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要約

幹細胞は、その固有の腫瘍指向性のために脳腫瘍を治療するための有望な治療キャリアである。非侵襲性の鼻腔内幹細胞送達は、血液脳関門を迂回し、臨床翻訳の可能性を示す。この記事では、神経膠腫のマウスモデルにおける鼻腔内幹細胞送達の基本原理を要約する。

要約

脳悪性腫瘍に対する固有指向性は、幹細胞を悪性腫瘍に対する治療薬の有望なキャリアーとする。鼻腔内経路による治療用幹細胞の送達は、頭蓋内移植または全身経路による送達と比較して非侵襲性のために、臨床翻訳の可能性が高い、最近発見された代替戦略である。血液脳関門の欠如は、鼻腔内の脳への侵入を受ける幹細胞の治療可能性をさらに強化する。本稿では、本研究で用いた必須技術を要約し、頭蓋内神経膠腫異種移植片のマウスモデルを用いた幹細胞送達のための鼻腔内戦略の基本原理を概説する。特定の所定の実験パラメータを用いて一貫した再現性のある結果を生み出す最適化された手順を実証し、効率的な実行と信頼できる経験を保証する合理化されたワークフローのガイドラインを提供しますntal結果。この記事は、仮説、幹細胞の種類、または腫瘍の詳細に基づいて、さらなる実験的カスタマイズのベースラインとして機能するように設計されています。

概要

ヒト幹細胞の低毒性、低免疫原性、および内因性脳腫瘍指向性は、治療用ビヒクルの送達にとって魅力的な特性である1 。近年開発された有望な技術革新であり、この治療戦略の鼻腔内適応は、非侵襲的かつ反復投与が患者の適用の障壁を劇的に減少させる可能性があるため、臨床翻訳への飛躍を意味する。浸潤外科手術1,2,3,4に関連する全身麻酔または長時間の入院治療を行わずに外来患者サービスに適応可能である。

我々および他者は、幹細胞送達の脳腫瘍への鼻腔内経路を開拓し、いくつかの基本原則マウス異種移植モデル2、3、4を使用して翻訳研究を行い、MRI(magnetic resonance imaging)試薬キャリア2を介してin vivoで幹細胞の移動を調べた2 。これらのパイロット調査を通じて、我々は確立された患者由来異種移植片(PDX)の悪性神経膠腫モデルを使用して、堅牢な前臨床評価戦略を最もよく構築する方法について、豊富な経験と蓄積された洞察を得た。鼻腔に送達された治療用幹細胞の鼻腔内の脳内進入の精巧な生物学的現象の機構的詳細を微妙に説明しています。ここでは、十分に確立されたヒト神経幹細胞株HB1.F3.CD 5を用いた実験的研究の現状を実証するための標準化された操作プロトコールの原理を説明する。 6,7,8であり 治療用担体としてのヒト幹細胞を用いた特定の腫瘍モデルまたは戦略に適合するように容易に変更可能である。

プロトコル

すべての動物の手続きは、施設内動物管理および使用委員会(IACUC)または同等の機関によって承認されなければならない。ここに記載されている特定の手順に関する不確実性がある場合は、進まないでください。施設のIACUCおよび指定の獣医スタッフと明確にする。

1.培養細胞の無菌性を確保し、無菌技術の原理に従う

  1. マウスに投与する前に、細胞検査および病原体のない状態確認のためのすべての細胞培養手順およびIACUC要件における標準的な実験室の実践に従う。
  2. 再現性のある結果を得るためには、NIHの細胞認証要件を遵守してください。
  3. この原稿4で概説されている、確立された小動物手術の無菌技術に従ってください。

