Piezoeléctrico de alta precisión ósea la extirpación quirúrgica (fasor): Una técnica mejorada ventana craneal cirugía en ratones

Resumen

Cirugía piezoeléctrica ha conducido a mejoras en cirugía maxilofacial y dental humana. Hemos desarrollado un protocolo para optimizar la cirugía piezoeléctrica para cirugía craneal ventana en ratones.

Resumen

Microscopía multifotón ha sido ampliamente adaptado para la proyección de imagen las neuronas en vivo. Proyección de imagen repetida requiere la implantación de una ventana craneal o adelgazamiento repetidas del cráneo. Ventana craneal cirugía generalmente se realiza con un taladro de alta velocidad, y muchos investigadores encuentran difícil para evitar que el taladro los delicados dura y los vasos sanguíneos. Amplia formación y la práctica es necesario quitar el hueso sin daño al tejido subyacente y así ventana craneal cirugía puede ser difícil, consume tiempo y producir daño tisular. Cirugía piezoeléctrica, que se utiliza extensivamente para la cirugía maxilofacial y dental, utiliza vibraciones ultrasónicas para eliminar el hueso sin dañar los tejidos blandos. Hemos desarrollado un método de aplicar cirugía piezoeléctrica para mejorar la cirugía craneal ventana en ratones en preparación para la proyección de imagen multifotón. Comparaciones dentro de nuestro laboratorio de encuentran que el método requiere menos tiempo de cirugía y tiene una menor tasa promedio de complicaciones debido a hemorragia dural que la cirugía de ventana craneal con un taladro.

Introducción

Cirugía de ventana craneal para preparar roedores multifotón imágenes en vivo se ha convertido en una técnica importante en Neurociencia. La remoción o adelgazamiento del hueso es necesario preparar el ratón para la proyección de imagen óptica con un microscopio multifotón. Esta cirugía se realiza por quitar completamente una zona del hueso para exponer la dura subyacente¹, o por el adelgazamiento de una región del hueso sin el retiro completo de la dura². El enfoque fino del cráneo puede producir menos inflamación y la activación de la microglia³ pero ofrece una menor profundidad de la proyección de imagen, un tamaño más pequeño de la ventana imagen (200 μm) y un período de tiempo limitado durante el cual la ventana puede ser reflejada debido a la regeneración de hueso² . La adición de una ventana de cristal pulido y reforzado (puertos) puede aumentar el tamaño de imagen y el período de proyección de imagen pero es difícil de realizar⁴.

Ambas cirugías actuales utilizan un taladro de alta velocidad a fina o quitar el hueso del cráneo. La técnica cráneo fina también utiliza un bisturí después el taladro a la más delgada del hueso². La técnica de los puertos requiere el paso adicional de alta velocidad de pulido con arena⁴. En una alta velocidad rotatoria del taladro, una turbina de aire o motor eléctrico hace que la broca al girar a alta velocidad. Como taladros rotativos sección de hueso y tejidos blandos, existe el riesgo de dañar la duramadre y subyacentes de los vasos sanguíneos. El éxito de la cirugía depende de la habilidad del cirujano. Además de estas ventanas con métodos quirúrgicos mecánicos, un método químico de ópticamente claro el cráneo con diferentes soluciones ha sido desarrollado^5,6. Sin embargo, puesto que la cirugía piezoeléctrica es un método mecánico de la cirugía, aquí nuestras comparaciones se limitará a otros métodos mecánicos.

Piezoeléctrico de Aparatos quirúrgicos utilizan vibraciones ultrasónicas para romper hueso mineralizado sin dañar los tejidos blandos subyacentes y así ofrecen una aproximación para lograr rápidamente una gran área de hueso. En una pieza de mano quirúrgica piezoeléctrico, la turbina se sustituye por una pila de discos de cerámica y cuando se aplica corriente, los discos vibran a frecuencias ultrasónicas. Las vibraciones se transmiten a través de la pieza de mano para diamante recubiertos consejos para cortar el hueso sin dañar los tejidos blandos, una ventaja sobre taladros rotatorios que no discriminan entre tipos de tejidos. Cirugía piezoeléctrica fue desarrollada originalmente para su uso en humanos por Tomaso Vercellotti y ha conducido a mejoras en dental y cráneo-maxilofacial cirugía^7,8,9,10,11 .

