Piezo de alta precisão Osteal extirpação (PHASOR): Uma técnica para cirurgia melhorada janela Cranial em ratos

Resumo

Cirurgia piezoeléctrica conduziu-se a melhorias em cirurgia maxilo-facial e dental humana. Temos desenvolvido um protocolo para otimizar a cirurgia piezoelétrica para cirurgia craniana janela em camundongos.

Resumo

Microscopia do multiphoton foi amplamente adaptada para imagem neurônios na vivo. Imagem repetida requer a implantação de uma janela cranial ou repetidas afinamento do crânio. Cirurgia craniana janela é normalmente realizada com uma broca rotativa de alta velocidade, e muitos investigadores encontrar desafio para evitar que a broca de danificar o delicado dura-máter e os vasos sanguíneos. Prática e treinamento extensivo é necessária para remover o osso sem dano ao tecido subjacente e assim cirurgia craniana janela pode ser difícil, demorada e produzir danos nos tecidos. Cirurgia piezoeléctrica, que é amplamente utilizada para cirurgia maxilo-facial e dental, utiliza vibrações ultra-sônicas para remover o osso sem danificar os tecidos moles. Nós desenvolvemos um método de aplicação piezoelétrica cirurgia para melhorar a cirurgia craniana janela em camundongos em preparação para a imagem latente do multiphoton. Comparações dentro de nosso laboratório de acham que o método requer menos tempo de cirurgia e tem uma baixa taxa média de complicações devido a sangramento dural que a cirurgia craniana janela com uma broca rotativa.

Introdução

Cirurgia craniana janela para preparar roedores multiphoton imagem latente na vivo tornou-se uma técnica importante em neurociência. A remoção ou enfraquecimento dos ossos é necessário preparar o mouse para a imagem latente ótica com um microscópio do multiphoton. Esta cirurgia é realizada removendo completamente uma área de osso para expor a dura-máter subjacente¹ou diluindo-se uma região do osso sem remoção completa do dura². A abordagem de crânio fina pode produzir menos inflamação e ativação da microglia³ mas fornece uma profundidade de imagem, um tamanho menor de janela de imagem (200 µm) e um período de tempo limitado durante o qual a janela pode ser fotografada devido à regeneração óssea² . A adição de uma janela de vidro polido e reforçado (portas) pode aumentar o tamanho de imagem e período de imagem, mas é difícil de executar⁴.

Ambas as cirurgias atuais usam uma broca rotativa de alta velocidade para diluir ou remover o osso do crânio. A técnica de crânio fina também usa um bisturi após a broca para diluir ainda mais o osso². A técnica de portas exige a etapa extra de polimento com grão⁴de alta velocidade. Em uma alta velocidade rotativos, uma turbina de ar alimentado ou motor elétrico faz com que a broca a girar a uma velocidade alta. Como brocas rotativas seção tanto osso e tecido mole, há um risco de danificar a dura-máter e subjacentes dos vasos sanguíneos. O sucesso da cirurgia depende da habilidade do cirurgião. Além destas janelas preparadas com métodos cirúrgicos mecânicos, um método químico de opticamente limpando o crânio com diferentes soluções tem sido desenvolvidos^5,6. No entanto, desde cirurgia piezoelétrica é um método mecânico de cirurgia, nossas comparações aqui será limitadas a outros métodos mecânicos.

Piezoelétricos dispositivos cirúrgicos utilizam vibrações ultra-sônicas para quebrar osso mineralizado sem danificar tecidos moles subjacentes e assim, oferecem uma abordagem para desbastar rapidamente uma grande área de osso. Em uma peça de mão cirúrgica piezoelétrica, a turbina é substituída por uma pilha de discos de cerâmica e quando a corrente é aplicada, os discos vibram em frequências ultra-sônicas. As vibrações são transferidas através da peça de mão para diamante revestidas dicas para cortar o osso sem danificar os tecidos moles, uma vantagem sobre brocas rotativas que não discriminar entre os tipos de tecido. Cirurgia piezoeléctrica foi originalmente desenvolvida para uso em humanos por Tomaso Vercellotti e conduziu a melhorias na dental e cranio-maxilofacial cirurgia^7,8,9,10,11 .