2.神経膠腫細胞の調製インビボ実験2、4

  1. ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)中の10%ウシ胎仔血清)または無血清培地(B27、N2、ヘパリン、表皮増殖因子(BEP)、補体を含むNeurobasal培地中の培養グリオーマ細胞(GBM43、GBM6およびU87MG) EGF]、塩基性線維芽細胞増殖因子[bFGF]、抗生物質、およびL-グルタミン12 )を、加湿CO 2細胞培養インキュベーター中でインキュベートする。
    1. 市販のサービスプロバイダーからのマウスクリアパネルですべての細胞株を試験します。
  2. 培地を除去して付着細胞を回収する。 0.05%トリプシンを用いて室温で5分間インキュベートする(T25フラスコの場合はトリプシン1mL、T75フラスコの場合は2mL、表面積の大きい培養フラスコの場合はそれに合わせてスケールする)、Ca 2+およびMg 2+遊離リン酸塩(PBS)で洗浄した。
    1. をタップ細胞を除去し、直ちに過剰の血清含有培地(8〜9mL)で中和する。次いで、血清学的ピペットを用いて、細胞懸濁液を遠心管に吸引する。
    2. 細胞懸濁液を400xgで5分間遠心分離する。反復遠心分離により10mLのPBSで少なくとも2回細胞を洗浄する。
    3. 遠心分離(上記と同じ速度および持続時間)によって無血清培地中で腫瘍球として増殖した神経膠腫細胞を収集する。遠心分離(400×g×5分)により10mLのPBSで2回洗浄する前に、37℃で5分間1〜2mLの細胞剥離溶液中でインキュベートすることによって細胞ペレットを解離させる。
    4. 2.5μLあたり50,000〜200,000細胞の濃度で滅菌生理食塩水中の神経膠腫を再懸濁する。マウス脳への注射に用いられる細胞数は、各神経膠腫細胞株の確立された増殖速度に依存する。ここでは、それぞれGBM43およびGBM6患者由来の腫瘍細胞に25,000および100,000を使用する。
    5. ネイスの量を2倍にする処置中の画分の消失を説明する移植のためのssary細胞数。注入可能な細胞懸濁液を滅菌マイクロ遠心チューブに移し、チューブを氷上に置きます。外科手術中に細胞を氷上に最大2時間維持し、拡張手術を計画している場合は新しいバッチを準備する。

Xenograftマウスモデル( 図1A )を作成するための頭蓋内移植2、4、13

  1. 手術日の前に、オートクレーブ内のすべての外科用具を滅菌し、IACUC承認プロトコールに従って全ての手術前および術後動物ケア材料を調製する。定位固定フレームと周辺機器を滅菌して術中の無菌状態を確実にし、合併症を最小限に抑えます。
  2. 汚れや汚染の可能性を最小限に抑えるように作業エリアを整理してください。
  3. 適切な個人用保護具を着用するIACUCの要求事項に従ったPPEを実施する。
  4. 適切な術後回復室を設定する。期限切れでない試薬を使用して、麻酔薬および鎮痛薬が新しく調製されていることを確認します。 IACUC承認プロトコールに従って適切な体温維持器具を設定する。
  5. ヒトNSCの鼻腔内送達の試験のためのヒト患者由来グリオーマ細胞異種移植片を確立するために、約6週齢で任意の性別のnu / nu胸腺欠損マウスのような免疫無防備化マウス種を使用する。
  6. 認可された試薬を使用して、 すなわちケタミン(50-100mg / kg;認可された用量範囲について機関IACUCに相談する)およびキシラジン(5-10mg / kg)の混合物の腹腔内kg);200-250μLの滅菌生理食塩水中で、または吸入デバイスを用いた4〜5%イソフルラン麻酔により、認可された用量範囲について機関IACUCに相談する。
    1. 動物が手術麻酔平面に到達したことを確認するb皮膚の切開に先立ってつま先をつまむ。動物の角膜の湿った状態を確保するために、十分な無菌眼科用ゲルを塗布する。
  7. Pritchett-Corning らによると、ベタインとイソプロピルアルコールの繰り返し交互の円形拭き取り材を使用して頭蓋骨を滅菌する 14
  8. 外科用ブレードを使用して切開する前に、Buprenex(0.05〜2mg / kg)の皮下注射によって前切開鎮痛を行う。
  9. 頭蓋骨を露出させながら止血を助けるために殺菌された綿棒アプリケータを使用する。偶発的な出血のクリアランスを容易にするために3%過酸化水素を使用してください。
  10. バッテリ駆動のハンドヘルド電球式ドリル(幅1mm以下)を使用して、左右2mm、左右どちらか、正中線、ブレグマの2mm後にバリ穴を作成します(位置座標は、特定の研究のために意図された腫瘍モデルについて)。
  11. stereotaxicフレームに適切に動物をマウントする挿入されたハミルトンマイクロシリンジが頭蓋骨の表面に垂直に穿頭孔のまわりに垂直になるようにする。動物の麻酔機がつま先をつまんで立っていることを確認してください。呼吸数を観察して、次の手順で動物が痛みのストレスを受けていないことを確認します。
    *インイヤーバーのプレースメントは強調しません。理由は次のとおりです。
    1. 私たちは、針の位置を決めるために穿頭穴にあらかじめ穿孔しているので、正確な頭蓋の座標は不要です。
    2. マウスの耳道は壊れやすく、イヤーバーの正確な耳内配置には、私たちの目的に関係のない、より複雑な訓練が必要です。マウスの外耳道への損傷の危険性は、正確な配置の利点を上回ります。
    3. 頬サポートは、実行するのがはるかに簡単で、マウスヘッドの安定性とポジショニング時のバランスを同じレベルで達成することができます。複数の時間に敏感な外科手術のための追加の利点です。適切な細胞生存率でタイムリーな完了。
  12. 定位フレームのつまみを使用して、平らな先端のマイクロシリンジを穿頭孔に配置し、硬膜表面の3mm下までゆっくりと下げます。硬膜下2.5mmに針の先端を維持するために0.5mm後退させる。
  13. 1分間に2.5μLのプレロードされた神経膠腫細胞を注入する。針をさらに1〜2分間その位置を維持し、1分かけてゆっくりと針を脳から引き出し、細胞の逆流を最小限に抑えるように注意してください。頭蓋外腫瘍の増殖を防ぐために滅菌骨のワックスを塗布する。
  14. ステンレススチール製のクリップ(7 mm)を使用して傷口を閉めます。 1mLの滅菌乳酸リンゲル液(37℃まで予熱)の皮下(sc)注射を行い、動物を加熱パッドの途中にある回収チャンバに入れる。
  15. モビリティを取り戻したら、換気ラックに戻し、スムージングを確保するために定期的な術後ケアを行いますh回復。

