연결 간 파티션과 무대 Hepatectomy (ALPPS) 절차에 대 한 포털 정 맥 결 찰의 쥐 모델

요약

상연 hepatectomy에 대 한 연결 간 파티션 및 포털 정 맥 결 찰을 사용 하 여 빠른 간 비 대를 유도 (ALPPS) 경계선 불과하다 간 종양의 절제에 대 한 제안 되었습니다. 이 모델 급속 한 비 대에 관여 하는 메커니즘을 명료 하 고 홍보 또는 중생의 가속을 차단 하는 약물의 테스트 있습니다.

초록

최근 임상 데이터 기본 및 전이성 간 종양에 대 한 적극적인 수술 접근을 지원합니다. 대 장 간 전이, 같은 일부 표시에 대 한 간 조직의 양을 남기고 후 간 절제술의 큰 resectability 또는 여러 간 종양의 주요 제한 요인이 되고있다. 기능 조직의 최소한의 금액은 게시물 hepatectomy의 심각한 합병증을 피하기 위해 필요 높은 사망률 및 사망에는 간 경화. 절제술 전에 예비 잔해의 간 성장 유도 간 수술, 중재 방사선에 의해 문맥 색전술의 형태로 또는 포털 정 맥 결 찰 절제술 전에 몇 주의 형태로 더 설립 되는. 최근에, 그것은 보이지 않고 간 재생 더 광범위 하 고 급속 한, parenchymal transection 포털 정 맥 결 찰 첫 번째 단계에서 그리고, 대기, (연결 간 파티션 두 번째 단계에서 수행 하는 절제의만 1 주일 후에 추가 될 때 그리고 무대 hepatectomy 위한 포털 정 맥 결 찰 = ALPPS). ALPPS는 급속 하 게 인기 끌고있다, 전세계 하지만 그것의 높은 수술 사망률에 대 한 비판을 받아왔다. 이 절차에 의해 유도 된 가속 및 광범위 한 성장의 메커니즘 잘 이해 하지는. 동물 모델에서 ALPPS 가속된 간 재생의 생리 및 분자 메커니즘을 탐구 개발 되었습니다. 이 프로토콜 가속된 중생의 기계적 탐사를 허용 하는 쥐 모델을 제공 합니다.

서문

간 잔해의 크기는 간 종양의 resectability를 제한합니다. ¹ 일반 때 보다 25% 간 조직에 남아, 환자는 전체 유기 체 ("너무 작은 크기 증후군")에 대 한 대사 기능 부족으로 인해 급성 간부에서 죽음의 위험이 증가 합니다. ² 이 게시물-hepatectomy 간부 간 절제 후 가장 치명적인 합병증 이다. 따라서 임상 포털 정 맥의 흐름을 조작 하 여 간 절제술 전에 간 재생을 유도 하려고 합니다. ³ 그것은 발견, 포털 정 맥 차단 되 면 문맥 흐름과 나머지 부분 느린 속도로 성장 하기 시작 크기에 최대 60%까지 증가 수 있습니다. ⁴ 수술 결 찰⁵ 또는 중재 포털 정 맥 폐색 둘 다 임상으로 설립 되었습니다. ⁴ 볼륨 및 간 기능에 증가 신뢰할 수 있는, 하지만 간 포털 폐색 되 면 약 1/5만의 성장 율 부분 hepatectomy 후 나머지 간의 성장에 비해. ⁶

간 절제 후 훨씬 더 빠른 속도로 재생할 수 있습니다 비록 간 성장 하는 데 필요한 시간 주에 달입니다. 따라서, 간 그것의 부분의 제거 후 정상 기능을 다시 성장 하는 유일한 기관입니다. ⁷ 유사한 속도로 간 재생을 유도 하는 부분 hepactectomy 개발 되었다 후 외과 의사의 그룹에 의해 누가 폐색 사이 transection 추가 발견 하 고 간 비 가려진 부분 유도 간 새로운 절차. 간 절제 후 하지만 절제술 이전에와 같은 성장 속도로 비 대. ⁹ 절차는 주 내에서 광범위 한, 주로 unresectable, 간 종양의 절제를 수 있는 미래에 간 주 남은 내 80%의 급속 한 비 대를 시작 합니다. 프로시저를 호출할 "상연 hepatectomy 위한 관련 시키기 간 파티션 및 포털 정 맥 결 찰 ALPPS =" 전 세계에 걸쳐 급속 하 게 인기가 되었다. ¹⁰ 여러 보고서는 새로운 기술,¹¹ 동안 복잡 한 수술은 또한 그것의 높은 합병증 비율에 대 한 비판에 의해 달성 경계선 불과하다 간 종양의 resectability의 확장을 지원 합니다. ^{12 , 13}