Cirugía piezoeléctrica se ha utilizado para crear una osteotomía en ratas Wistar y fue encontrada por la proyección de imagen de resonancia magnética (MRI) y la histología para producir significativamente menos daño que un taladro dental tradicional¹². Los autores concluyeron que la cirugía piezoeléctrica fue segura para quitar el hueso cerca tejido cerebral suave. Ratones, sin embargo, tienen una dura más delgado que se daña más fácilmente, y ese estudio no preparar windows para la proyección de imagen óptica crónica. La proyección de imagen crónica requiere que no estén dañados los vasos sanguíneos y que no forman coágulos de sangre debajo de la ventana. Daño a la duramadre conduce a la inflamación que causa la ventana para la nube, y activa la microglia y la proliferación de astrocytes reactivos. Aquí hemos optimizado la cirugía piezoeléctrica para ratones crear delgada cráneo y hueso completo windows craneal extracción conveniente para la proyección de imagen de crónica. Comparamos esta técnica quirúrgica de cirugías de ventana craneal con un taladro de alta velocidad.

Protocolo

Todos los procedimientos que implican animales fueron realizados según los estándares establecidos por la Columbia University Medical centro institucional Animal Care y el Comité uso (IACUC). Eutanasia se realizó mediante dislocación cervical bajo anestesia con ketamina 100 mg/kg y xilacina 10 mg/kg inyectado por vía intraperitoneal. Todos los procedimientos quirúrgicos se realizaron de manera estéril (cirujano llevaba tapa cabeza, mascarilla, guantes estériles y bata desechables limpias) y herramientas quirúrgicas fueron esterilizados entre cada uso.

1. medidas prequirúrgicas

1. Autoclave de los instrumentos quirúrgicos para garantizar la esterilidad.
2. Anestesiar ratones C57bl6 con isoflurano (4% para la inducción y 1.5-2% para la cirugía). Pellizque el dedo del pie trasero cada 10 minutos para asegurar la adecuada profundidad de la anestesia. Aumentar la anestesia si se observa retracción de vocalización o extremidades.
3. Aplicar lubricante ocular veterinaria en los ojos para prevenir la resequedad.
4. Quitar el pelo sobre el cuero cabelludo con una aplicación de 3 min de gel para quitar el cabello o afeitarse con una afeitadora eléctrica.
5. Coloque el ratón en el fotograma estereotáxicas en una almohada o manta de recirculación de agua calibrado a 38° C.
6. Administre buprenorfina (0.1 mg/kg) por vía subcutánea para proporcionar analgesia prequirúrgica.
7. Desinfectar el cuero cabelludo con tres aplicaciones alternadas de clorhexidina o betadine y etanol al 70% utilizando un aplicador con punta de algodón.
8. Inyectan 100 mL de bupivacaína diluido 50% en solución salina debajo del cuero cabelludo para proporcionar anestesia local.

2. piezoeléctrico ventana craneal cirugía

1. Usando instrumental quirúrgico estéril esterilizado, retire un círculo de 1 cm del cuero cabelludo sobre el cráneo cortando con tijeras quirúrgicas en un patrón circular. Levante el cuero cabelludo de la exponer el tejido periostio sobre el hueso del cráneo.
2. Utilice la punta de la pinza para raspar el hueso expuesto de cualquier tejido remanente del periostio. Esto es importante para asegurar que el cemento dental no caerá más tarde.
3. Ajustar la unidad de cirugía piezoeléctrica para vibrar en la posición más baja. Tenga en cuenta que temperaturas más elevadas pueden romper los vasos sanguíneos debido a las vibraciones intensas.
4. Fijar la punta circular estéril a la pieza de mano.
   Nota: La punta circular de 4 mm es ideal para cirugías. El tamaño de punta grande contribuye a la velocidad de la cirugía como la ventana entera puede diluirse al mismo tiempo.
5. Llene una jeringa de 10 mL con hielo frío artificial del líquido cerebroespinal (ACSF) y manténgalo en la mano que no sujeta la pieza de mano piezoeléctrica.
6. Regar el cráneo por goteo la ACSF de la jeringa en el cráneo a un ritmo de 1 mL/min o bien, utilizar una bomba peristáltica que se coloca sobre el cráneo para liberar el uso de la otra mano.
   Nota: Riego con ACSF fría es importante para evitar el sobrecalentamiento debido a la fricción de las vibraciones de alta frecuencia.
7. Aplique suavemente la punta vibrante quirúrgica en el cráneo con un ligero movimiento circular (3 círculos por 1 s) y delgada del hueso a la profundidad deseada para llevar a cabo una preparación de cráneo delgada (5 a 10 min).
   Nota: Aquí, windows 4 mm hicieron que se estrecharon a 20 μm. Sin embargo, el tamaño de la ventana varía con el tamaño de la punta quirúrgica. Puede ajustar el espesor del hueso a la profundidad deseada basada en la longitud de tiempo aplicar la punta del cráneo.
8. Ajustar el ángulo de la pieza de mano y cambiar el ángulo de la punta mientras se aplica presión en el cráneo para diluir el cráneo uniformemente.
9. Para realizar un retiro completo de hueso sin dejar ningún hueso fino detrás, delgada del hueso hasta que grietas visibles en el área de la ventana. Quitar las escamas de la restantes del hueso delgado con fórceps sin dañar la duramadre subyacente.
10. Remoje un pedazo de 1 mm de espuma de colágeno hemostático en frío ACSF. Mantenga la espuma húmeda con pinzas y coloque sobre el cráneo delgado. Permita que se sientan en el cráneo fino de unos 30 s para detener cualquier micro sangrados de países en desarrollo.
11. Utilice pinzas para colocar un cubreobjetos de vidrio de 4 mm lateralmente sobre la ventana que ha sido adelgazada en el hueso.
12. Use la parte posterior de un algodón pequeño de plástico o de madera aplicador con punta de aplicar aproximadamente 100 μl de acrílico dental en el cráneo para mantener la ventana en su lugar.

