Modelo de la rata de la Asociación de partición hepática y ligadura de la vena porta para procedimiento efectuado hepatectomía (ALPPS)

Resumen

Inducir la hipertrofia hepática rápida utilizando partición de hígado asociar y ligadura de la vena porta para una hepatectomía Staged (ALPPS) se ha propuesto para la resección de tumores del hígado resecables borderline. Este modelo puede aclarar los mecanismos implicados en la hipertrofia rápida y permite realizar pruebas de drogas que promueven o bloquean la aceleración de la regeneración.

Resumen

Datos clínicos recientes apoyan un enfoque quirúrgico agresivo para tumores primarios y metastásicos del hígado. Para algunas indicaciones, como las metástasis hepáticas colorrectales, la cantidad de tejido hepático queda después de resección hepática se ha convertido en el principal factor limitante de la extirpación de grandes o múltiples tumores en el hígado. Una cantidad mínima de tejido funcional es necesaria para evitar la complicación severa de la post-hepatectomía insuficiencia hepática, que tiene alta morbilidad y mortalidad. Inducir crecimiento hepático del remanente anticipado antes de la resección ha establecido más en Cirugía hepática, ya sea en forma de embolización de vena porta por radiólogos intervencionistas o en la forma de la ligadura de la vena porta varias semanas antes de la resección. Recientemente, fue demostrado que la regeneración hepática es más amplia y rápida, cuando la transección del parénquima se agrega a la ligadura de la vena porta en una primera etapa y luego, después de sólo una semana de esperar, la resección en una segunda etapa (asociar la partición de hígado y la ligadura de la vena porta para hepatectomy Staged = ALPPS). ALPPS ha convertido rápidamente en popular en todo el mundo, pero ha sido criticado por su mortalidad perioperatoria alta. El mecanismo de crecimiento acelerado y extensa inducido por este procedimiento no se ha entendido bien. Se han desarrollado modelos animales para explorar los mecanismos fisiológicos y moleculares de la regeneración hepática acelerada en ALPPS. Este protocolo presenta un modelo de rata que permite exploración mecanicista de regeneración acelerada.

Introducción

El tamaño del remanente hepático limita la resecabilidad de los tumores hepáticos. ¹ en general, cuando menos de 25% hígado tejido queda atrás, el paciente está en mayor riesgo de muerte por insuficiencia hepática aguda debido a la falta de función metabólica para todo el organismo ("demasiado pequeño para el síndrome de tamaño"). ² este post-hepatectomía insuficiencia hepática es la complicación más devastadora después de resección hepática. Por lo tanto, los médicos han tratado de inducir la regeneración hepática antes de la resección del hígado manipulando el flujo de la vena porta. ³ se encontró que, una vez que se ocluye la vena porta, la parte restante con vena porta flujo empieza a crecer a un ritmo lento y así puede aumentar hasta un 60% de tamaño. ^{4 5} de la ligadura quirúrgica o intervencionista de la vena porta obstrucción tanto clínicamente establecidos. ⁴ el aumento de volumen y la función del hígado es confiable, pero la tasa de crecimiento del hígado después de la obstrucción portal es sólo aproximadamente una quinta parte en comparación con el crecimiento del hígado remanente después de hepatectomy parcial. ⁶

El tiempo necesario para que el hígado crecer es semanas o meses aunque el hígado se puede regenerar a un ritmo mucho más rápido después de la resección. Así, el hígado es el único órgano que crece hacia la función normal después del retiro de una parte de ella. ⁷ un novedoso procedimiento de inducir la regeneración hepática a un ritmo similar como después de hepactectomy parcial fue desarrollada por un grupo de cirujanos que descubrió que agregando una sección transversal entre la oclusión e induce a la parte no-ocluida del hígado hígado hipertrofia en la misma tasa de crecimiento como después de la resección hepática, pero antes de la resección. ⁹ el procedimiento inicia hipertrofia rápida del 80% dentro de un remanente de la semana en el futuro hígado, que permite la resección de tumores extensos, principalmente no resecables, hígados dentro de una semana. El procedimiento se llama "asociado partición del hígado y vena porta ligadura de hepatectomía Staged = ALPPS" y llegó a ser rápidamente popular en todo el mundo. ¹⁰ informes múltiples apoyaron un aumento de la resecabilidad de los tumores hepáticos resecables fronterizo alcanzada por la nueva técnica,¹¹ mientras que el complejo procedimiento quirúrgico también fue criticado por su tasa de complicación alta. ^{12 , 13}

