Intranasale Abgabe von therapeutischen Stammzellen an Glioblastom in einem Mausmodell

Zusammenfassung

Stammzellen sind vielversprechende therapeutische Träger, um Hirntumoren aufgrund ihrer intrinsischen Tumor-Tropismus zu behandeln. Nicht-invasive intranasale Stammzell-Abgabe umgeht die Blut-Hirn-Schranke und zeigt ein starkes Potenzial für die klinische Übersetzung. Dieser Artikel fasst die Grundprinzipien der intranasalen Stammzellabgabe in einem Mausmodell des Glioms zusammen.

Zusammenfassung

Der intrinsische Tropismus gegenüber Gehirnmalignitäten macht Stammzellen als vielversprechende Träger von Therapeutika gegen bösartige Tumore. Die Bereitstellung von therapeutischen Stammzellen über die intranasale Route ist eine kürzlich entdeckte Alternativstrategie mit einem starken Potenzial für die klinische Translation aufgrund ihrer nicht-invasiven Natur im Vergleich zur intrakraniellen Implantation oder Lieferung über systemische Wege. Der Mangel an Blut-Hirn-Schranke stärkt das therapeutische Potenzial von Stammzellen, die sich dem intranasalen Hirneintritt unterziehen. Dieser Artikel fasst die wesentlichen Techniken zusammen, die in unseren Studien verwendet werden, und skizziert die Grundprinzipien der intranasalen Strategie für die Stammzelllieferung unter Verwendung eines Mausmodells von intrakranialen Gliom-Xenotransplantaten. Wir zeigen die optimierten Verfahren, die mit konkreten und reproduzierbaren Ergebnissen konsequent und reproduzierbare Ergebnisse liefern und Leitlinien für einen effizienteren Arbeitsablauf bieten, die eine effiziente Ausführung und einen zuverlässigen Erfahrungsprozess gewährleistenNtal Ergebnis Der Artikel soll als Grundlage für weitere experimentelle Anpassung auf der Grundlage von Hypothesen, Stammzelltypen oder Tumorspezifika dienen.

Einleitung

Niedrige Toxizität, niedrige Immunogenität und intrinsischer Hirntumortropismus menschlicher Stammzellen sind attraktive Merkmale für die Lieferung von therapeutischen Fahrzeugen ¹ . Neuartige Stammzell-basierte Therapeutika für maligne Hirntumoren sind vielversprechende Innovationen, die in den letzten Jahren entwickelt wurden, und die intranasale Anpassung dieser therapeutischen Strategie stellt einen Sprung zur klinischen Übersetzung dar, da nicht-invasive und wiederholte Verabreichung die Barriere für Patientenanwendungen drastisch reduzieren könnte Kann für ambulante Dienstleistungen ohne allgemeine Anästhesie oder langwierigen stationären Dienst, die mit invasiven chirurgischen Verfahren ^{1 , 2 , 3 , 4} verbunden sind ^, anpassbar sein.

Wir und andere haben den intranasalen Weg der Stammzell-Anlieferung an Hirntumoren vorangetrieben und haben die Grundlagen für einige der Grundprinzipien gelegtDer Translationsforschung mit den Maus-Xenotransplantatmodellen ^{2 , 3 , 4} sowie die Migration von Stammzellen in vivo mittels Magnetresonanztomographie (MRI) Reagenzträger ² untersucht. Durch diese Pilot-Explorationen haben wir umfangreiche Erfahrungen gesammelt und sich erkundigt, wie man eine robuste präklinische Evaluationsstrategie mit gut etablierten Patient-Xenotransplantat (PDX) -Mausmodellen des malignen Glioms konstruiert und dabei die Untersuchungslösung zur Untersuchung der Nuancierte mechanistische Details der anspruchsvollen biologischen Phänomene des intranasalen Hirneintrags von therapeutischen Stammzellen, die an die Nasenhöhle abgegeben wurden. Hier beschreiben wir die Prinzipien eines standardisierten Betriebsprotokolls, um den aktuellen Stand der experimentellen Untersuchungen unter Verwendung einer gut etablierten menschlichen neuralen Stammzelllinie HB1.F3.CD ^{5 zu} demonstrieren ^{, 6 , 7 , 8 , die leicht modifizierbar ist, um sich an spezifische Tumormodelle oder Strategien anzupassen, die menschliche Stammzellen als therapeutische Träger verwenden.}