Piezoelétrica cirurgia tem sido usada para criar uma osteotomia em ratos Wistar e foi encontrada por ressonância magnética (MRI) e histologia para produzir significativamente menos dano do que um tradicional broca dental¹². Os autores concluíram que cirurgia piezoeléctrica era segura para remover o osso perto de tecido cerebral macio. Ratos, no entanto, tem uma dura mais fino que é mais facilmente danificado, e esse estudo não preparou windows para a imagem latente ótica crônica. Imagem de crônica requer que os vasos sanguíneos não sejam danificados e que não formam coágulos de sangue sob a janela. Danos para a dura-máter leva a inflamação que faz com que a janela para a nuvem, e ativa a microglia e a proliferação de astrócitos reativos. Aqui, otimizamos cirurgia piezoeléctrica de ratos para criar tanto fino crânio e osso completo remoção craniana windows apropriado para a imagem latente crônica. Comparamos esta técnica cirúrgica para cirurgias cranianas janela preparado com uma broca rotativa de alta velocidade.

Protocolo

Todos os procedimentos que envolvem animais foram realizados de acordo com as normas definidas pela Columbia University Medical Center institucional Animal Care e Comissão de utilização (IACUC). A eutanásia foi realizada através de deslocamento cervical sob anestesia com cetamina 100mg/kg e xilazina 10 mg/kg, injetados intraperitonealmente. Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados de forma estéril (cirurgião estava usando tampão principal, máscara, luvas estéreis e jaleco descartável limpo) e instrumentos cirúrgicos foram esterilizados entre cada uso.

1. pré-operatória passos

1. Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos para garantir a esterilidade.
2. ANESTHETIZE camundongos C57bl6 com isoflurano (4% para a indução e 1,5-2% para a cirurgia). Aperte o dedo do pé traseiro cada 10 min para assegurar adequada profundidade da anestesia. Aumente a anestesia se vocalização ou membro posterior retração é vista.
3. Aplique lubrificante veterinária olho para os olhos para impedir a secagem.
4. Remova o cabelo sobre o couro cabeludo com um aplicativo de 3 min de gel de remoção de cabelo ou fazer a barba com um barbeador elétrico.
5. Posicione o mouse no quadro estereotáxica em uma almofada de aquecimento ou cobertor de recirculação de água calibrado conjunto de 38° C.
6. Administre a buprenorfina (0,1 mg/kg) por via subcutânea para fornecer analgesia pré-operatória.
7. Desinfecte o couro cabeludo com três aplicações alternadas de clorexidina ou betadine e etanol 70% usando um aplicador de ponta de algodão.
8. Injete 100ml de 50% de bupivacaína diluída em soro fisiológico sob o couro cabeludo para fornecer anestesia local.

2. piezoelétrico janela craniana cirurgia

1. Utilizando instrumentos cirúrgicos estéreis autoclavados, remova um círculo de 1 cm do couro cabeludo sobre o crânio, corte com tesoura cirúrgica em um padrão circular. Levante o couro cabeludo fora do crânio, expondo o tecido periósteo sobre o osso.
2. Use a ponta da pinça para raspar o osso exposto claro de qualquer tecido restante do periósteo. Isto é importante para garantir que o cimento dental não cairá mais tarde.
3. Defina a unidade de cirurgia piezoeléctrica a vibrar na configuração mais baixa. Observe que definições mais elevadas podem quebrar vasos sanguíneos devido a vibrações intensas.
4. Corrigi a ponta circular estéril à peça de mão.
   Nota: A ponta circular de 4mm é bem adequada para cirurgias. O tamanho da ponta grande contribui para a velocidade da cirurgia, como a janela inteira pode ser diluída em simultâneo.
5. Encher uma seringa de 10 mL com gelo frio artificial líquido cefalorraquidiano (ACSF) e segure na mão não segurando o handpiece piezoelétrico.
6. Irrigar o crânio por gotejamento a ACSF da seringa para o crânio em uma taxa de 1 mL/min. como alternativa, usar uma bomba peristáltica, posicionada sobre o crânio para liberar o uso da outra mão.
   Nota: Irrigação com ACSF frio é importante para evitar o sobreaquecimento devido a fricção das vibrações de alta frequência.
7. Aplicar suavemente a ponta vibratória cirúrgica no crânio com um leve movimento circular (3 círculos por 1 s) e fina do osso para a profundidade desejada para realizar uma preparação de crânio fina (5 a 10 min).
   Nota: Aqui, windows 4 mm foram feitas que foram diluídos a 20 µm. No entanto, o tamanho da janela irá variar com o tamanho da ponta cirúrgica. A espessura do osso pode ser ajustada para a profundidade desejada, com base no comprimento de tempo gastado aplicando a ponta no crânio.
8. Delicadamente, ajustar o ângulo da peça de mão e mudar o ângulo da ponta e aplicando pressão no crânio para diluir o crânio uniformemente.
9. Para executar uma remoção óssea completa sem deixar qualquer osso fino atrás, fina do osso até rachaduras são visíveis ao redor da área de janela. Retire os flocos restantes do osso fino com pinça sem danificar a dura-máter subjacente.
10. Mergulhe um pedaço de 1 mm de espuma de colágeno hemostático em ACSF frio. Segure a espuma molhada com pinça e coloque-o sobre o crânio fino. Deixe-o sentar-se no crânio fino por cerca de 30 s para parar qualquer micro sangramentos de se desenvolver.
11. Use fórceps para colocar uma lamela de vidro de 4 mm lateralmente sobre a janela que diluiu-se dentro do osso.
12. Use as costas de um pequeno algodão plástico ou de madeira com ponta aplicadora para aplicar aproximadamente 100 µ l de acrílico dental no crânio para segurar a janela no lugar.