El desarrollo de un roedor y también modelos animales grandes de hipertrofia lenta y rápida se ha intentado desde la publicación de ALPPS en 2012 para permitir una mejor caracterización histológica y la comprensión de los mecanismos y para probar los efectos de drogas en la tasas de crecimiento diferentes de tejido del hígado en animales. El primer modelo animal desarrollado fue un modelo de rata. En este modelo, hipertrofia rápida después de la transección del parénquima entre el derecho y la parte izquierda del lóbulo mediano acelerada regeneración del lóbulo mediano derecho. ¹⁴ un modelo diferente fue introducido más adelante en el ratón. En este modelo fue resecado el lóbulo lateral izquierdo y ataron a las ramas de la vena porta a cada lóbulo del hígado excepto el lóbulo medio izquierdo. ¹⁵ mientras tanto, los modelos animales grandes de ALPPS en cerdos se han descrito así. ¹⁶

Para el estudio de mecanismos fisiológicos como cambios de flujo y presión en la vena porta, la perfusión y oxigenación del tejido del hígado, el modelo de la rata es superior al modelo de ALPPS en ratones. Otra ventaja de la rata en el modelo murino es que en el modelo de la rata no es necesidad de una resección del lóbulo lateral izquierdo,¹⁵ que podrían contaminar los efectos de la resección del hígado con los de ALPPS. En cambio el modelo de la rata no reduce el hígado masa celular. Un modelo de cerdo utiliza el lóbulo posterior derecho que el lóbulo creciente, pero el hígado de cerdo es muy lobulado. Por lo tanto, es difícil crear un plano de corte transversal en el puente de tejido ya delgado entre la parte posterior derecha y el lóbulo anterior derecho. En cambio, el lóbulo mediano en ratas constan de dos partes que se suministran por separado por una vena porta cada y un plano de transección del parénquima puede crearse fácilmente entre los dos mediante técnicas microquirúrgicas. La disponibilidad de tomografía (CT) de la computadora pequeña de animal o imán resonancia (MRI) permite la cuantificación muy exacta del crecimiento volumétrico entre solamente la ligadura de la vena porta y la ligadura de la vena porta y la transección del añadido, que es importante para la validación de cualquier modelo de hipertrofia hepática rápida.

El protocolo que presentamos describe la técnica quirúrgica y procedimientos utilizados para la validación volumétrica y caracterización fisiológica del modelo de hipertrofia lenta y rápida después de la ligadura de la vena porta y la ligadura de la vena porta con corte transversal, respectivamente, en ratas.

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Protocolo

Todos los experimentos en este protocolo fueron aprobados por las autoridades veterinarias del cantón de Zúrich, Suiza (número 60/2014). Además, todas las medidas experimentales se realizaron en estricto cumplimiento con las directrices sobre experimentos con animales por la Academia Suiza de ciencias médicas (SAMS) y las directrices de la Federación de europeo laboratorio animales ciencia asociaciones (personal) .

