Piezo haute précision ablation chirurgicale osseuse (PHASOR) : Une Technique pour la chirurgie de la meilleure fenêtre crânienne chez les souris

Résumé

Chirurgie piézoélectrique a permis d’améliorer en chirurgie maxillo-faciale et dentaire humaine. Nous avons développé un protocole visant à optimiser la chirurgie piézoélectrique pour la chirurgie de fenêtre crânienne chez les souris.

Résumé

La microscopie multiphoton a été largement adaptée imagerie neurones in vivo. L’imagerie répété nécessite l’implantation d’une fenêtre crânienne ou amincissement répétées du crâne. Chirurgie fenêtre crânienne est généralement effectuée avec une foreuse rotative haute vitesse, et de nombreux chercheurs trouvent difficile d’éviter que la perceuse endommagent la dure-mère délicat et les vaisseaux sanguins. Pratique et une formation approfondie est nécessaire pour enlever l’OS sans endommager les tissus sous-jacents et donc chirurgie fenêtre crânienne peut être difficile, chronophage et produire des lésions tissulaires. Chirurgie piézoélectrique, ce qui est largement utilisée pour la chirurgie maxillo-faciale et dentaire, utilise des vibrations ultrasoniques pour enlever les os sans endommager les tissus mous. Nous avons développé une méthode application chirurgie piézoélectrique pour améliorer la chirurgie fenêtre crânienne chez les souris en préparation pour l’imagerie multiphoton. Comparaisons au sein de notre laboratoire de trouvent que la méthode nécessite moins de temps à la chirurgie et a un baisse du taux moyen de complications dues à une hémorragie dural que la chirurgie crânienne fenêtre avec une foreuse rotative.

Introduction

Chirurgie de fenêtre crânienne pour préparer les rongeurs multiphoton imagerie in vivo est devenu une technique importante en neurosciences. Le déplacement ou l’amincissement des os est nécessaire pour préparer la souris optique d’imagerie avec un microscope multiphoton. Cette intervention est effectuée en supprimant complètement une zone osseuse pour exposer le sous-jacent dura¹ou par une région d’OS sans suppression totale de la dura²une éclaircie. L’approche de crâne mince peut produire moins d’inflammation et activation des microglies³ mais offre une profondeur de l’image, une taille plus petite de la fenêtre d’imagerie (200 µm) et une période de temps limitée au cours de laquelle la fenêtre peut être photographiée en raison de la repousse osseuse² . L’ajout d’une fenêtre en verre poli et renforcée (PoRTS) peut augmenter la taille d’imagerie et la période d’imagerie mais est difficile à réaliser⁴.

Les deux chirurgies actuels permet un forage rotatif haute vitesse mince ou enlever l’os du crâne. La technique de crâne mince utilise également un scalpel après la perceuse pour fluidifier davantage l' OS². La technique de PoRTS nécessite une étape supplémentaire de polissage à grain⁴à grande vitesse. Dans une grande vitesse perceuse rotative, une turbine à air propulsé ou moteur électrique entraîne le foret de tourner à une vitesse élevée. Foreuses rotatives section OS et des tissus mous, il y a un risque d’endommager la dure-mère et qui sous-tendent les vaisseaux sanguins. Le succès de la chirurgie dépend de l’habileté du chirurgien. En plus de ces fenêtres, préparés avec des méthodes chirurgicales mécaniques, une méthode chimique d’optiquement le crâne avec différentes solutions de compensation a été développé^5,6. Toutefois, étant donné que la chirurgie piézoélectrique est une méthode mécanique de la chirurgie, nos comparaisons ici sera limités à d’autres méthodes mécaniques.