Protokoll

Alle Tierverfahren müssen vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) oder gleichwertig genehmigt werden. Wenn es irgendeine Ungewissheit bezüglich der hier beschriebenen spezifischen Verfahren gibt, gehen Sie nicht vor. Klären Sie mit dem IACUC des Instituts und einem benannten tierärztlichen Mitarbeiter.

1. Sicherstellung der Sterilität von kultivierten Zellen und Verfolgungsprinzipien von aseptischen Techniken

1. Befolgen Sie die übliche gute Laborpraxis in allen Zellkulturverfahren und IACUC-Anforderungen für die Zelltests und die pathogenfreie Statusbestätigung vor der Verabreichung an die Mäuse ^{9 , 10} .
2. Befolgen Sie die NIH-Anforderung für die Zellenauthentifizierung, um reproduzierbares Ergebnis zu gewährleisten ¹¹ .
3. Folgen Sie etablierten Kleintierchirurgie aseptischen Techniken, die in diesem Manuskript umrissen werden ⁴ .

2. Vorbereitung der Gliomzellen für In vivo Experiment ^{2 , 4}

1. Kultur-Gliom-Zellen (GBM43, GBM6 und U87MG) in serumhaltigem (10% fötalem Rinderserum in Dulbecco's Modified Eagle's Medium [DMEM]) oder serumfreiem Medium (Neurobasales Medium mit Ergänzungen B27, N2, Heparin, epidermaler Wachstumsfaktor [ EGF], basischer Fibroblastenwachstumsfaktor [bFGF], Antibiotika und L-Glutamin ¹² ), in einem befeuchteten CO ₂ -Zellkulturinkubator.
   1. Testen Sie alle Zelllinien über die Maus klar Panel laufen von kommerziellen Dienstleister.
2. Sammeln Sie adhärente Zellen durch Entfernen von Kulturmedium. Inkubieren mit 0,05% Trypsin für 5 min bei Raumtemperatur (1 ml Trypsin für T25-Kolben, 2 ml für T75-Kolben, Maßstab entsprechend für Kulturkolben mit größerer Oberfläche) und dann Zellen mit Ca ²⁺ und Mg ²⁺ freiem Phosphat waschen Gepufferte Kochsalzlösung (PBS).
   1. Tippen Sie auf dieUm die Zellen zu entfernen und sofort mit einem Überschuss an serumhaltigem Medium (8 - 9 ml) zu neutralisieren. Verwenden Sie dann serologische Pipetten, um die Zellsuspension in Zentrifugenröhrchen zu saugen.
   2. Zentrifugenzellsuspension bei 400 xg für 5 min zentrifugieren. Die Zelle mindestens zweimal mit 10 ml PBS durch wiederholte Zentrifugation waschen.
   3. Sammle Gellomzellen, die als Tumorsphären in serumfreiem Medium durch Zentrifugation (gleiche Geschwindigkeit und Dauer wie oben) gewachsen sind; Das Zellpellet durch Inkubation in 1 - 2 ml Zellabtrennlösung bei 37 ° C für 5 min abzutragen, bevor man zweimal mit 10 ml PBS durch Zentrifugation (400 xgx 5 min) gewaschen hat.
   4. Das Gliom in steriler Kochsalzlösung in einer Konzentration von 50.000 - 200.000 Zellen pro 2,5 μl erneut suspendieren. Zellzahlen, die für die Injektion in das Maus-Gehirn verwendet werden, hängen von der etablierten Wachstumsrate für jede Gliom-Zelllinie ab. Hier verwenden Sie 25.000 und 100.000 für GBM43 und GBM6 Patienten-abgeleitete Tumorzellen.
   5. Bereiten Sie die doppelte Menge der Notwendigkeit vorSsary Zellzahl für die Implantation, um den Verlust eines Bruchteils während des Verfahrens zu berücksichtigen. Die injizierbare Zellsuspension in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen überführen und auf Eis geben. Halten Sie Zellen auf Eis für 2 h Maximum während der Operationen, bereiten neue Charge, wenn erweiterte Operationen geplant sind.