쥐의 개발 및도 느리고 급속 한 비 대의 대형 동물 모델에 약물 효과 테스트를 더 나은 조직학 특성화 및 메커니즘의 이해 하 고 2012 년에 ALPPS의 출간 이후 시도는 동물에서 간 조직의 다른 성장 속도입니다. 첫 번째 동물 모델 개발 쥐 모델이 이었습니다. 이 모델에서 오른쪽 중간 엽의 왼쪽된 부분 사이의 parenchymal transection 후 급속 한 비 대 오른쪽 중간 엽의 재생을 가속. ¹⁴ 다른 모델 마우스의 뒷부분에 소개 되었다. 이 모델에서는 왼쪽된 측면 엽 절제 했다 그리고 문맥 분 지 왼쪽된 중간 엽 제외 하 고 간 모든 엽을 연결 했다. ¹⁵ 한편 돼지에서 ALPPS의 대형 동물 모델가지고 설명 뿐만. ¹⁶

흐름 변경 및 문맥, 관류 및 간 조직에의 산소 압력 같은 생리 적 메커니즘의 연구에 대 한 쥐 모델 쥐에서 ALPPS의 모델에 우량 하다. Murine 모델 쥐의 또 다른 장점은 쥐 모델에는 왼쪽된 측면 엽, ALPPS의 간 절제술의 효과 오염 시킬 수 있습니다¹⁵ 의 절제에 대 한 필요성입니다. 쥐 모델에 반대로 감소 하지 않습니다 간 세포 질량. 돼지 모델 성장 엽으로 바로 후부 엽을 사용 하지만 돼지 간은 매우 lobulated. 따라서, 그것은 바로 후부와 오른쪽 앞쪽 엽 사이 이미 얇은 조직 브리지 transection 비행기를 만들 어렵다. 대조적으로, 쥐에서 중간 엽 포털 정 맥 각에서 별도로 제공 하는 두 부분으로 구성 하 고 parenchymal transection 비행기 microsurgical 기술을 사용 하 여 두 사이 쉽게 만들 수 있습니다. 작은 동물 컴퓨터 단층 촬영 (CT) 또는 자석 공명 영상 (MRI)의 유용성 수 혼자 포털 정 맥 결 찰 및 포털 정 맥 결 찰 및 추가 transection 사이 체적 증가의 매우 정확한 정량화는 중요 한 대 한 어떤 급속 한 간 비 대 모델의 유효성 검사.

여기에 제시 된 프로토콜 수술 기법 및 체적 검증 및 포털 정 맥 결 찰과 함께 transection, 포털 정 맥 결 찰 후 느리고 급속 한 비 대의 모델의 생리 적 특성에 사용 되는 절차에 설명 합니다. 쥐에서 각각.

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프로토콜

이 프로토콜에서 모든 실험 취리히, 스위스의 구획의 수의 당국에 의해 승인 했다 (60/2014 번). 또한, 모든 실험 단계 수행한 동물 실험에 대 한 지침의 엄격한 준수 스위스 아카데미 의료 과학 (SAMS) 및 지침의는 연맹의 유럽 실험실 동물 과학 협회 (FELASA) .