4.腫瘍増殖のインビボ生体発光イメージング(BLI)( 図1B15

注:患者由来の神経膠腫細胞はホタルルシフェラーゼを発現するように改変されています。これにより、頭蓋内植込み後に腫瘍の進行を追跡することが可能になる。

  1. 動物にイメージングセッションの10分前にD-ルシフェリン、カリウム塩(150mg / kg)を腹腔内注射する。
  2. 直ちに、動物をIACUCによって承認された酸素化イソフルラン誘導チャンバーに入れる。
  3. 加熱した(37℃)イメージングチャンバー内に動物を置き、ソフトウェア設定を使用してBLIシグナルを捕捉します(詳細については、製造元の指示を参照)。

5.全脳照射( 図1C )2,4,13

注:鼻腔内送達されたhNSCの脳腫瘍への移動を促進するために、頭蓋内腫瘍異種移植片を有するマウスの全脳照射を利用することができる4

  1. マウスの麻酔を適度に誘導するために、ケタミンとキシラジンの混合物(それぞれ50-100 mg / kgおよび5-10 mg / kg;承認用量範囲については施設のIACUCに相談する)を腹腔内麻酔機で腹腔内注射する。
  2. サンプルトレイを利用して、放射線遮蔽ブロックの間にチャンバー内のマウスを配置し、放射線のみの照射を可能にします( 図2 )。
  3. マウスに、5日間連続して2Gy照射の1日用量の腫瘍増殖(通常、神経膠腫細胞移植後7〜8日目)のBLI確認を与える。最後の照射線量後の腫瘍のBLI評価を行う。