3. post quirúrgico cuidado

1. Quitar el mouse del equipo quirúrgico y colóquela en una jaula climatizada para la recuperación. Monitor continuamente hasta que ha recuperado el sentido completo (determinado por el comportamiento, la marcha y movilidad normal).
2. Evaluar los animales dos veces al día durante tres días de manifestaciones de dolor post-quirúrgico, incluyendo disminución de la actividad, aseo personal, alimentación y consumo de agua, vigilancia de comportamiento (por ejemplo, cojera o una postura jorobada) o mayor agresividad. No devolver el animal a la compañía de otros animales hasta que haya recuperado completamente.
3. Administrar la buprenorfina (0.05 – 0.1 mg/kg) por vía subcutánea como un analgésico 8 – 12 h después de la cirugía durante 3 días. Vigilar la zona de la ventana de cerca después de la cirugía para signos de infección, la inflamación y la dehiscencia. Si el animal vuelve a la base de alimentación y aseo personal comportamientos, consulte a un veterinario sobre posibles intervenciones o la eutanasia.

Resultados

Antes de proceder con la cirugía piezoeléctrica, quite cualquier residual periostio del cráneo. Una vez que el cráneo es liso y opaco (Figura 1a), el cirujano puede comenzar la cirugía piezoeléctrica. Al retirar el hueso con la punta vibrante del piezoeléctrico, es fundamental regar el cráneo con hielo frío ACSF. Riego adecuado se logra cuando la inferior 1 mm de la punta se sumerge en la ACSF (Figura 1b). Sin la adecuada irrigación, el hueso se sobrecalentar y dañar el cerebro. Después de que el cráneo ha sido adelgazado a la profundidad deseada por el cirujano, puede haber algún sangrado residual de los vasos sanguíneos situados en el hueso. Para rápidamente dejar todo sangrado, aplique un trozo pequeño de 1 mm de espuma de colágeno empapado en ACSF a la zona de la ventana. Deje el colágeno en el cráneo de aproximadamente 30 s (figura 1C). Después de retira la espuma de colágeno, la ventana aparece translúcida, que permite la clara visualización de los vasos sanguíneos en la duramadre. Dura será intacta sin hematomas importantes. (Figura 1 d). Si el dura aparece roja e inflamada, es probable debido a los vasos sanguíneos rotos de demasiada presión sobre la punta durante la cirugía. Para proteger la ventana de nuevo y prepararnos para la proyección de imagen de crónica, se debe colocar un cubreobjetos de cristal sobre el área. Un cubreobjetos de vidrio correctamente aplicada se sentará suavemente encima de la ventana y no causará ningún daño a la zona. Cubreobjetos vidrio debe cubrir la ventana entera. Si el cubreobjetos de vidrio se aplica correctamente en el cráneo, la ventana permanecerá transparente bajo el vidrio. Todos los vasos sanguíneos de la duramadre seguirá siendo visible (Figura 1e). Acrílico dental debe ser aplicado alrededor de lo cubreobjetos de cristal cumplir permanentemente la superficie del cráneo. También deben cubrir los bordes del cubreobjetos vidrio acrílico dental (figura 1f).