1. cría de animales, sala de operaciones e instrumentos, anestesia

1. Mantener las ratas masculinas de Wistar con un peso de 250-300 g en jaulas ventiladas en condiciones estándar libres de patógeno en un ciclo de luz/oscuridad de 12/12 h. Dar animales libre acceso a alimentos y agua a una temperatura de 22 ± 1 ° C.
2. Inducir la anestesia en una caja, donde isoflurano se enjuaga con 5% de vol de 30 s (figura 1A), seguido de una concentración de isoflurano de 3% vol hasta que el animal está bajo anestesia profunda. Confirmar el nivel de anestesia por el reflejo del pellizco del dedo del pie.
3. Proporcionar analgesia por vía subcutánea utilizando aplica buprenorfina (0.01 mg/kg) durante la intervención quirúrgica, seguida de 0.02 mg/kg cada 12 h en la fase postoperatoria de 48 h.
4. Traslado del animal al lugar de trabajo, donde están expuesta a una mezcla de gas de 1.0-2.5 vol % isoflurano en oxígeno de la respiración espontáneamente (flujo: 600 mL/min).
5. Cerrar los ojos del animal y usar una pomada para proteger los ojos. Inyectar solución salina 5 mL por vía subcutánea, la mitad a cada lado del abdomen, seguido por la atropina 0,1 mg.
6. Realizar la cirugía utilizando un microscopio quirúrgico en una sala de microcirugía.
7. Que el animal bajo anestesia volátil usando una máscara de ventilación, que consiste en una membrana de látex (figura 1B), a través del cual se empuja el hocico de la rata. Fijar los extremos con cinta adhesiva (figura 1B).
8. Diseñar los instrumentos quirúrgicos de manera estéril en mesa: esponjas remojados en solución salina y clorhexidina (figura 2A), abdominales pared retractores (figura 2B) así como las suturas 3-0 para la retracción de la pared abdominal y xifoides, tijeras, Adson fórceps, fino consejos Micro-pinzas recto y curvo y corte lazos de seda 6-0 para el procedimiento de ligadura (figura 2).
9. Utilice Micro-pinzas bipolar no se pegue para la transección del parénquima hepático. Cerca de la pared abdominal y la piel con suturas de seda 3-0 con agujas SH-1 y 5-0 Maxon (Figura 2D). Utilizar una pinza bipolar para la hemostasia.

2. Inicio de la cirugía

1. Afeitar el abdomen del animal con un pequeño animal cortapelos de la xifoides a los genitales con un lateral de la zona de 2 cm de la línea media. Eliminar completamente el pelo.
2. Desinfectar esta zona 3 veces con betadine empapado esponjas.
3. Realizar una incisión de línea media con bisturí para la piel y luego usar tijeras quirúrgicas para abrir el abdomen.
4. Repliegue de la derecha e izquierda de la pared abdominal y el xifoides con suturas de seda 3-0 (Figura 3A).
5. Retraer el estómago, el colon y el intestino delgado desde el ligamento de hepatoduodenal de la rata con separadores de alambre pequeño hecho a sí mismo (figura 3B).

3. vena porta ligadura (PVL)

1. Acceder a la vena porta y sus ramas lateral contracción del estómago y el intestino delgado (figura 3B).
2. Disecar la vena porta sin rodeos el peritoneo con la Micro-pinzas y lentamente peeling intermedio.
3. Diseccionar las ramas de la vena porta hacia fuera (figura 3) en la siguiente secuencia: rama posterior (1) derecho, (2) rama media izquierda y lateral a la izquierda y rama (3) caudado.
   1. En primer lugar, retire el peritoneo con movimientos pequeños, no demasiado enérgicos para evitar desgarro las pequeñas ramas arteriales a los lóbulos hepáticos que se ejecutan directamente con la cobertura peritoneal.
   2. Una vez que la vena porta principal es denudada, rodear las ramas con empujar adelante lento y movimientos que se separa y luego tirar un pedazo de 1 cm de seda 6-0 lazo alrededor de la rama respectiva de la vena porta y lo ligan.
4. Ligar la rama del lóbulo derecho posterior. (Figura 3) La dificultad técnica de la rama derecha posterior consiste en el hecho de que la arteria del lóbulo posterior derecho se ejecuta a través de la rama derecha posterior de la vena porta.
   1. Tire la arteria cranially junto con el peritoneo para exponer la rama derecha de la vena porta con Micro-pinzas curvado.
   2. Ligar la rama del lóbulo posterior derecho con el corte de la corbata de seda 6-0. El lóbulo posterior derecho se vuelve visiblemente pálido una vez que la vena porta está ligada.
   3. No empujar contra la resistencia en el circuito para evitar el desgarro de la arteria o la vena porta. En caso de sangrado, aplique presión durante al menos un minuto con un hisopo de algodón estéril y luego reevaluar. Si el sangrado no se detiene, sacrificar el animal.
5. Ligar el lateral izquierdo (LLL) y lóbulo medio izquierdo (LML) ramas. Estas ramas tienen un tronco común. (Figura 3). La rama izquierda del lóbulo mediano nace de la vena porta dentro de la parenquimia de la LLL.
   1. Ligar la vena porta lleva a LLL y el amor de mi rama de vida mediante el corte de la corbata de seda 6-0.
   2. Evitar lesiones en las arterias conduciendo a LLL y amor mi vida, dentro de la capa peritoneal. Como el peritoneo se pela detrás con cuidado, permanecen intactos. La LLL y el amor que mi vida gire visiblemente pálido una vez que las ramas se unen.
6. Ligar la rama del lóbulo caudado (figura 3). La vena porta lleva a algo separados lóbulos caudados en ratas despega de la vena porta principal, distal y medialmente al despegue de la rama del lóbulo derecho de la vena porta principal (como no estrictamente inferiorly en seres humanos o animales más grandes).
   1. Que disecar y rodear levantando el peritoneo más conductos biliares y las arterias de la vena porta principal.
   2. Rodear la rama de la vena porta caudada con una curva Micro-pinzas viniendo lateralmente. Los dos lóbulos caudados vuelta visiblemente pálidos, una vez que la rama del lóbulo caudado es ligarse con la seda 6-0.
7. Atar las tres ramas de la vena porta lleva a vena portal exclusivo de la perfusión del lóbulo mediano derecho (RML), que es visible por una línea de demarcación clara entre el lóbulo medio derecho e izquierdo.