Appareils chirurgicaux piézoélectriques utilisent des vibrations ultrasoniques pour briser les os minéralisés sans endommager les tissus mous sous-jacent et offrent ainsi une approche pour mince rapidement une grande surface de l’OS. Dans une pièce à main chirurgie piézoélectrique, la turbine est remplacée par une pile de disques en céramique et lorsque le courant est appliqué, les disques vibrent à des fréquences ultrasoniques. Les vibrations sont transférées par le biais de la pièce à main à diamant conseils enduits pour couper à travers l’OS sans endommager les tissus mous, un avantage sur les perceuses rotatives qui ne soient pas discriminatoires entre les types de tissus. Chirurgie piézoélectrique a été initialement développée pour une utilisation chez l’homme de Tomaso Vercellotti et a conduit à des améliorations en dentaire et cranio-maxilofacial chirurgie^7,8,9,10,11 .

La chirurgie piézoélectrique a été utilisée pour créer une ostéotomie chez des rats Wistar et a été trouvée par l’imagerie par résonance magnétique (IRM) et l’histologie à produire beaucoup moins de dégâts qu’une fraise dentaire traditionnel¹². Les auteurs ont conclu que chirurgie piézoélectrique était assurée pour enlever l’OS près de tissu cérébral doux. Souris, cependant, ont un dura plus mince qui est endommagé plus facilement, et cette étude n’a pas préparé de windows pour l’imagerie optique chronique. L’imagerie chronique exige que les vaisseaux sanguins ne sont pas endommagés et que les caillots sanguins ne font pas sous la fenêtre. Dommages à la dure-mère mène à l’inflammation que provoque la fenêtre nuage, et active les cellules microgliales et la multiplication des astrocytes réactifs. Ici, nous avons optimisé la chirurgie piézoélectrique pour la souris créer des crâne mince et OS complet windows crânienne enlèvement adapté pour l’imagerie chronique. Nous avons comparé cette technique chirurgicale aux chirurgies de fenêtre crânienne préparé avec une foreuse rotative haute vitesse.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été réalisés selon les normes fixées par le Columbia University Medical Center institutionnels animalier et le Comité d’utilisation (IACUC). L’euthanasie a été effectuée par l’intermédiaire de dislocation cervicale sous anesthésie à la kétamine 100 mg/kg et xylazine 10 mg/kg par injection intrapéritonéale. Toutes les interventions chirurgicales ont été réalisés de façon stérile (chirurgien portait la tête cap, masque facial, des gants stériles et blouse jetable propre) et instruments chirurgicaux ont été stérilisés entre chaque utilisation.

1. faites étapes

1. Stériliser tous les instruments chirurgicaux afin d’assurer la stérilité.
2. Anesthésier souris C57bl6 à l’isoflurane (4 % pour l’induction et 1,5 à 2 % pour la chirurgie). Pincez l’orteil postérieur toutes les 10 min pour assurer la bonne profondeur de l’anesthésie. Augmenter l’anesthésie si rétraction vocalisation ou membre postérieur est observée.
3. Appliquer du lubrifiant oculaire vétérinaire pour les yeux pour éviter le dessèchement.
4. Enlever les cheveux sur le cuir chevelu avec une application de 3 min de gel d’enlèvement de cheveux ou de rasage avec un rasoir électrique.
5. Placez votre souris dans le cadre stéréotaxique sur un coussin chauffant ou une couverture de recirculation calibré eau réglé à 38° C.
6. Administrer la buprénorphine (0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée pour fournir une analgésie préopératoire.
7. Désinfecter le cuir chevelu avec trois applications alternées de chlorhexidine ou de bétadine et d’éthanol à 70 % à l’aide d’un applicateur à bout de coton.
8. Injecter 100 mL de bupivacaïne diluée 50 % dans une solution saline sous le cuir chevelu pour fournir une anesthésie locale.