1. 축산, 수술 실 장비 및 악기, 마 취

1. 12/12 h 명암 주기에서 표준 병원 체 자유로운 조건에서 통풍이 연습장에 250-300 g의 무게로 남성 Wistar 쥐를 유지. 게 동물 무료로 음식과 물 22 ±의 온도에서 1 ° c.
2. Isoflurane 30 5 vol %로 플러시는 상자에서 마 취 유도 s (그림 1A), 동물 깊은 마 취 될 때까지 3 vol %의 isoflurane 농도 옵니다. 발가락-핀치 반사에 의해 마 취의 수준을 확인 합니다.
3. 0.02 mg/kg 매 12 h 48 h에 대 한 수술 후 단계에서 다음 과적 동안 buprenorphine (0.01 mg/kg)를 적용 하는 진통 피하 사용 하 여 제공 합니다.
4. 동물 들은 자발적으로 호흡 가스 혼합물의 산소에서 1.0-2.5 집 %isoflurane 노출 작업 장소에 전송 (흐름: 600 mL/min).
5. 동물의 눈을 닫고 연 고를 사용 하 여 눈을 보호 합니다. 5 mL 식 염 수를 피하 주사, 복 부의 각 측에 그것의 뒤에 0.1 mg 아트로핀.
6. 수술 방에 미세 수술 현미경을 사용 하 여 수행 합니다.
7. 쥐의 주 둥이 통해 푸시됩니다 라텍스 막 (그림 1B)의 구성 된 환기 마스크를 사용 하 여 휘발성 마 취 동물 유지. 수정 테이프 (그림 1B)와 사지.
8. 옆 테이블에 살 균 방식에서 수술 악기 배치: 염 분 및 Betadine 젖은 스폰지 (그림 2A), 복 부 복 부 벽 및 칼가 위, Adson의 철회에 대 한 3-0 봉합 뿐만 아니라 견인 기 (그림 2B) 벽 집게, 바로 팁 microforceps 좋은 곡선 및 미리 결 찰 절차 (그림 2C)에 대 한 6-0 실크 넥타이 잘라.
9. 간 실질의 transection 튀어나와 비 바이 폴라 microforceps를 사용 합니다. 복 벽과 피부 SH 1 바늘과 5-0 슨 (그림 2D) 3-0 비단 봉합을 사용 하 여 닫습니다. 바이 폴라 집게를 사용 하 여 hemostasis에 대 한.

2입니다. 수술의 시작

1. 성 기에 있는 칼에서 작은 동물 머리 깎기로 동물의 복 부는 중간의 2 cm 지역 측면을 면도. 철저 하 게 머리를 제거 합니다.
2. 3 번 betadine 젖은 스폰지와 함께이 지역 소독.
3. 중간 절 개는 피부에 대 한 메스를 사용 하 여 수행 하 고 복 부를 수술가 위를 사용 하 여.
4. 오른쪽 및 왼쪽된 복 부 벽과 3-0 비단 봉합 (그림 3A)와 칼을 철회.
5. 위, 결 장 및 작은 창 자 작은 와이어 견인 기 (그림 3B)와 쥐의 hepatoduodenal 인 대에서 철회.

3. 포털 정 맥 결 찰 (PVL)

1. 복 부와 작은 창 자 (그림 3B)의 측면 철회 하 여 포털 정 맥 및 그것의 분 지를 액세스할.
2. microforceps와 함께 복을 따기와 천천히 medially 필 링 퉁 명 스럽게 포털 정 맥을 해 부.
3. 다음 순서로 (그림 3C) 밖으로 문맥 분 지 부: (1) 바로 후부 지점, (2) 왼쪽 측면 왼쪽된 중간 지점, 그리고 (3) 꼬리가 지점.
   1. 첫째, 복 범위에서 직접 실행 하는 간 엽에 작은 동맥 가지를 찢 어 하지 않도록 작은, 너무 활기찬 움직임으로 복을 벗기다.
   2. 일단 주요 포털 정 맥 걸치기 느린 앞으로 밀기와 분기를 둘러싸 자 고 확산 움직임 그리고 풀 6-0 실크의 1 cm 조각 각각 포털 정 맥 분기 주위 넥타이 그것을 위하여.
4. 바로 후부 엽 분 지 선 (그림 3C) 바로 후부 분기의 기술적인 어려움 바로 후부 엽 하 동맥 바로 후부 문맥 분 지에 걸쳐 실행 하는 사실에서 이루어져 있다.
   1. Cranially 곡선된 microforceps와 오른쪽 문맥 분 지를 폭로 복 함께 동맥을 당겨.
   2. 위하여 사전 커트로 바로 후부 엽 지점 6-0 실크 넥타이. 바로 후부 엽 포털 정 맥 출혈은 일단 눈에 띄게 창백한 돈다.
   3. 주위를 돌고 있는 동안 저항에 대 한 추진 하지 마십시오 동맥 또는 포털 정 맥을 찢 어 방지 하기 위해. 출혈의 경우 멸 균 면봉으로 1 분 이상에 대 한 압력을 적용 하 고 재평가. 출혈이 멈추지 않으면, 동물을 희생.
5. (내 인생을 사랑) 왼쪽된 측면 (LLL) 및 왼쪽된 중간 엽 선 분기. 이 가지는 하나의 일반적인 트렁크. (그림 3C)입니다. 왼쪽된 중간 엽 지점 문맥은 LLL의 실질 내에서 발생합니다.
   1. 내 인생 지점 사용 하 여 함께 사전 컷 6-0 실크 넥타이 LLL와도 사랑에 지도 문맥 선
   2. LLL로 이어지는 동맥에 부상을 방지 하 고 복 층 내에서 실행 하는 내 인생을 사랑. 로 복은 벗 겨 다시 신중 하 게, 그들은 그대로 있어. 내 인생 돌아 가시 사랑과 LLL 가지 출혈 되 면 창백.
6. 꼬리가 엽 지점 (그림 3C) 선 쥐에 별도 꼬리가 돌출부 다소로 이어지는 문맥 걸립니다 주요 문맥에서 distally medially 주요 포털 정 맥에서 오른쪽 엽 분기의 이륙 (하지 엄격히 inferiorly 에서처럼 인간이 나 큰 동물).
   1. 그것을 밖으로 해 부하 고 복 플러스 담 즙 덕트와 동맥 주요 포털 정 맥에서 위로 들어올려 둘러싸 자.
   2. 옆에서 오는 곡선된 microforceps와 꼬리가 문맥 분기를 둘러싸십시오. 두 개의 꼬리가 돌출부 꼬리가 엽 지점 6-0 실크로 출혈은 일단 눈에 띄게 창백 하 고, 설정 합니다.
7. 이 3 개의 문맥 분 지 매 이끌어 낸다 독점 문맥 관류의 오른쪽 중간 엽 (RML), 오른쪽과 왼쪽 중간 엽 간의 뚜렷한 경계선으로 표시 됩니다.