4. vena porta ligadura con sección transversal (PVL + T)

1. Realizar el corte transversal a lo largo de la línea de demarcación entre RML y amor mi vida después de la leucomalacia periventricular (figura 3D).
2. Usar un fórceps bipolares de plata no se pegue con una punta muy fina neuroquirúrgica para precauterize el tejido del hígado creando una tira de cauterización de 1 mm a lo largo de la línea de demarcación.
3. Utilice tijeras para cortar con cuidado el tejido precauterized. Es muy difícil evaluar correctamente la profundidad de la sección transversal. El objetivo es llegar tan cerca de la vena cava como sea posible, que se extiende intrahepatically en ratas. Lesiones de la vena cava se acompañan de hemorragia extensa, que puede generalmente ser impedido.
4. En caso de lesiones se aplica una presión suave con un bastoncillo, pero si el sangrado no se detiene dentro de 3-4 min, sacrificar el animal. Intentos de reparación de la vena cava mediante suturas han sido generalmente fracasados. Las ratas son muy sensibles al aire embolia, que puede ocurrir en alguna ocasión y llevar a paro cardiaco.

5. intraoperatoria medición de la presión venosa Portal y el flujo de volumen

1. Evaluar la presión venosa portal mediante canulación directa con una aguja de G30 conectada a un monitor de presión (Figura 4A).
2. Uso la punta de prueba de flujo de volumen de 2 mm lateralmente a conectados al dispositivo de flujo para medición directa de caudal portal sobre 2 minutos (Figura 4B). Sólo registrar datos con calidad de medición estable tal como se indica en la pantalla de la máquina.
3. Evaluar la presión y el flujo de la vena porta por separado después del grupo de los pasos que definen el procedimiento respectivo, es decir, la vinculación de tres ramas de la vena porta o el atar de las tres ramas de la vena porta y realizar la transección del parénquima entre el RML y el amor mi vida.

6. últimos pasos de la cirugía

1. Asegúrese de que el intestino esté colocado correctamente en la cavidad abdominal antes de cerrar.
2. Cerrar el peritoneo y la pared abdominal con suturas de seda 3-0 con agujas SH-1.
3. Finalmente se sutura la piel con Maxon 5-0.
4. Desinfectar la piel otra vez.
5. Aplicar nuevamente solución salina 5 mL por vía subcutánea en el lateral de tejido subcutáneo en el abdomen.