ヒト神経幹細胞の遺伝子改変(NSC; Figure 3A) 4

  1. 95%の室内空気と5%CO 2N NSCs)の加湿37℃インキュベーター内で10%FBSおよび1%ペニシリン - ストレプトマイシンを含むDMEM培地中でヒトNSC(クローンHB1.F3.CD) 6,7を維持する。
  2. ヒトCXCR4をコードするレンチウィルスによる形質導入により、hNSCにおいてCXCモチーフケモカインレセプター4(CXCR4)のような走化性レセプターの遺伝的過剰発現を行う。
    1. NSCが75〜80%コンフルエントに近い場合、ポリブレン(8μg/ mL)と共にCXCR4レンチウイルスを培養培地に添加し、8時間または一晩インキュベートする。
    2. ウイルス含有培地を、形質導入細胞の陽性選択のために4μg/ mLのブラストサイジンを含有する新鮮培地に交換する。
    3. 抗CXCR4抗体および一致するアイソタイプ抗体およびviを用いたフローサイトメトリーによる改変hNSC( CXCR4 NSC)におけるCXCR4発現のレベルを確認する。CXCR4およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)cDNAsを増幅する一対のプライマーを用いた定量的RT-PCR 4
    4. 同じ戦略を使用して、RFPをCXCR4遺伝子に置き換えてベクターコントロールNSC( VC NSC)を作製し、RFP蛍光の存在に起因する顕微鏡法またはフローサイトメトリーによる検証。

7.ヒトNSCの低酸素プレコンディショニング( 図3A4

  1. 90%のコンフルエントに達するまで上記のようにT75培養フラスコ中で培養したNSCをプレートした。
  2. セルフ培養フラスコを、1%O 2レベルを維持した加湿CO 2チャンバー/インキュベーターの中に、自動組み込み流量計によって制御されるN 2ガス供給を介して 24時間置く。これらの細胞はH NSCと呼ばれる。コントロールN NSCは、ステップ7.1に記載されている。

8.胡の読み込み腫瘍崩壊性ウイルスを有するヒトNSC( 3B〜3H) 5

  1. 8.1条件付き複製アデノウイルス(CRAd)-S-pk7ウイルス粒子/細胞を有するNSC、 H NSC、 VC NSCおよびCXCR4 NSCは完全にNである4,16。
  2. 8.2。定期的に叩いて室温で2時間インキュベートした後、細胞を培地で3回洗浄して結合していないウイルス粒子を除去し、注射用の滅菌生理食塩水中に細胞を懸濁させる。
    注意:適切なバイオセーフティレベル指定(BSL2など)の施設でウイルス関連のin vitro細胞培養手順をすべて実行してください。適切な個人用保護具は、施設内動物施設のガイドライン4、16に従って腫瘍壊死性ウイルスを扱う研究者が着用しなければならない。

9.マイクロと幹細胞のロード磁気共鳴イメージング(MRI; 図3B- 3H2を介したインビボ追跡のためのnサイズの常磁性酸化鉄(MPIO) 2

  1. 幹細胞を標識するために、一晩のインキュベーションのためのトランスフェクション試薬の存在下で〜80%コンフルエンシーで幹細胞培養物にMPIOを加える。 MPIO(フラッシュレッドコンジュゲート)を用いた幹細胞標識(NSC 4またはMSC 2 )の効率は、フローサイトメトリーによって決定される。
  2. 神経膠腫保有動物の脳における幹細胞の移動および分布を視覚化するために、マルチスライス高分解能T2加重ラピッドアクイジションリラクゼーションエンハンススピンエコー画像およびマルチスライスT1加重高速低角度ショット(FLASH)勾配エコーシーケンスの両方を取得する。マウスの脳の冠状面と軸面の両方を介して構造を評価する2

10.治療用NSCの鼻腔内送達( 図1Dおよび図3D2,4

  1. 培養し、セクション3に記載のプロトコールに従ってNSC( N NSC、 H NSC、 VC NSC、およびCXCR4 NSC)を収集する。
    注意:OV搭載NSCを含むすべての動物手続きは、BL2またはBSL2施設などの適切なバイオセーフティレベル指定の施設で実施する必要があります。
  2. ステップ3.6に従って、ケタミンおよびキシラジン混合物の腹腔内注射によってマウスを麻酔する。
  3. 体温を維持するために、下のヒーターパッドで上を向いているきれいなドレープの上にマウスを置きます。マウスの頭の下に置いたときに鼻孔が直立するように、テープで巻いたペーパータオルで作られたパッド入りの枕を調整します。
    注:ヒアルロニダーゼ前処置(5分間間隔で4回の反復接種として合計100U、各鼻孔に3μL)の鼻内投与ピューリュリウムは以前に2,17。
  4. マイクロピペットを用いて、2μLのNSC懸濁液をマウスの各鼻孔に分配する。次のマウスに移動する前に、液滴の吸引を目視で確認します。配信される細胞の総数は、ユーザによって決定され得る。 4〜2μLの用量で0.5〜100万個の細胞を送達できるように、62,500〜125,000細胞/μLを使用する。
  5. タイマを使用して、各細胞懸濁液投与の間に5分間隔、最大4回を確保する。
  6. リバウンドチャンバー内での動物の移動性を回復させ、仰臥位を維持する。