3. Intrakranielle Implantation zur Herstellung von Xenotransplant-Mausmodellen (Abbildung 1A ) ^{2 , 4 , 13}

1. Vor dem Operationstag sterilisieren alle chirurgischen Werkzeuge in einem Autoklaven und bereiten alle vor- und nachchirurgischen Tierpflegemittel nach IACUC-genehmigtem Protokoll vor. Sterilisieren Sie den stereotaxischen Rahmen und die Peripheriegeräte, um intraoperative aseptische Zustände zu gewährleisten und damit Komplikationen zu minimieren.
2. Organisieren Sie den Arbeitsbereich, um Unordnung und die Möglichkeit der Kontamination zu minimieren.
3. Kleid in entsprechender persönlicher Schutzausrüstung(PSA) nach IACUC-Anforderung.
4. Stellen Sie eine geeignete postoperative Erholungskammer ein. Sicherstellen, dass Anästhetika und Analgetika mit unerwünschten Reagenzien frisch zubereitet werden. Einrichten von geeigneten Körperwärmeanlagen nach IACUC-genehmigtem Protokoll.
5. Um menschliche Patienten-abgeleitete Gliomzellen-Xenotransplantate für die Untersuchung der intranasalen Verabreichung von menschlichen NSCs zu etablieren, verwenden Sie immunkompromittierte Mausarten wie nu / nu athymische Maus eines Geschlechts in etwa 6 Wochen alt.
6. Anästhesieren des Tieres auf der Grundlage des Körpergewichts unter Verwendung der zugelassenen Reagenzien, dh entweder über eine intraperitoneale (ip) Injektion eines Gemisches aus Ketamin (50-100 mg / kg, konsultieren institutionelle IACUC für zugelassenen Dosisbereich) und Xylazin (5-10 mg / Kg, konsultieren Sie den institutionellen IACUC für den zugelassenen Dosisbereich) in 200-250 μl steriler Kochsalzlösung oder über 4-5% Isoflurananästhesie mit einem Inhalationsgerät.
   1. Stellen Sie sicher, dass das Tier die chirurgische Anästhesie-Ebene erreicht hat bY Zehenkneifen vor dem Hautschnitt. Tragen Sie reichlich steriles ophthalmisches Gel auf, um den feuchten Zustand der Hornhaut des Tieres zu gewährleisten.
7. Sterilisieren Sie den Schädel mit wiederholten und wechselnden kreisförmigen Tüchern von Betadin und Isopropylalkohol pro Pritchett-Corning et al. ¹⁴
8. Versorgen Sie die Vorsequenz-Analgesie durch Sc-Injektion von Buprenex (0,05 - 2 mg / kg) vor dem Einschnitt mit dem chirurgischen Klinge.
9. Verwenden Sie sterilisierten Baumwoll-Kipp-Applikator, um Hämostat zu helfen, während Sie den Schädel aussetzen; Verwenden Sie 3% Wasserstoffperoxid, um die Freisetzung von beiläufigen Blutungen zu erleichtern.