Se encontró que la cirugía piezoeléctrica es típicamente mucho más rápida que una tradicional ventana craneal, tomando alrededor de 10-12 minutos por cirugía (figura 2A). También se encontró que hubo menos complicaciones debido a la dura hematomas y sangrado según lo observado por el ojo (figura 2B). Una ventana adecuadamente preparada permitirá la proyección de imagen multifotón de indicadores fluorescentes en neuronas corticales en vivo. Elegimos el indicador rojo calcio JRGECO1a en cuerpos celulares de las neuronas corticales de la capa 4 de la imagen (Figura 3A-3B). Pudimos observar a oscilaciones de calcio en estos cuerpos de la célula a través de la ventana con FASORES.

Figura 1: cirugía piezoeléctrica. (a) el cráneo después de que ha sido adecuadamente preparado para fasor. Se ha eliminado todo el tejido perióstico, dejando una superficie lisa y limpia. (b) una imagen representativa del fasor en progreso. La parte inferior 1 mm de la vibrante punta quirúrgica está sumergido en el hielo frío ACSF. El líquido se aplica en el cráneo a un ritmo de 1 mL/min. Un movimiento circular ligero se aplica en el cráneo y el hueso se adelgaza mediante vibraciones ultrasónicas. (c) después de que el cráneo ha sido adelgazado, una pieza circular de 1 mm de espuma de colágeno empapado en frío que ACSF se permite descansar en la ventana para detener cualquier sangrado micro del hueso. (d) una ventana exitosa con una dura transparente muestra todos los vasos intactos. Hay no hay daños visibles o contusiones en la superficie del cerebro. (e) un cubreobjetos de cristal se coloca sobre la ventana para proteger la superficie del cerebro. acrílico Dental (f) se aplica en el cráneo para fijar permanentemente el cubreobjetos de cristal sobre la ventana. La escala de 1 mm en todas las imágenes de la barra.

Figura 2. Comparación de tasa de éxito en la formación de fasor o dental del taladro cirugía. (A) tiempo promedio por cirugía fue menor para el fasor cirugías taladro dental (p < 0.05, prueba de t de cola dos) n = 30 cirugías por grupo y promedio 10 cirugías por cirujano. (B) el porcentaje de cirugías exitosas (definido como ningún daño visible o sangrado al dura según lo observado por el ojo del cirujano a través del objetivo para zoom X 350) fue superior para el fasor taladro dental cirugía (n = 30 cirugías para cada grupo, una prueba de z de cola). Barras de error indican SD

Figura 3. Multifotón imágenes en vivo a través de una ventana craneal adelgaza con FASORES. (A) calcio transitorios observados con el indicador rojo calcio JRGECO1a se reflejada en neuronas piramidales de la capa 4 en corteza motora murinos in vivo. Barra de escala = 100 μm. (B) la misma ventana pero diferentes regiones de la corteza de motor de capa 4. Headfixed mouse con ventana de 3 mm con FASORES. Barra de escala = 30 μm. reflejada con un microscopio multifotón, objetivo 40 X, la longitud de onda de excitación 1040 nm.

Discusión

La cirugía puede modificarse cambiando la punta quirúrgica. Hay muchos diversos tamaños de punta que se puede aplicar a la pieza de mano. Cambiar el tamaño o la forma de la punta se traducirá en diferentes grandes ventanas. Además de la punta de 4 mm, también intentó una punta de 3 mm y encontró también funcionó bien. Incluso con riego de hielo frío ACSF, no fuimos capaces de obtener buenos resultados con consejos que eran demasiado estrechas (aproximadamente 0,25 mm) debido a las vibraciones concentradas causando demasiado calor y quema el hueso que lleva al daño a la duramadre subyacente. No hemos intentado la multitud de otros consejos que están disponibles, y esperamos que otros laboratorios puedan encontrar nuevas aplicaciones para estos consejos diferentes. Mientras que la cirugía es relativamente sencilla, encontramos que hay varios pasos que pueden requerir la solución de problemas. La primera es que la punta vibrante produce mucha turbulencia en la ACSF, que produce dificultad en determinar la profundidad del hueso durante el paso de la cirugía de reducción del hueso y disminuye la visibilidad. Recomendamos que si es muy difícil ver lo delgado el hueso es, tomar un descanso para secar el cráneo y la ventana aplicando un hisopo de algodón estéril en la parte del hueso. No aplique el aplicador de algodón directamente a la ventana, ya que la superficie rugosa es perjudicial para el hueso fino. Después de comprobar la profundidad, aplicar ACSF y continuar con la cirugía. También se encontró que si existe daño a la duramadre, es generalmente debido al cirujano poner demasiada presión en la punta. Sosteniendo la pieza de mano más suavemente y aplicar menos fuerza probablemente se solucionará este problema. Si el cirujano es raspado por la fuerza la punta del hueso, que causa una rotura en el hueso fino y dañar el cráneo. Por último, si después de adelgazamiento del hueso, el dura subyacente aparece magullado, es probablemente debido al exceso de calor de las vibraciones. Aumentando la tasa de flujo de la ACSF solucionará este problema.