7. hígado volumetría en ratas usando el pequeño Animal CT

1. 24 h antes de la primera proyección de imagen de CT inyectar 200 μL del agente de contraste en la vena de la cola a través de un catéter intravenoso G26.
2. Uso un micro CT para escanear las ratas. Coloque el animal en una caja de plexiglás para inducir anestesia general (lavar primero con 5% de vol por 30 s, seguido de una concentración de isoflurano de 2-3 vol % hasta que el animal esté bajo anestesia y mantener a lo largo de la exploración a través de un sistema de tubería). Para calidad de imagen óptima, sincronizar la exploración del CT con la respiración del animal.
3. Exportación de la imagen digital y comunicaciones en los archivos de medicina (DICOM) y analizarlos utilizando el dominio público plataforma OsiriX 8.0 la proyección de imagen. Utilice la herramienta "Polígono cerrado" para dibujar las fronteras del lóbulo basadas en el radiodensitiy del contraste de nanopartículas en el hígado y la región del menú de interés (ROI) para calcular volúmenes de hígado parciales (ver figura 2A en Schadde et al. ¹⁷)
4. En el modelo estándar, permite el hígado crecen durante 3 días y diariamente obtener TAC para evaluar aumento de volumen.

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Resultados

La ligadura de la vena porta de dos diferentes procedimientos quirúrgicos (PVL) y leucomalacia periventricular con resultado de transección (PVL + T) en la cinética de crecimiento muy diferentes. PVL induce aumento de volumen moderado dentro de 3 días, mientras que en el PVL + T un lóbulo mediano derecho mucho más grande (RML) puede ser visto (figura 5). Esto puede ser verificado por volumetría diario. El volumen de la RML duplica aproximadamente dentr...

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Discusión

Este protocolo presenta un modelo animal de ALPPS con su rápida hipertrofia inducida por PVL + T, que aproximadamente duplica el aumento del volumen dentro de 3 días en comparación con el PVL solo. ¹⁷ el media correcta del lóbulo hepático se usa como un lóbulo de modelo para el crecimiento del hígado porque el lóbulo hepático medio es una masa de parénquima contigua suministrada por dos separados las venas porta a su izquierda y a su derecha, como se muestra en la fi...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Buprenorphine (Temgesic)	Indivior, Baar, Switzerland	7680419310353	GTIN-number
Vitamine A ointment	Bausch&Lomp, Zug, Switzerland	7680223980247	GTIN-number
Atropine sulfate 0.5 mg/mL	Sintetica SA, Mendrisio, Switzerland	7680565330045	GTIN-number
Microsurgery microscope	Olympus, Tokio, Japan	SZX10	Standard vet. equipment
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7680342821377	GTIN-number
Sponges	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	NK83.1	Mini-sponges
Abdominal Wall retractors	N/A	N/A	Self-made from paper clips and Q-Tips
3-0 silk	Ethicon, Sommerville, NJ	K872H	Standard surgical
Scissors	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	503371	Standard microsurgical
Adson forceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501244-G	Standard microsurgical
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Essential to go around the portal vein branches
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Spool, precut prior to the procedure
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
5-0 maxon sutures	Covidien, Dublin, Ireland	6608-21	Standard surgical
Bipolar microforceps	Sutter, Freiburg, Germany	780148SGS	Essential for parenchymal transection
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Q-tips big	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	XL54.1	Standard surgical
G30 needle	Terumo, Tokyo, Japan	NN-3013R	Standard anesthesia equipment
2 mm volume flow probe	Transonic Systems, Ithaca, NY	MA-2PS	Smallest available probe for HAT-311 flow meter
Transonic flow meter	Transonic Systems, Ithaca, NY	HAT-311 Transsonic flow QC meter	One of the  first generation flow flow meters for surgery
ExiTron nano 12,000	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698	Nanomoloecular contrast medium that opacifies liver and spleen
G26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
Quantum FX MicroCT	Perkin Elmer, Waltham, MA	N/A	Standard small animal CT scanner at the institute of physiology, University of Zürich
OsiriX 8.0	Pixmeo Sarl, Geneva, Switzerland	N/A	Public domain software : www.pixmeo.com