2. piézoélectrique fenêtre crânienne chirurgie

1. À l’aide d’instruments chirurgicaux stériles stérilisés à l’autoclave, supprimer un cercle de 1 cm du cuir chevelu sur le crâne en coupant avec des ciseaux chirurgicaux dans un motif circulaire. Soulevez le cuir chevelu sur le crâne, exposant ainsi le tissu du périoste sur l’OS.
2. Utiliser la pointe de la pince à gratter l’OS exposé clair de n’importe quel tissu de périoste restant. C’est important de s’assurer que le ciment dentaire ne tombera plus tard.
3. Régler l’unité de chirurgie piézoélectrique à vibrer sur le réglage le plus bas. Notez que des paramètres plus élevés peuvent se briser les vaisseaux sanguins en raison des vibrations intenses.
4. Fixer l’extrémité circulaire stérile à la pièce à main.
   Remarque : L’extrémité circulaire de 4 mm est bien adaptée pour les interventions chirurgicales. La taille de la grande pointe contribue à la vitesse de la chirurgie comme la fenêtre entière peut être amincie en même temps.
5. Remplir une seringue de 10 mL de glace froide liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) et tenez-le dans la main ne possédant ne pas la pièce à main piézoélectrique.
6. Irriguer le crâne par dégoulinant le FSCA de la seringue sur le crâne à un débit de 1 mL/min. par ailleurs, utiliser une pompe péristaltique positionnée sur le crâne pour libérer l’utilisation de l’autre main.
   Remarque : Irrigation avec FSCA froid est importante pour éviter la surchauffe due à la friction des haute fréquence de vibrations.
7. Appliquer doucement la pointe vibrante chirurgicale sur le crâne avec un léger mouvement circulaire (3 cercles par 1 s) et mince de l’os à la profondeur voulue pour effectuer une préparation de crâne mince (5 à 10 min).
   NOTE : Ici, 4 mm fenêtres ont été faites qui ont été éclaircis à 20 µm. Toutefois, la taille de la fenêtre peut varier avec la taille de la pointe de la chirurgie. L’épaisseur de l’OS peut être ajustée à la profondeur désirée, basée sur la longueur du temps passé en l’appliquant sur le crâne.
8. Doucement, ajustez l’angle de la pièce à main et changer l’angle de la pointe tout en exerçant une pression sur le crâne pour fluidifier le crâne uniformément.
9. Pour effectuer une suppression complète sans laisser n’importe quel OS minces derrière, mince l’OS jusqu'à ce que les fissures sont visibles autour de la zone de fenêtre. Retirer les flocons restants des os minces avec une pince sans endommager la dure-mère sous-jacente.
10. Tremper un morceau de 1 mm de mousse de collagène hémostatique dans FSCA froid. Tenez la mousse humide avec une pince et placez-le sur le crâne mince. Laissez-le s’asseoir sur le crâne mince pendant environ 30 s pour arrêter n’importe quel micro saigne des pays en développement.
11. Forceps permet de placer une lamelle de verre de 4 mm latéralement sur la fenêtre qui a été amincie dans l’OS.
12. Utilisez le dos d’un petit coton en plastique ou en bois à bout applicateur pour déposer environ 100 µL d’acrylique dentaire dans le crâne pour maintenir la fenêtre en place.

3. publier Surgical Care

1. Retirez l’appareil chirurgical de la souris et le placer dans une cage chauffée pour la récupération. Moniteur en permanence jusqu'à ce qu’elle a retrouvé la pleine conscience (estimée par le comportement, la démarche et mobilité normale).
2. Évaluer les animaux deux fois par jour pendant trois jours pour les manifestations de la douleur post-chirurgicale y compris diminution de l’activité, toilettage, nourriture et consommation d’eau, gardiennage de comportement (p. ex. boiterie ou une posture voûtée) ou augmenté l’agression. Ne retournez pas l’animal à la compagnie d’autres animaux, jusqu'à ce qu’elle a entièrement récupéré.
3. Administrer la buprénorphine (0,05 à 0,1 mg/kg) par voie sous-cutanée comme un analgésique 8 à 12 h après l’opération pendant 3 jours. Surveiller la zone de la fenêtre qui suit de près la chirurgie pour la déhiscence, inflammation et signes d’infection. Si l’animal ne retourne pas de ligne de base d’alimentation et les comportements de toilettage, consultez un vétérinaire concernant les interventions possibles ou l’euthanasie.