10. Verwenden Sie einen batteriebetriebenen Handheld-Kugelschreiber (weniger als 1 mm in der Breite), um ein Bohrloch an 2 mm seitlich, links oder rechts, zur Mittellinie und 2 mm hinter dem Bregma zu erstellen (die Positionskoordinaten können individuell angepasst werden Auf das für eine bestimmte Studie bestimmte Tumormodell).
11. Montiere das Tier zum stereotaxischen Rahmen zum passendE Kopfhaltung, so dass die eingelegte Hamilton Mikrospritze senkrecht zur Oberfläche des Schädels um das Gratloch ist. Achten Sie darauf, dass die Anästhesieebene des Tieres durch Zehenkneifen gut vertraut ist. Beachten Sie die Atemfrequenz, um sicherzustellen, dass das Tier während der folgenden Schritte nicht unter Schmerzen steht.
    * Wir betonen keine In-Ear-Bar-Placements, weil:
    1. Wir haben das Gratloch vorgebohrt, um die Nadel zu positionieren, und daher sind präzise Schädelkoordinaten unnötig;
    2. Maus-Ohr-Kanäle sind zerbrechlich, und die präzise In-Ear-Platzierung von Ohrbügeln erfordert mehr involvierte Ausbildung, die für unseren Zweck nicht relevant ist. Die Gefahr der Beschädigung der murinen Gehörgänge überwiegt die Vorteile einer präzisen Platzierung.
    3. Cheek-Unterstützung ist viel einfacher zu erfüllen und in der Lage, das gleiche Maß an Maus Kopf Stabilität und Balance während der Positionierung zu erreichen. Es ist ein zusätzlicher Vorteil für mehrere zeitkritische Operationen zu gewährleistenRechtzeitige Fertigstellung mit guter Zelllebensfähigkeit.
12. Benutzen Sie die stereotaxischen Rahmenknöpfe, um die flache Spitze Mikrospritze auf das Gratloch zu positionieren, und dann langsam auf 3 mm unter die Duraoberfläche zu senken. Ziehen Sie 0,5 mm zurück, um die Spitze der Nadel bei 2,5 mm unterhalb der Dura zu halten.
13. Spritzen Sie 2,5 μl vorgespannte Gliomzellen über den Zeitraum von 1 min. Lassen Sie die Nadel ihre Position für weitere 1-2 min vor langsam, im Laufe von 1 min beibehalten, die Nadel aus dem Gehirn herausziehen und darauf achten, den Zellrückfluss zu minimieren. Tragen Sie steriles Knochenwachs ein, um extrakraniales Tumorwachstum zu vermeiden.
14. Die Wunde mit Wickelklammern aus rostfreiem Stahl (7 mm) abschließen. Setzen Sie eine subkutane (sc) Injektion von 1 ml steriler laktierter Ringer-Lösung (vorgewärmt auf 37 ° C) und legen Sie das Tier in eine Rückgewinnungskammer, die auf halbem Weg auf einem Heizkissen liegt.
15. Bringen Sie die Tiere an die belüftete Zahnstange zurück, sobald sie die Mobilität wiedererlangt haben, und folgen Sie der routinemäßigen Post-op Pflege, um den Smoot zu gewährleistenH Erholung.