4. 포털 정 맥 결 찰 Transection (PVL + T)와

1. RML 사이 분계선 따라 transection 수행 하 고 PVL (그림 3D) 후 내 인생을 사랑.
2. 아주 좋은 신경외과 팁과 비 고정 양극은 집게를 사용 하 여 휴전선 1 mm 열화 스트립 만드는 간 조직 precauterize.
3. 가 위를 사용 하 여 precauterized 조직을 조심 스럽게 잘라. transection의 깊이 제대로 평가 하기 매우 어렵습니다. 목표는 쥐에 intrahepatically 실행 가능한, 베 나 카바에 가까운 얻는 것입니다. 베 나 정 맥의 상해는 일반적으로 멈출 수 없어 광범위 한 출혈에 의해 동반 됩니다.
4. 부상의 경우에 면봉을 사용 하 여 부드러운 압력을 적용 하지만 경우에 출혈이 멈추지 않으면 3-4 분 이내, 동물을 희생. 베 나 카바 봉합을 사용 하 여 복구 시도 일반적으로 성공 하지. 쥐 색 전 증, 때때로 발생 하 고 심장 마비로 이어질 수 있는 공기에 매우 민감합니다.

5. 자가 측정 문맥 압력 및 볼륨 흐름

1. 압력 모니터 (그림 4A)에 연결 된 G30 바늘으로 직접 cannulation에 의해 문맥 압력을 평가 합니다.
2. 2 m m 볼륨 흐름 프로브 옆으로 배치를 사용 하 여 포털 볼륨 흐름 2 분 이상 (그림 4B)의 직접 측정에 대 한 흐름 장치에 연결 합니다. 컴퓨터 디스플레이에 표시 된 대로 안정적인 측정 품질만 레코드 데이터입니다.
3. 즉 3 개의 문맥 분 지 또는 3 개의 문맥 분 지 떨어져 매 플러스 parenchymal transection 수행의 매 해당 프로시저를 정의 하는 단계의 그룹 후 문맥 흐름과 압력을 별도로 평가 사랑과 RML 사이 내 인생.

6. 마지막 단계는 수술의

1. 작은 창 닫기 전에 복 부 구멍에 제대로 배치는 다는 것을 확인 하십시오.
2. SH-1 바늘으로 복 막과 복 벽 3-0 비단 봉합을 닫습니다.
3. 마지막으로 슨 5-0를 사용 하 여 피부 봉합.
4. 다시 피부를 소독.
5. 적용 다시 5 mL 염 피하 피하 조직 측면으로는 복 부.

7. 간 Volumetry 쥐 작은 동물 CT를 사용 하 여

1. 첫 번째 CT 영상 이전 24 시간 G26 정 맥 카 테 터를 통해 꼬리 정 맥에 대조 대리인의 200 μ를 삽입할.
2. 마이크로 CT를 사용 하 여 쥐를 스캔. 전신 마 취를 유도 하는 유리 상자에 동물을 배치 (처음 30 5 vol %로 플러시 s, 뒤에 2-3 vol %의 isoflurane 농도 동물 마 취 튜브 시스템을 통해 스캔을 통해 그것을 유지). 최적의 이미지 품질에 대 한 동물의 호흡으로 CT 스캔을 동기화 합니다.
3. 디지털 이미징 및 통신 의학 (DICOM) 파일에 내보내고 이미징 플랫폼 OsiriX 8.0 공개 소프트웨어를 사용 하 여 분석. "닫힌된 다각형" 도구를 사용 하 여 간에서 나노 대비의 radiodensitiy에 따라 엽 테두리를 그릴 관심 (ROI) 메뉴의 영역을 사용 하 여 부분 간 볼륨 (Schadde 외. 그림 2A 참조 계산을 ¹⁷)
4. 표준 모델에 간 3 일 이상 성장과 볼륨 증가 평가 하기 위해 CT 검사를 매일 얻을 수 있습니다.