Résultats

Avant de procéder à une chirurgie piézoélectrique, enlever tout résidu périoste du crâne. Une fois que le crâne est opaque et lisse (Figure 1 a), le chirurgien peut commencer la chirurgie PIEZOELECTRIQUE. Lors de l’enlèvement d’avec la pointe de piezo vibrant, il est primordial pour irriguer le crâne avec de la glace froide fsca. Irrigation appropriée est obtenue lorsque le fond de 1 mm de la pointe est submergé dans le FSCA (Figure 1 b). Sans irrigation appropriée, l’OS vont surchauffer et endommager le cerveau. Après que le crâne a été aminci à la profondeur voulue, choisie par le chirurgien, il peut y avoir des saignements résiduels des vaisseaux sanguins situés dans l’OS. Pour rapidement mettre fin à tous les saignements, appliquez un morceau de petite 1 mm de collagène mousse imbibé de FSCA vers la zone de la fenêtre. Laisser le collagène sur le crâne pendant environ 30 s (Figure 1C). Après avoir retiré la mousse de collagène, la fenêtre apparaît translucide, ce qui permet une visualisation claire des vaisseaux sanguins dans la dure-mère. La dure-mère sera intacte sans ecchymose importante. (Figure 1d). Si la dure-mère apparaît rouge et enflammée, il est probable en raison de la rupture de vaisseaux sanguins de trop de pression appliquée à la pointe pendant la chirurgie. Pour protéger la nouvelle fenêtre et préparez-la pour l’imagerie chronique, une lamelle de verre doit être placée sur la zone. Une lamelle de verre est appliqué correctement siégera doucement sur le dessus de la fenêtre et ne causera pas de dommages dans la région. La lamelle de verre doit couvrir la fenêtre entière. Si la lamelle de verre est correctement appliquée sur le crâne, la fenêtre reste translucide sous le verre. Tous les vaisseaux sanguins de la dure-mère sera toujours visible (Figure 1e). Acrylique dentaire doit être appliqué autour de la lamelle de verre il respecte en permanence à la surface du crâne. Les bords de la lamelle de verre doivent également être couverts en acrylique dentaire (Figure 1f).

Nous avons trouvé que la chirurgie piézoélectrique est généralement beaucoup plus rapide qu’une fenêtre crânienne traditionnelle, prenant environ 10-12 min par chirurgie (Figure 2 a). Nous avons aussi constaté qu’il y avait moins de complications dues à une dura des ecchymoses et des saignements tel qu’observé par le œil (Figure 2 b). Une fenêtre correctement préparée permettra imagerie multiphoton des indicateurs fluorescents dans les neurones corticaux in vivo. Nous avons choisi pour l’image de l’indicateur de calcium rouge JRGECO1a dans les corps cellulaires des neurones corticaux de couche 4 (Figure 3 a-3 b). Nous avons pu observer des transitoires de calcium dans ces corps cellulaires à travers la fenêtre préparé à l’aide de phaseur.

Figure 1 : chirurgie PIEZOELECTRIQUE. (a) le crâne après qu’il a été correctement préparé pour phaseur. Tous les tissus périostique a été supprimé, laissant une surface lisse et propre. (b) une image représentative de phaseur en cours. Le fond de 1 mm de la vibration Astuce chirurgicale est immergée dans la glace froide fsca. Le liquide est appliqué sur le crâne à un débit de 1 mL/min. Un léger mouvement circulaire est appliqué sur le crâne et l’os sont aminci par vibrations ultrasoniques. (c) après que le crâne a été aminci, une pièce circulaire de 1 mm de mousse de collagène imbibé de froid que FSCA est autorisé à s’asseoir sur la fenêtre pour arrêter les saignements de n’importe quel micro de l’OS. (d) une fenêtre réussie avec une dura translucide affiche tous les vaisseaux sanguins intacts. Il y a pas de dommages visibles ou des contusions à la surface du cerveau. e une lamelle de verre est placée au-dessus de la fenêtre pour protéger la surface du cerveau. acrylique dentaire (f) est appliquée sur le crâne de fixer définitivement la lamelle de verre sur la fenêtre. L’échelle bar 1 mm dans toutes les images.