3. pós-cirúrgico cuidados

1. Remova o mouse do aparelho cirúrgico e colocá-lo em uma gaiola aquecida para recuperação. Monitorá-lo continuamente até que recuperou a consciência cheia (avaliada pelo comportamento da marcha e mobilidade normal).
2. Avalie os animais duas vezes por dia por três dias para manifestações de dor pós-cirúrgica, incluindo a diminuição da atividade, aparar, comida e o consumo de água, guardando o comportamento (por exemplo, mancando ou uma postura encurvada) ou aumento da agressão. Não retornam o animal para a companhia de outros animais até que ele se recuperou totalmente.
3. Administrar a buprenorfina (0,05-0,1 mg/kg) por via subcutânea como um analgésico 8 – 12 h após a cirurgia, durante 3 dias. Monitore a área da janela de perto após a cirurgia para sinais de infecção, inflamação e deiscência. Se o animal não retornar à linha de base, alimentação e comportamentos de aliciamento, consulte um veterinário sobre possíveis intervenções ou eutanásia.

Resultados

Antes de prosseguir com a cirurgia piezoeléctrica, remova qualquer residual periósteo do crânio. Uma vez que o crânio é liso e opaco (Figura 1a), o cirurgião pode começar a cirurgia piezoeléctrica. Ao remover o osso com a ponta de piezo vibrando, é fundamental para irrigar o crânio com gelo frio ACSF. Irrigação adequada é alcançada quando a parte inferior a 1 mm da ponta é submerso em ACSF (Figura 1b). Sem irrigação adequada, o osso vai superaquecer e danificar o cérebro. Depois que o crânio diluiu-se a profundidade desejada, escolhido pelo cirurgião, pode haver algum sangramento residual de vasos sanguíneos localizados no osso. Para cessar o sangramento todos rapidamente, aplique um pedaço pequeno de 1 mm de espuma de colágeno embebida em ACSF para a área da janela. Deixe o colágeno sentar-se no crânio para aproximadamente 30 s (Figura 1C). Depois que a espuma de colágeno é removida, a janela aparecerá translúcida, permitindo a visualização clara dos vasos sanguíneos na dura-máter. A dura-máter ficará intacta sem ferimento significativo. (Figura 1D). Se a dura-máter aparece vermelho e inflamado, é provavelmente devido a vasos sanguíneos danificados de demasiada pressão aplicada à ponta durante a cirurgia. Para proteger a nova janela e prepará-lo para a imagem latente crônica, uma lamela de vidro deve ser colocada sobre a área. Uma lamela de vidro devidamente aplicada suavemente irá sentar-se no topo da janela e não causará nenhum dano para a área. A lamela de vidro deve cobrir a janela inteira. Se a lamela de vidro é corretamente aplicada no crânio, a janela permanecerá translúcida sob o vidro. Os vasos sanguíneos na dura-máter ainda será visível (Figura 1e). Dental acrílico deve ser aplicado ao redor da lamela de vidro para permanentemente aderem à superfície do crânio. As bordas da lamela de vidro também devem ser cobertas de acrílico dental (Figura 1f).

Achamos que a cirurgia piezoelétrica é tipicamente muito mais rápida do que um tradicional janela craniana, levando em torno de 10-12 min por cirurgia (Figura 2A). Também achamos que houve menos complicações devido a dura-máter hematomas e hemorragia como observado a olho nu (Figura 2B). Uma janela devidamente preparada permitirá imagens do multiphoton dos indicadores fluorescentes em neurônios corticais em vivo. Escolhemos a imagem o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a em corpos celulares dos neurônios corticais de camada 4 (Figura 3A-3B). Pudemos observar transientes de cálcio nestes corpos celulares através da janela preparado usando FASOR.