4. In vivo Biolumineszenzbildgebung (BLI) des Tumorwachstums (Abbildung 1B ) ¹⁵

ANMERKUNG: Die vom Patienten abgeleiteten Gliomzellen werden modifiziert, um Glühwürmchen-Luciferase auszudrücken. Dies ermöglicht es uns, die Tumorprogression nach intrakranieller Implantation zu verfolgen.

1. Geben Sie den Tieren eine ip Injektion des D-Luciferins, Kaliumsalz (150 mg / kg) 10 min vor der Imaging-Session.
2. Sofort die Tiere in eine mit IACUC zugelassene sauerstoffhaltige Isofluran-Induktionskammer stellen.
3. Legen Sie die Tiere in die beheizte (37 ° C) Bildaufnahmekammer, um das BLI-Signal mit Hilfe von Software-Einstellungen zu erfassen (Details siehe Herstelleranweisung).

5. Vollständige Hirnbestrahlung (Abbildung 1C ) ^{2 , 4 , 13}

HINWEIS: Um die Migration von intranasal ausgelieferten hNSCs zu Hirntumoren zu erhöhen, kann die gesamte Hirnbestrahlung von Mäusen mit intrakranialen Tumor-Xenotransplantaten genutzt werden ⁴ .

1. Verwenden Sie eine ip-Injektion eines Ketamin- und Xylazin-Gemisches (50-100 mg / kg bzw. 5-10 mg / kg, konsultieren Sie den institutionellen IACUC für den genehmigten Dosisbereich) mit der subchirurgischen Anästhesie-Ebene, um die Anästhesie für Mäuse mäßig zu induzieren.
2. Verwenden Sie eine Probenschale, um die Mäuse innerhalb der Kammer zwischen den Blei-Abschirmblöcken zu positionieren, so dass nur die Strahlenbelastung ausgesetzt werden kann (Abbildung 2 ).
3. Geben Sie Mäusen mit positiver BLI-Bestätigung des Tumorwachstums (normalerweise am Tag 7-8 nach Gliomzellenimplantation) eine tägliche Dosis von 2 Gy der Bestrahlung an 5 aufeinanderfolgenden Tagen. Führen Sie die BLI-Beurteilung des Tumors nach der letzten Bestrahlungsdosis durch.

6. Genetische Veränderung der menschlichen Neuronalen Stammzellen (NSCs;E 3A) ⁴

1. Halten Sie menschliche NSCs (Klon HB1.F3.CD) ^{6 , 7} in DMEM-Medium mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin in einem befeuchteten 37 ° C-Inkubator unter 95% Raumluft und 5% CO ₂ ( ^N NSCs).
2. Führen Sie die genetische Überexpression von chemotaxischen Rezeptoren wie dem CXC-Motiv-Chemokinrezeptor 4 (CXCR4) in hNSCs durch Transduktion mit Lentivirus aus, das für humanes CXCR4 kodiert.
   1. Wenn NSCs nahezu 75-80% Konfluenz sind, fügen Sie das CXCR4 Lentivirus dem Kulturmedium zusammen mit Polybren (8 μg / ml) hinzu und inkubieren für 8 h oder über Nacht.
   2. Ersetzen Sie das virushaltige Medium durch frisches Medium, das Blasticidin enthält, mit 4 μg / ml für die positive Selektion von transduzierten Zellen.
   3. Validieren Sie den Grad der CXCR4-Expression in modifizierten hNSCs ( ^CXCR4 NSCs) über Durchflusszytometrie unter Verwendung von Anti-CXCR4-Antikörper und passendem Isotyp-Antikörper und viEine quantitative RT-PCR unter Verwendung eines Paares von Primern, die CXCR4- und Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) cDNAs ⁴ verstärken.
   4. Generierung von Vektor-Kontroll-NSCs ( ^VC- NSCs) unter Verwendung derselben Strategie, wobei RFP das CXCR4-Gen ersetzt und durch Mikroskopie oder Durchflusszytometrie aufgrund der Anwesenheit von RFP-Fluoreszenz verifiziert wird.

7. Hypoxische Vorkonditionierung von menschlichen NSCs (Abbildung 3A ) ⁴

1. Plattenkultivierte NSCs in T75-Kulturkolben, wie oben beschrieben, bis 90% Konfluenz erreicht ist.
2. Legen Sie Zellkulturkolben in einen befeuchteten CO ₂ -Kammer / Inkubator mit gehaltenen 1% O ₂ -Stufen für 24 h, über N ₂ -Gasversorgung, die durch einen automatisierten eingebauten Durchflussmesser gesteuert wird. Diese Zellen werden als ^H- NSCs bezeichnet. Kontrolle ^N NSCs werden in Schritt 7.1 beschrieben.

8. Laden von HuMann-NSCs mit onkolytischem Virus (Abbildung 3B- 3H ) ⁵

1. 8.1Infekt ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs und ^CXCR4 NSCs mit 50 bedingten replikativen Adenovirus (CRAd) -S-pk7 Viruspartikel / Zelle ^{4 , 16} .
2. 8.2.Nach 2 h Inkubation bei Raumtemperatur mit periodischem Gewindeschneiden, waschen Sie die Zellen dreimal mit dem Medium, um ungebundene Viruspartikel zu entfernen und Zellen in steriler Kochsalzlösung zur Injektion zu suspendieren.
   VORSICHT: Führen Sie alle Virus- in-vitro -Zellkultur-Verfahren in Einrichtungen mit der entsprechenden Biosicherheit Ebene Bezeichnung, wie BSL2. Eine angemessene persönliche Schutzausrüstung muss von Forschern getragen werden, die das onkolytische Virus nach den Richtlinien der institutionellen Tierhaltung behandeln ^{4 , 16} .