Figure 2. Comparaison des taux de réussite dans la formation de phaseur ou dentaires percer la chirurgie. (A) temps moyen par chirurgie était inférieur de phaseur fraise dentaire chirurgies (p < 0,05, deux test de queue t) n = 30 chirurgies par groupe et 10 chirurgies par chirurgien en moyenne. (B), le pourcentage des cabinets de consultation réussis (définie comme aucun dommage visible ou de saignement à la dure-mère tel qu’observé par le œil du chirurgien par le biais de l’objectif fixé à 350 zoom X) était supérieur de phaseur fraise dentaire chirurgies (n = 30 chirurgies pour chaque groupe, un test de z à queue). Barres d’erreur afficher SD

La figure 3. Multiphoton imagerie in vivo par une fenêtre crânienne diluée à phaseur. (A) Calcium transitoires observés avec l’indicateur de calcium rouge JRGECO1a ont été photographiés dans les neurones pyramidaux couche 4 dans le cortex de moteur murins in vivo. Echelle = 100 µm. (B) la même fenêtre mais une région différente du cortex moteur couche 4. Headfixed souris avec fenêtre de 3 mm préparé avec phaseur. Echelle = 30 µm. imagés avec un microscope multiphotonique, objectif 40, 1040 nm excitation longueur d’onde.

Discussion

La chirurgie peut être modifiée en changeant la pointe chirurgicale. Il y a beaucoup de différentes tailles de pointe qui peuvent être appliqués à la pièce à main. Changer la taille ou la forme de la pointe se traduira par des fenêtres de tailles différentes. En plus de l’extrémité de 4 mm, nous avons aussi essayé une mèche de 3 mm et trouvé que cela a fonctionné aussi bien. Même avec l’irrigation avec de la glace froide ACSF, nous n’étions pas en mesure d’obtenir de bons résultats avec des conseils qui ont été trop étroit (environ 0,25 mm) en raison des vibrations concentrées causant trop de chaleur et la gravure conduisant aux dommages causés à la dure-mère sous-jacente. Nous n’avons pas essayé la multitude d’autres conseils qui sont disponibles, et nous prévoyons que d’autres laboratoires peuvent trouver de nouvelles applications pour ces différents conseils. Alors que la chirurgie est relativement simple, nous avons constaté qu’il y a plusieurs étapes nécessitant un dépannage. La première est que la pointe vibrante produit beaucoup de turbulence dans l’ACSF, qui diminue la visibilité et produit des difficultés pour déterminer la profondeur de l’OS pendant l’OS amincissement étape de la chirurgie. Nous recommandons que si il est trop difficile de voir comment l’os sont, faites une pause pour sécher le crâne et la fenêtre en appliquant un coton-tige stériles sur le côté de l’OS. Ne pas appliquer le coton tige directement à la fenêtre, car la surface rugueuse est préjudiciable aux os minces. Après avoir vérifié la profondeur, réappliquez FSCA et continuer avec la chirurgie. Nous avons également constaté que s’il y a des dommages à la dure-mère, il découle habituellement le chirurgien met trop de pression sur la pointe. Tenant la pièce à main plus doucement et demande moins de force seront normalement résoudre ce problème. Si le chirurgien est grattée par la force la pointe sur l’OS, elle va provoquer une rupture dans l’OS minces et endommager le crâne. Enfin, si après une éclaircie de l’OS, la dure-mère sous-jacente apparaît meurtrie, il est probable en raison de l’excès de chaleur les vibrations. Augmente la vitesse d’écoulement de l’ACSF corrigera ce problème.