Figura 1: cirurgia piezoeléctrica. (um) do crânio, depois que ele foi devidamente preparado para FASOR. Foi removido todo o tecido periosteal, deixando uma superfície lisa e limpa. (b) uma imagem representativa de FASOR em andamento. Parte inferior 1 mm de vibrar o ponta cirúrgica está submersa no gelo ACSF frio. O fluido é aplicado no crânio em uma taxa de 1 mL/min. Um leve movimento circular é aplicado para o crânio e o osso é diluído através de vibrações ultra-sônicas. (c) após diluiu-se no crânio, um pedaço circular de 1 mm de espuma de colágeno embebidas em frio que ACSF é permitido descansar na janela para parar qualquer micro sangramentos do osso. (d), A janela bem sucedida com uma dura translúcido exibe todos os vasos sanguíneos intactos. Não há nenhum dano visível ou arranhão na superfície do cérebro. (e) uma lamela de vidro é colocada sobre a janela para proteger a superfície do cérebro. (f) Dental acrílico é aplicado no crânio para corrigir permanentemente a lamela de vidro sobre a janela. Escala da barra 1 mm em todas as imagens.

Figura 2. Comparação da taxa de sucesso em treinamento para PHASOR ou dental perfurar a cirurgia. (A) tempo médio por cirurgia foi inferior para PHASOR broca dental cirurgias (p < 0.05, teste de cauda t dois) n = 30 cirurgias por grupo e a média de 10 cirurgias por cirurgião. (B), o percentual de cirurgias (definido como nenhum dano de sangramento ou visível para a dura-máter, como observado pelo olho do cirurgião através do objectivo fixado para 350 zoom X) foi superior para PHASOR broca dental cirurgias (n = 30 cirurgias para cada grupo, um teste de cauda z). Barras de erro mostram SD

Figura 3. Multiphoton imagem latente na vivo através de uma janela craniana diluída com PHASOR. (A) cálcio transientes observados com o indicador vermelho de cálcio JRGECO1a foram fotografadas nos neurônios piramidais murino córtex motor vivo emcamada 4. Barra de escala = 100 µm. (B) a mesma janela mas diferente região do córtex motor de camada 4. Headfixed rato com janela de 3 mm, preparado com FASOR. Barra de escala = 30 µm. Imaged com um microscópio do multiphoton, 40 X objetivo, comprimento de onda de excitação de 1040 nm.

Discussão

A cirurgia pode ser modificada alterando a ponta cirúrgica. Há muitos tamanhos diferentes de ponta que pode ser aplicado à peça de mão. Alterar o tamanho ou a forma da ponta resultará em janelas de tamanhos diferentes. Além da ponta de 4mm, também tentei uma dica de 3 mm e encontrado também funcionou bem. Mesmo com a irrigação com gelo frio ACSF, não fomos capazes de obter bons resultados com dicas que foram muito estreito (cerca de 0,25 mm) devido as vibrações concentradas, causando muito calor e queima o osso, levando a danos para a dura-máter subjacente. Nós não tentamos a multidão de outras dicas que estão disponíveis, e esperamos que outros laboratórios podem encontrar novas aplicações para estas pontas diferentes. Enquanto a cirurgia é relativamente simples, achamos que há várias etapas que podem exigir a resolução de problemas. O primeiro é que a ponta vibratória produz muita turbulência na ACSF, que diminui a visibilidade e produz dificuldade em determinar a profundidade de osso durante o osso desbaste etapa da cirurgia. Recomendamos que, se é muito difícil de ver como o osso é magro, fazer uma pausa para secar o crânio e a janela aplicando um cotonete estéril para o lado do osso. Não se aplica o cotonete diretamente para a janela, desde que a superfície áspera é prejudicial para o osso fino. Depois de verificar a profundidade, reaplique ACSF e continuar com a cirurgia. Também achamos que se não há danos para a dura-máter, é geralmente devido ao cirurgião colocar muita pressão na ponta. Segurando a peça de mão mais suavemente e aplicando menos força provavelmente irão corrigir este problema. Se o cirurgião é forçosamente raspando a dica sobre o osso, vai causar uma ruptura no osso fino e danificar o crânio. Finalmente, após a diluição do osso, a dura-máter subjacente aparece ferida, se devido ao calor em excesso de vibrações. Aumentando a taxa de fluxo ACSF vai resolver este problema.

