettere gli animali in una camera di induzione di isoflurano ossigenata approvata dalla IACUC.
3. Posizionare gli animali all'interno della camera di imaging riscaldata (37 ° C) per catturare il segnale BLI usando le impostazioni del software (per dettagli, vedere istruzioni del produttore).

5. Irradiazione del cervello intero ( Figura 1C ) ^{2 , 4 , 13}

NOTA: per migliorare la migrazione di hNSC consegnati intranasalmente ai tumori del cervello, può essere utilizzata l'irradiazione del cervello intero di topi contenenti i xenograft tumorali intracranici ⁴ .

1. Utilizzare un'iniezione ip di una miscela di ketamina e xilazina (50-100 mg / kg e 5-10 mg / kg rispettivamente; consultare l'IACUC istituzionale per una gamma di dosaggi approvata) con un piano di anestesia subchirurgica per indurre moderatamente anestesia per i topi.
2. Utilizzare un vassoio di campionamento per posizionare i topi all'interno della camera tra i blocchi di schermatura di piombo, consentendo un'esposizione solo a testa al percorso di radiazione ( Figura 2 ).
3. Dare ai topi una conferma positiva di BLI della crescita tumorale (normalmente al giorno 7-8 dopo l'impianto di glioma) una dose giornaliera di 2 Gy di irradiazione per 5 giorni consecutivi. Eseguire la valutazione BLI del tumore dopo l'ultima dose di irradiazione.

6. Modifica genetica delle cellule staminali neurali umane (NSCs; FigE 3A) ⁴

1. Mantenere un NSC umano (clone HB1.F3.CD) 6,7 in mezzo DMEM con 10% FBS e 1% penicillina-streptomicina in un incubatore umidificato a 37 ° C sotto l'aria ambiente del 95% e 5% di CO ₂ ( ^N NSCs).
2. Eseguire la sovraespressione genetica dei recettori chimotossici, come il ricercatore CKC CXC del chimocino 4 (CXCR4), in hNSC mediante trasduzione con codifica lentivirus per CXCR4 umano.
   1. Quando i NSC sono vicini alla confluenza del 75-80%, aggiungere il lentivirus CXCR4 al terreno di coltura insieme al polybrene (8 μg / mL) e incubare per 8 ore o durante la notte.
   2. Sostituire il mezzo contenente virus con un mezzo fresco contenente blasticidina a 4 μg / mL per la selezione positiva delle cellule trasdotte.
   3. Validare il livello dell'espressione di CXCR4 in hNSC modificati ( ^CXCR4 NSCs) mediante citometria a flusso utilizzando l'anticorpo anti-CXCR4 e l'anticorpo isotipo corrispondente e viUn RT-PCR quantitativo usando una coppia di primer che amplificano cDNA ⁴ e CXCR4 e gliceraldehid-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH).
   4. Generare i controlli vettoriali NSC ( ^VC NSCs) utilizzando la stessa strategia, con RFP che sostituisce il gene CXCR4 e verificare tramite microscopia o cytometry di flusso a causa della presenza di fluorescenza RFP.

7. Precondizionamento ipossico dei NSC umani ( Figura 3A ) ⁴

1. Le piastre coltivano NSCs in tazze di coltura T75 come sopra descritto fino al raggiungimento del 90% di confluenza.
2. Posizionare i flaconi di coltura delle cellule all'interno di una camera / incubatrice CO ₂ umidificata con livelli di 1% O ₂ mantenuti per 24 h, mediante alimentazione a gas N ₂ controllata da un automatico flussometro incorporato. Queste cellule sono denominate ^H NSCs. NSC di controllo ^N sono descritti nel passaggio 7.1.

8. Carico di HuUomini NSC con virus oncolitico ( Figura 3B -3H ) ⁵

1. 8.1 ^N Infissi ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs e ^CXCR4 NSCs con 50 particelle virali di adenovirus replicativa condizionata (CRAd) -S-pk7 / cellula ^{4 , 16} .
2. 8.2. Dopo 2 ore di incubazione a temperatura ambiente con tappatura periodica, lavare le cellule tre volte con i supporti per rimuovere le particelle virali non legate e sospendere le cellule in soluzione salina sterile per l'iniezione.
   ATTENZIONE: eseguire tutte le procedure di coltura delle cellule in vitro correlate al virus in strutture con l'indicazione appropriata di livello di biosicurezza, ad esempio BSL2. Appropriate attrezzature protettive individuali devono essere indossate dai ricercatori che trattano il virus oncolitico per linee guida istituzionali degli animali ^{4 , 16} .

9. Caricamento delle cellule staminali con MicroOssidi di ferro paramagnetici n (MPIO) per il monitoraggio in vivo tramite la risonanza magnetica (MRI, Figura 3B -3H ) ²

1. Per etichettare le cellule staminali, aggiungere MPIO a colture di cellule staminali a confluenza del ~ 80%, in presenza di reagente di transfection per incubazione durante la notte. L'efficacia dell'etichettatura delle cellule staminali (NSCs ⁴ o MSCs ² ) con MPIOs (flash coniugato rosso) è determinata dalla citometria a flusso.
2. Per visualizzare la migrazione e la distribuzione delle cellule staminali nei cervelli degli animali che sopportano gliomi, acquisire sia l'acquisizione rapida di pesata multipla con elevata risoluzione T2, sia le immagini di eco di spin di miglioramento della rilassamento e le sequenze di eco a gradi veloci della velocità bassa (FLASH) ponderata con T1 multipla Valutare la struttura sia attraverso i piani coronali che assiali del cervello del mouse ² .