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결과

두 개의 다른 수술 절차 포털 정 맥 결 찰 (PVL) 및 PVL transection (PVL + T) 결과 분명히 다른 성장 속도 론. PVL 유도, 3 일 이내 중간 볼륨 증가 반면 PVL + T에 훨씬 더 큰 오른쪽 중간 엽 (RML) 수 본 (그림 5). 이 매일 volumetry에 의해 확인할 수 있습니다. RML의 볼륨 PVL, 3 일 이내 PVL + 토니¹⁷ 세 배 하는 동안 대략 복식

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토론

이 프로토콜 PVL + T, 그 대략 PVL 혼자에 비해 3 일 이내 볼륨 증가 두 배로 의해 유도 된 그것의 급속 한 비 대와 ALPPS의 동물 모델을 제공 합니다. ¹⁷ 오른쪽 중간 간 엽 중간 간 엽 그림 1 에서 같이 왼쪽 및 오른쪽 측면, 두 개의 별도 포털 혈관에 의해 공급 한 연속 parenchymal 질량은 때문에 성장에 대 한 모델 간 엽으로 사용 되는 최근 게시 된 작품입니다.

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자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Isoflurane, 250 mL bottles	Attane, Piramal, Mumbai, India	LDNI 22098	Standard vet. equipment
Tec-3 Isofluorane Vaporizer	Ohmeda, GE-Healthcare, Chicago, IL	not available anymore	Standard vet. equipment
Buprenorphine (Temgesic)	Indivior, Baar, Switzerland	7680419310353	GTIN-number
Vitamine A ointment	Bausch&Lomp, Zug, Switzerland	7680223980247	GTIN-number
Atropine sulfate 0.5 mg/mL	Sintetica SA, Mendrisio, Switzerland	7680565330045	GTIN-number
Microsurgery microscope	Olympus, Tokio, Japan	SZX10	Standard vet. equipment
Betadine	Mundipharma, Basel, Switzerland	7680342821377	GTIN-number
Sponges	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	NK83.1	Mini-sponges
Abdominal Wall retractors	N/A	N/A	Self-made from paper clips and Q-Tips
3-0 silk	Ethicon, Sommerville, NJ	K872H	Standard surgical
Scissors	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	503371	Standard microsurgical
Adson forceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501244-G	Standard microsurgical
Fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	501976	Tips need to be polished regularly
Curved fine tips microforceps	World precision instruments (WPI), Sarasota, FL	504513	Essential to go around the portal vein branches
6-0 LOOK black braided silk	Surgical Specalities Corporation, Wyomissing, PA	SP114	Spool, precut prior to the procedure
2-0 silk sutures	Ethicon, Sommerville, NJ	K833	Standard surgical
5-0 maxon sutures	Covidien, Dublin, Ireland	6608-21	Standard surgical
Bipolar microforceps	Sutter, Freiburg, Germany	780148SGS	Essential for parenchymal transection
Q-tips small	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	EH11.1	Standard surgical
Q-tips big	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	XL54.1	Standard surgical
G30 needle	Terumo, Tokyo, Japan	NN-3013R	Standard anesthesia equipment
2 mm volume flow probe	Transonic Systems, Ithaca, NY	MA-2PS	Smallest available probe for HAT-311 flow meter
Transonic flow meter	Transonic Systems, Ithaca, NY	HAT-311 Transsonic flow QC meter	One of the  first generation flow flow meters for surgery
ExiTron nano 12,000	Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Germany	130-095-698	Nanomoloecular contrast medium that opacifies liver and spleen
G26 intravenous catheter	Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ	391349	Standard anesthesia equipment
Quantum FX MicroCT	Perkin Elmer, Waltham, MA	N/A	Standard small animal CT scanner at the institute of physiology, University of Zürich
OsiriX 8.0	Pixmeo Sarl, Geneva, Switzerland	N/A	Public domain software : www.pixmeo.com