A principal limitação do FASOR é que a peça de mão pode diluir o osso, mas não é possível remover todo o osso sobre a dura-máter. A ponta de diamante revestido tem pequenas saliências ásperas. O atrito necessário para "afinar" o crânio que abrada a dura-máter e causar sangramento se fosse usado para remover todo o osso. Assim, o uso de fórceps é necessário para remover a restante camada fina. Enquanto há um debate em curso sobre se a imagem através de um crânio fina produz menos inflamação e menos proliferação da microglia e astrócitos reativos, em alguns casos uma janela com nenhum osso remanescente é o preferido, por exemplo, para fornecer uma maior profundidade de imagem³ .

Otimizamos a preparação de janela cranial para a imagem latente do multiphoton em camundongos. FASOR é, a nosso conhecimento, a primeira aplicação da técnica piezoelétrica para cirurgia de roedores janela cranial para a imagem latente ótica. Descobrimos que o uso de cirurgia piezoeléctrica em camundongos compartilha as vantagens do aumento da velocidade e diminuição de eventos adversos relatados também em seres humanos^7,8,9,10. Utilização do dispositivo piezoelétrico resultou em cirurgias mais rápidas (Figura 2A) e menos eventos adversos de sangramento quando comparado com uma giratória de alta velocidade da broca (Figura 2B). Também encontramos, no nosso laboratório, que FASOR era mais fácil para novos cirurgiões aprender do que as abordagens tradicionais para cirurgia craniana janela. Vantagens da velocidade e facilidade de utilização são susceptíveis de diferem entre cirurgiões. Preparações de crânio fina exigem tipicamente 30-45 min para "afinar" o osso com uma broca e bisturi², enquanto a abordagem de FASOR normalmente requer menos de 10 min.

Nós achamos que em windows preparados com PHASOR nós poderia imagem transientes de cálcio nos neurônios piramidais de camada 4 no córtex motor que tinha sido transfected com vírus adeno-associado, o indicador de cálcio JRGECO1a de codificação (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). nós também achamos isso, comparado a uma janela craniana crânio fino preparada com uma broca rotativa e bisturi, a região de imagem era maior, enquanto um crânio fino preparado com uma broca rotativa e bisturi tem uma janela de imagem de 20 µm de diâmetro² . Com FASOR, fomos capazes de diminuir rapidamente uma área de 3 a 4 mm. Isso é semelhante à janela de imagem relatada com portas⁴. Esta janela maior retém o benefício de imagem rápida relatado para windows crânio fino preparados com uma broca de dentista e bisturi. Além disso, a janela preparada com FASOR pode imediatamente ser fotografada, em oposição a remoção de osso tradicional windows que podem exigir a semanas para cicatrizar antes que a janela pode ser óptima imagem³.

Esta técnica pode ser aplicada para estudar alterações no fluxo sanguíneo nos vasos sob a dura-máter. Um importante estudo futuro é comparar imunorreatividade de FASOR com outros métodos de janela cranial. Isto seria importante para determinar se o FASOR produz menos inflamação em comparação com os métodos existentes. Esperamos que a técnica cirúrgica piezoelétrica documentada aqui permitirá mais laboratórios para executar windows cranianas e usar com sucesso multiphoton imagem em vivo.

Certifique-se que a peça de mão situa-se a vibrar na configuração mais baixa e que a ACSF está sendo irrigado em uma taxa constante. O frio do gelo que ACSF deve ser aplicado constantemente ou irá aquecer e danificar a dura-máter. Nós achamos que ACSF deve ser aplicado a uma taxa de pelo menos 1 mL/min. quer usar uma seringa realizada na mão, ou usar uma bomba peristáltica, ao invés da irrigação embutida na peça de mão. O sistema de irrigação na peça de mão ejeta ACSF demasiada força e produz muita turbulência, que diminuem significativamente a visibilidade.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piezosurgery Touch	Mectron	5120062	Piezosurgery GP model has the same settings
Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11)	Mectron	3370019	This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible.
Stereotax frame	Kopf	963
Mouse adaptor	Stoelting	51625
Peristaltic pump for irrigation.	Cole-Parmer	WU-77120-42	Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary.
Avitene Ultrafoam	Bard-Davol	1050020	Important to stop any minor bleeding instantly.
C&B Metabond	Parkell	S380	Much stronger than regular dental acrylic.
Artificial cerebro spinal fluid (ACSF)	Tocris	3525
Puralube opthalmic ointment	Dechra	17033-211-38
Mice	JAX	664
Prairie Ultima multiphoton microscope	Bruker
JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40)	UPENN Vector Core