11.生存分析( 図3E

  1. 統計的ソフトウェアにおける動物の生存期間データを入力し、以下の有意性表記を用いてログランク検定を用いて統計的比較を行う:* p < 0.05、** p <0.01、*** p <0.001。

組織採取および組織学/免疫細胞化学的検査鼻腔内幹細胞脳侵入の確認2,4

  1. 研究の最終段階で、IACUC承認プロトコールによりマウス安楽死させる。標準的な方法は、流量制御CO 2チャンバーを使用して動物を屠殺し、一次安楽死戦略として灌流固定による散逸を行うことである。
  2. 犠牲にされた直後に、動物のPBSで心臓内灌流を行い、血管からの血液残留物の除去およびその後の組織学的分析のための組織の保存を保証する。
  3. CO 2 -安楽死させた動物を仰臥位の吸収パッドの上に置き、開腹術を行い、胸郭を切開して横隔膜筋肉を露出させ、心臓を露出させる。
  4. ママの後右のアトリウムのニックネームを解剖用ハサミを使用して、頂点の左心室を介して3〜5mLのPBS注入で散逸を加速させる。シリンジを用いて氷冷した4%パラホルムアルデヒド(PFA)を循環中に注入する;末梢筋攣縮は、適切な組織固定を妨げる主要な閉塞が循環にないことを視覚的に確認する。
  5. 外科的に屠体の頭部を取り出し、4℃で一晩4%PFA中の50mLの遠心チューブに保存する。別の24時間後に脳組織の解剖の前に翌日に溶液を30%スクロースに変更する。
  6. OCT化合物に脳組織を埋め込み、ドライアイス上でイソペンタンで瞬間凍結する。得られた組織ブロックの凍結切片作製を行い、組織学および免疫細胞化学の用途のために10〜20μmの組織切片を作製する。

結果

低酸素前処理( 図4A4およびCXCR4過剰発現( 図4Bおよび4C4の両方が、フローサイトメトリーによって実証されるように、CXCR4受容体の細胞膜存在を有意にアップレギュレートする。 NSCによって示される腫瘍指向性(青色の矢印)は、腫瘍組織組織学(赤丸)に示されている。腫?...

ディスカッション

小分子、ナノメディシン、およびタンパク質化合物については、薬物送達の鼻腔内経路が広く検討されているが、鼻腔内の脳腫瘍標的化のための治療用幹細胞の適用は、開発中の脳腫瘍治療のスペクトル4 。鼻腔内での幹細胞の挙動に関する内在的な複雑さがあり、分子の詳細は依然として不明なままである。幹細胞の大きさおよび脳神経に沿った分布機構は、非細胞生物?...

開示事項

著者は宣言する利害の衝突はありません。

謝辞

この研究は、NIH R01NS087990(MSL、IVB)によって支持された。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Stereotaxic frameKopf InstrumentsModel 900
Hypoxic Cell Culture IncubatorThermoFisher ScientificVIOS 160i
Cell culture supplies (Plastics)ThermoFisher ScientificVariesReplaceable with any source
Legend Micro 21R Refrigerated MicrocentrifugeThermoFisher Scientific75002490Replaceable with any source
Bench centrifuge Sorvall ST16R ThermoFisher Scientific75004240Replaceable with any source
Micro syringe 702N 25 µl (22S/2"/2)Hamilton Company80400Flat tip
Sample Tray for IrradiatorBest TheratronicsA13826To set up mice protection with lead shield
Leica DMi8 MicroscopeLeica MicrosystemCustom setup
Leica CM1860 UV cryostatLeica MicrosystemCustom setup
Exel International Insulin SyringeThermoFisher Scientific14-841-31
Corning Phosphate Buffer SalineCorning Cellgro/ThermoFisher21-031-CV
Dulbecco's Modified Eagle Medium Corning Cellgro/ThermoFisher11965-084
Trypsin 0.05%Corning Cellgro/ThermoFisher25300054
Hyaluronidase from bovine testesMilliporeSigmaH3506

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