9. Laden von Stammzellen mit MikroN-size paramagnetische Eisenoxide (MPIOs) für In-vivo- Tracking mittels Magnetresonanztomographie (MRT, Abbildung 3B -3H ) ²

1. Um Stammzellen zu markieren, fügen Sie MPIOs zu Stammzellkulturen bei ~ 80% Konfluenz, in Gegenwart von Transfektionsreagenz für die Inkubation über Nacht hinzu. Die Effizienz der Stammzellmarkierung (NSCs ⁴ oder MSCs ² ) mit MPIOs (flash red konjugiert) wird durch Durchflusszytometrie bestimmt.
2. Um die Stammzellmigration und -verteilung im Gehirn von Gliom-tragenden Tieren zu visualisieren, erwerben Sie sowohl eine hochauflösende T2-gewichtete Rapid Acquisition mit Relaxation Enhancement Spin Echo-Bildern als auch Multi-Slice T1 gewichtete Fast Low Angle Shot (FLASH) Gradient-Echo-Sequenzen Auswertung der Struktur über koronale und axiale Ebenen des Maushirns ² .

10. Intranasale Abgabe therapeutischer NSCs ( Abbildungen 1D und Abbildung 3D ) ^{2 , 4}

1. Kultur und sammeln NSCs ( ^N NSCs, ^H NSCs, ^VC NSCs und ^CXCR4 NSCs) nach dem in Abschnitt 3 beschriebenen Protokoll.
   ACHTUNG: Alle Tierversuche mit OV-beladenen NSCs müssen in Einrichtungen mit entsprechender Biosicherheitsstufe wie BL2 oder BSL2 durchgeführt werden.
2. Anästhesieren von Mäusen über ip Injektion einer Ketamin- und Xylazinmischung gemäß Schritt 3.6.
3. Legen Sie Mäuse auf eine saubere Abdeckung nach oben mit einem Heizkissen unterhalb, um Körpertemperatur zu erhalten. Passen Sie ein gepolstertes Kissen aus aufgerollten Papiertüchern mit Bändern, um den aufrechten Winkel der Nasenlöcher zu gewährleisten, wenn sie unter dem Kopf der Maus platziert werden.
   HINWEIS: Hyaluronidase-Vorbehandlung (insgesamt 100 U als vier wiederholte Impfungen in 5-minütigen Intervallen, 3 μl in jedem Nasenloch) der nasalen ePithel wurde zuvor beschrieben ^{2 , 17} .
4. Mit einer Mikropipette 2 μl NSC-Suspension auf jedes Nasenloch der Maus abgeben. Visuell bestätigen Sie die Aspiration des Tröpfchens vor dem Umzug auf die nächste Maus. Die Gesamtzahl der gelieferten Zellen kann vom Benutzer bestimmt werden; Verwenden 62.500-125.000 Zellen / μL, so dass 0,5-1 Millionen Zellen in 4 x 2 μl Dosen geliefert werden können.
5. Verwenden Sie einen Timer, um 5 Minuten Intervalle zwischen jeder Zelle Suspension Verwaltung, bis zu 4 mal zu gewährleisten.
6. Erlauben Sie den Tieren, die Beweglichkeit in einer Erholungskammer wiederherzustellen, wobei die Rückenlage ganz durchgehalten wird.

11. Überlebensanalyse ( Abbildung 3E )

1. Geben Sie die Überlebensdauer von Tieren in statistischer Software ein und führen Sie statistische Vergleiche mit dem Log-Rank-Test mit den folgenden Bedeutungsbezeichnungen durch: * p < 0,05, ** p <0.01, *** p <0,001.