La principale limitation de phaseur est que la pièce à main peut mince de l’OS, mais qu’il ne peut pas enlever tous les os sur la dure-mère. L’extrémité enduite de diamant a des petites bosses rugueuses. Le frottement nécessaire pour fluidifier le crâne s’abraser la dure-mère et provoquer des saignements si elle était utilisée pour supprimer tous les os. Ainsi, l’utilisation de forceps est nécessaire pour enlever la couche mince restante. Bien qu’il y a débat en cours sur si l’imagerie grâce à un crâne mince produit moins d’inflammation et moins la prolifération des cellules microgliales et astrocytes réactifs, dans certains cas une fenêtre avec aucun os restant est préférée, par exemple, pour fournir une plus grande profondeur de l’imagerie³ .

Nous avons optimisé la préparation fenêtre crânienne pour l’imagerie multiphoton chez la souris. PHASEUR est, à notre connaissance, la première application de technique piézoélectrique pour chirurgie de rongeurs fenêtre crânienne pour l’imagerie optique. Nous constatons que l’utilisation de la chirurgie piézoélectrique chez les souris partage les avantages d’une vitesse accrue et diminue les effets indésirables signalés également dans les humains^7,8,9,10. Utilisation du dispositif piézoélectrique a donné lieu à des chirurgies plus rapides (Figure 2 a) et effets indésirables moins de saignement par rapport à un rotatif à grande vitesse de forage (Figure 2 b). Nous avons également constaté, au sein de notre laboratoire, que phaseur était plus facile pour les chirurgiens nouvelles d’apprendre que les approches traditionnelles de la chirurgie de fenêtre crânienne. Avantages de la vitesse et la facilité d’utilisation sont susceptibles de différer entre les chirurgiens. Préparations de crâne mince nécessitent des 30-45 min pour fluidifier l’OS avec une perceuse et scalpel², tandis que l’approche phaseur requiert généralement moins de 10 min.

Nous avons constaté que dans windows préparés avec phaseur nous pourrions image transitoires de calcium dans les neurones pyramidaux couche 4 dans le cortex de moteur qui ont été transfectées avec adeno associé virus codant l’indicateur de calcium JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). nous avons également constaté que, par rapport à une fenêtre crânienne crâne minces préparée avec une perceuse rotative et le bistouri, la région d’imagerie a été plus grande, tout en un crâne mince préparé avec une foreuse rotative et bistouri a une fenêtre d’imagerie de 20 µm de diamètre² . Avec phaseur, nous avons pu rapidement mince a une superficie de 3-4 mm. Ceci est similaire à la fenêtre d’imagerie rapportée avec PoRTS⁴. Cette plus grande fenêtre conserve le bénéfice de l’imagerie rapide pour windows de crâne minces préparées avec une fraise dentaire et bistouri. En outre, la fenêtre préparée avec phaseur peut être photographiée immédiatement, par opposition au retrait traditionnel os windows qui peuvent exiger des semaines pour guérir avant que la fenêtre peut être optimale imagé³.

Cette technique peut être appliquée à l’étude des modifications du débit sanguin dans les vaisseaux sous la dure-mère. Une importante étude future consiste à comparer l’immunoréactivité de phaseur avec d’autres méthodes de fenêtre crânienne. Ce serait important pour déterminer si le phaseur produit moins l’inflammation en comparaison avec les méthodes existantes. Nous espérons que la technique chirurgicale piézoélectrique documentée ici permettront plus labs pour exécuter windows crâniennes et utilisent avec succès multiphoton imagerie in vivo.

Assurez-vous que la pièce à main est mis à vibrer sur le réglage le plus bas et que le FSCA est être irriguée à un rythme constant. Le froid glace QU'ACSF s’impose sans cesse ou il va chauffer et endommager la dure-mère. Nous avons trouvé que le FSCA doit être appliqué à un taux d’au moins 1 mL/min soit utiliser une seringue qui s’est tenue dans la main, ou utiliser une pompe péristaltique, plutôt que l’irrigation intégrée dans la pièce à main. Le système d’irrigation dans la pièce à main éjecte FSCA avec trop de force et produit trop grande turbulence, ce qui gênerait considérablement la visibilité.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Bruker
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core