10. Consegna Intranasale di NSC Terapeutici ( Figura 1D e Figura 3D ) ^{2 , 4}

1. Coltivare e raccogliere NSC ( ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs e NSCs ^CXCR4 ) secondo il protocollo descritto nella sezione 3.
   ATTENZIONE: Tutte le procedure di animale che coinvolgono NSC caricate da OV devono essere eseguite in impianti con l'indicazione appropriata di livello di biosicurezza, ad esempio strutture BL2 o BSL2.
2. Anestetizzare i topi mediante iniezione ip di una miscela di ketamina e xilazina secondo la fase 3.6.
3. Posizionare i topi su un tetto pulito rivolto verso l'alto con un sottogruppo di riscaldamento per mantenere la temperatura corporea. Regolare un cuscino imbottito fatto di tovaglioli di carta arrotolati con i nastri per assicurare l'angolo retto delle narici quando posto sotto la testa del mouse.
   NOTA: Pre-trattamento dell'alialuronasi (totale di 100 U come quattro inoculazioni ripetute a intervalli di 5 minuti, 3 μL in ogni narice) del naso ePithelium è stato descritto in precedenza ^{2 , 17} .
4. Usando una micropipetta, distribuire 2 μL di sospensione NSC ad ogni narice del mouse. Confermare visivamente la aspirazione della gocciolina prima di passare al mouse successivo. Il numero totale di celle consegnate può essere determinato dall'utente; Utilizzare 62,500-125,000 cellule / μL, in modo che 0,5-1 milioni di cellule possano essere consegnate in dosi di 4 x 2 μL.
5. Utilizzare un timer per assicurare intervalli di 5 minuti tra ciascuna somministrazione di sospensione cellulare, fino a 4 volte.
6. Consentire agli animali di riconquistare la mobilità in una camera di recupero, con la posizione supina mantenuta in tutto.

11. Analisi della sopravvivenza ( Figura 3E )

1. Inserire i dati relativi alla durata della sopravvivenza degli animali nel software statistico e eseguire comparazioni statistiche utilizzando il test di log-rank con le seguenti denominazioni di significato: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. La raccolta dei tessuti e l'istologia / immunocitochimica Verifica dell'entrata cerebrale delle cellule staminali intranasali ^{2 , 4}

1. Al punto finale dello studio, eutanizzare i topi attraverso i protocolli approvati da IACUC. Una pratica standard sta usando una camera di CO ₂ controllata da flusso di flusso per sacrificare gli animali come la strategia di eutanasia primaria seguita dall'esanguinamento mediante la fissazione della perfusione.
2. Immediatamente dopo essere stato sacrificato, eseguire una perfusione intracardiacale con PBS sull'animale per assicurare l'eliminazione dei residui di sangue dai vasi sanguigni e la conservazione dei tessuti per l'analisi istologica successiva.
3. Posizionare l'animale CO ₂ su un tampone assorbente in posizione supina, procedere con una laparotomia per esporre il muscolo diaframma, che viene disciolto insieme alla gabbia, per esporre il cuore.
4. Dopo mammaRe un nick sul atrio destro utilizzando un paio di forbici di dissezione, accelerare l'espansione con un 3-5 ml di iniezione PBS attraverso il ventricolo sinistro all'apice. Inietta una paraformaldeide (PFA) ghiacciata al 4% con una siringa; Le spasmi muscolari periferiche forniscono una conferma visiva che non vi è alcun blocco maggiore nella circolazione che impedisse una corretta fissazione dei tessuti.
5. Rimuove chirurgicamente la testa della carcassa e conserva in un tubo centrifuga da 50 ml in PFA al 4% a 4 ° C per una notte. Cambiare la soluzione al 30% di saccarosio il giorno seguente prima della dissezione del tessuto cerebrale altri 24 h più tardi.
6. Incorporare il tessuto cerebrale in composto OCT e congelare flash sull'isopentano sul ghiaccio secco. Eseguire la criocuzione del blocco di tessuto risultante per generare sezioni tissutali di 10-20 μm per istologia e applicazioni immunocitochimiche.

Risultati

Sia il pretrattamento ipossico ( Figura 4A ) ⁴ che la sovraespressione di CXCR4 ( figure 4B e 4C ) ⁴ aumentano significativamente la presenza di membrane delle cellule dei recettori CXCR4 come dimostrato dalla citometria a flusso. Il tropismo tumorale dimostrato da NSC (frecce blu), è mostrato nell'istologia del tessuto tumorale (cerchio rosso). La presenza di cellule stam...

Discussione

Sebbene sia stato ampiamente esplorato il percorso intranasale della somministrazione di farmaci per le piccole molecole, le nanomedicine e le proteine, ¹⁸ , l'applicazione di cellule staminali terapeutiche per il targeting tumorale intranazionale del cervello è molto nuova nello spettro delle terapie tumorali cerebrali in sviluppo ^{2 , 3 , 4} . Ci sono complicazioni intrinseche riguardanti i comporta...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506