12. Tissue Collection und Histologie / Immunzytochemie Verifikation der intranasalen Stammzell Gehirn Eintrag ^{2 , 4}

1. Am Ende der Studie, Euthanisieren Mäuse über die IACUC-genehmigten Protokolle. Eine übliche Praxis ist die Verwendung einer strömungsratengesteuerten CO ₂ -Kammer, um die Tiere als primäre Euthanasie-Strategie zu opfern, gefolgt von einer Exsanguination durch Perfusionsfixierung.
2. Unmittelbar nachdem sie geopfert worden sind, führen Sie eine intrakardiale Perfusion mit PBS auf dem Tier durch, um die Beseitigung von Blutresten aus Blutgefäßen und die Konservierung von Geweben für die anschließende histologische Analyse sicherzustellen.
3. Legen Sie das CO ₂ -euthanisierte Tier auf ein Absorptionskissen in der Rückenlage, fahren Sie mit einer Laparotomie fort, um den Zwerchfellmuskel, der zusammen mit dem Brustkorb zerlegt wird, auszusetzen, um das Herz auszusetzen.
4. Nach maKönig ein Nick auf dem rechten Vorhof mit einem Paar Dissektion Schere, beschleunigen die Exsanguination mit einem 3-5 ml PBS Injektion über den linken Ventrikel an der Spitze. Spritzen Sie eiskaltes 4% Paraformaldehyd (PFA) in die Zirkulation mit einer Spritze; Periphere Muskelkrämpfe sorgen für eine visuelle Bestätigung, dass es keine größere Blockade im Kreislauf gibt, die eine korrekte Gewebefixierung verhindern würde.
5. Chirurgisch den Kopf der Karkasse entfernen und in einem 50 ml Zentrifugenröhrchen in 4% PFA bei 4 ° C über Nacht aufbewahren. Ändern Sie die Lösung auf 30% Saccharose am nächsten Tag vor Hirngewebe Dissektion weitere 24 Stunden später.
6. Eingebettet das Hirngewebe in OCT-Verbindung und Blitz einfrieren auf Isopentan auf Trockeneis. Führen Sie die Kryosektion des resultierenden Gewebeblocks aus, um 10-20 μm Gewebeabschnitte für Histologie- und Immunzytochemieanwendungen zu erzeugen.

Ergebnisse

Sowohl die hypoxische Vorbehandlung ( 4A ) ⁴ als auch die CXCR4-Überexpression ( 4B und 4C ) ⁴ signifikant hochregulieren die Zelle Membran Präsenz von CXCR4-Rezeptoren, wie durch Durchflusszytometrie gezeigt. Der Tumor-Tropismus, der von NSCs (blaue Pfeile) gezeigt wird, wird in der Tumorgewebe-Histologie (roter Kreis) gezeigt. Die Anwesenheit von MPIO-markierten (

Diskussion

Obwohl der intranasale Weg der Arzneimittelabgabe für kleine Moleküle, Nanomedizin und Proteinverbindungen gleichermaßen ¹⁸ weitgehend untersucht wurde, ist die Anwendung von therapeutischen Stammzellen für das intranasale Hirntumor-Targeting im Spektrum der Hirntumor-Therapeutika unter Entwicklung ^{2 , 3 , 4} Es gibt intrinsische Komplexitäten, die sich auf das Verhalten der Stammzellen in der Nasenh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Stereotaxic frame	Kopf Instruments	Model 900
Hypoxic Cell Culture Incubator	ThermoFisher Scientific	VIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)	ThermoFisher Scientific	Varies	Replaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated Microcentrifuge	ThermoFisher Scientific	75002490	Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R	ThermoFisher Scientific	75004240	Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)	Hamilton Company	80400	Flat tip
Sample Tray for Irradiator	Best Theratronics	A13826	To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 Microscope	Leica Microsystem		Custom setup
Leica CM1860 UV cryostat	Leica Microsystem		Custom setup
Exel International Insulin Syringe	ThermoFisher Scientific	14-841-31
Corning Phosphate Buffer Saline	Corning Cellgro/ThermoFisher	21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Corning Cellgro/ThermoFisher	11965-084
Trypsin 0.05%	Corning Cellgro/ThermoFisher	25300054
Hyaluronidase from bovine testes	MilliporeSigma	H3506