La principal limitación del fasor es que la pieza de mano puede enrarecer el hueso, pero no puede quitar el hueso sobre la duramadre. La punta de diamante recubierto tiene pequeñas protuberancias ásperas. El roce necesario para diluir el cráneo sería desgastar la dura y causar sangrado si se utiliza para quitar el hueso. Así, el uso de fórceps es necesaria para eliminar la fina capa restante. Mientras que hay discusión en curso sobre si la proyección de imagen a través de un cráneo fina produce menos inflamación y menos proliferación de microglia y astrocitos reactivos, en algunos casos una ventana sin hueso restante es preferida, por ejemplo, para proporcionar una mayor profundidad de imagen³ .

Hemos optimizado la preparación de ventana craneal imagen multifotón en ratones. Fasor es, a nuestro conocimiento, la primera aplicación de la técnica piezoeléctrica a la cirugía de roedores ventana craneal para la proyección de imagen óptica. Encontramos que el uso de la cirugía piezoeléctrica en ratones comparte las ventajas del aumento de la velocidad y disminución de eventos adversos registrados también en los seres humanos^7,8,9,10. Utilización del dispositivo piezoeléctrico dio lugar a cirugías más rápidas (figura 2A) y menos eventos adversos de sangrado comparado con una alta velocidad rotatoria del taladro (figura 2B). También encontramos, dentro de nuestro laboratorio, que fasor era más fácil para los nuevos cirujanos de aprender que los enfoques tradicionales para cirugía craneal ventana. Ventajas de la velocidad y facilidad de uso están probable que difieran entre los cirujanos. Preparaciones de cráneo fina requieren típicamente 30-45 min para adelgazar el hueso con un taladro y bisturí², mientras que el enfoque de fasor normalmente requiere menos de 10 minutos.

Encontramos que en windows con FASORES podríamos imagen transitorios del calcio en neuronas piramidales de la capa 4 en la corteza de motor que habían sido transfectadas con virus adeno asociado codificación del indicador de calcio JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). también encontramos que, en comparación con una ventana craneal cráneo fino preparada con un taladro y un bisturí, la proyección de imagen de la región era más grande, mientras que un cráneo fino elaborado con un taladro y bisturí tiene una ventana de proyección de imagen de 20 μm de diámetro² . Con FASORES, pudimos rápidamente fina una superficie de 3-4 mm. Esto es similar a la ventana de proyección de imagen divulgada con puertos⁴. Esta ventana más grande conserva el beneficio de la proyección de imagen rápida para windows delgada del cráneo con un taladro dental y bisturí. Además, la ventana con FASORES puede ser reflejada inmediatamente, en lugar de deshuese tradicional windows que requieran semanas para sanar antes de que la ventana puede ser óptimo imagen³.

Esta técnica puede aplicarse para estudiar alteraciones en el flujo sanguíneo en los vasos debajo de la duramadre. Un importante estudio es comparar el immunoreactivity de fasor con otros métodos de ventana craneal. Esto sería importante para determinar si el fasor produce menos inflamación en comparación con los métodos existentes. Esperamos que la técnica quirúrgica piezoeléctrica documentada aquí permitirá que más laboratorios realizar ventanas craneales y utilizar con éxito en vivola proyección de imagen multifotón.

Asegúrese de que la pieza de mano es vibrar en la posición más baja y que la ACSF es ser irrigado con una velocidad constante. El frío del hielo que se debe aplicar constantemente la ACSF o se calientan y dañar la duramadre. Encontramos que la ACSF debe aplicarse a una velocidad de al menos 1 mL/min puede utilizar una jeringa en la mano, o usar una bomba peristáltica, en lugar de la irrigación incorporada en la pieza de mano. El sistema de irrigación en la pieza de mano expulsa ACSF con demasiada fuerza y produce mucha turbulencia, lo que afectará significativamente la visibilidad.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Bruker
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core