Detección de mutaciones raras en CtDNA usando la siguiente secuencia de generación

Resumen

Este manuscrito describe una técnica para la detección de mutaciones de baja frecuencia en ctDNA, ER-SS. Este método se distingue por su uso único de corrección de errores de bidireccional, un filtro de fondo especial y eficiente adquisición molecular.

Resumen

El análisis de ADN del tumor (ctDNA) mediante secuenciación de próxima generación (NGS) en circulación se ha convertido en una valiosa herramienta para el desarrollo de la oncología clínica. Sin embargo, la aplicación de este método es difícil debido a su baja sensibilidad en el análisis de la cantidad de rastro de ctDNA en la sangre. Además, el método puede generar resultados falsos positivos y negativos de esta periodicidad y posterior análisis. Para mejorar la viabilidad y fiabilidad de la detección de ctDNA en la clínica, aquí presentamos una técnica que enriquece raras mutaciones por secuenciación, enriquecer la secuencia de mutación rara (ER-Seq). ER-Seq puede distinguir una sola mutación de 1 x 10⁷ nucleótidos de tipo salvaje, que la hace una herramienta prometedora para detectar alteraciones genéticas de frecuencia extremadamente baja y por lo tanto será muy útil en el estudio de heterogenicidad de la enfermedad. En virtud de la ligadura del adaptador de secuencia única, este método permite una recuperación eficiente de moléculas de ctDNA, mientras que al mismo tiempo corregir para los errores de forma bidireccional (sentido y antisentido). Nuestra selección de sondas de 1021 kb enriquece la medida de las regiones de destino que cubren más de 95% de las mutaciones de controlador tumorales en 12 tumores. Este método universal y rentable permite una acumulación única acertada de la información genética. Después de filtrar eficientemente el error de fondo, ER-seq precisamente puede detectar mutaciones raras. Mediante un estudio de caso, presentamos un protocolo detallado demostrando el diseño de la sonda, la construcción de la biblioteca y metodologías de captura de ADN blanco, mientras que también incluyendo el flujo de trabajo de análisis de datos. El proceso para llevar a cabo este método por lo general tarda 1-2 días.

Introducción

Secuenciación de próxima generación (NGS), una poderosa herramienta para investigar los misterios del genoma, puede proporcionar una gran cantidad de información que puede revelar alteraciones genéticas. La aplicación de análisis NGS en la clínica se ha vuelto más común, especialmente para la medicina personalizada. Sin embargo, una de las mayores limitaciones de NGS, es una tasa alta de error. Aunque se estime conveniente para estudiar las mutaciones heredadas, el análisis de mutaciones raras es grandemente limitado^1,2, especialmente cuando los análisis de ADN obtienen de una "biopsia líquida".

Tumor de circulación (ctDNA) el ADN es ADN libre de células (cfDNA) en la sangre que se derrama de las células del tumor. En la mayoría de los casos, la cantidad de ctDNA es extremadamente baja, que hacen muy difícil su detección y análisis. Sin embargo, ctDNA tiene muchas características atractivas: su aislamiento es mínimamente invasivo, puede detectarse en las primeras etapas de crecimiento del tumor, el nivel de ctDNA refleja la eficacia terapéutica y ctDNA contiene mutaciones de ADN encontradas en lesiones primarias y metastásicas ^{3 , 4 , 5}. por lo tanto, dado el rápido desarrollo de la técnica NGS y el análisis, la aplicación de la detección de ctDNA se ha convertido en más atractiva.

Secuenciación masiva y en paralelo diferentes enfoques se han utilizado para la detección de ctDNA pero ninguno de estos enfoques han sido aceptado para uso de rutina en clínicas debido a sus limitaciones: baja sensibilidad, falta de flexibilidad y un costo relativamente alto^{6 ,7,8}. Por ejemplo, la secuencia duplex, basada en una etiqueta de identificador único (UID), repetidamente corrige errores en el consenso de forma bidireccional, rectificación de errores de secuencia de la mayoría. Sin embargo, la viabilidad de este método se pierde debido a su alto costo y baja datos utilización^9,10. Del mismo modo, CAPP-Seq y su repetición mejora, CAPP-IDES^11,12, tienen mayor practicidad en la detección de cfDNA, aunque la precisión y la universalidad de estos métodos necesitan mejora.

Para satisfacer la necesidad actual de ctDNA precisa detección y análisis, hemos desarrollado una nueva estrategia, enriquecer rara mutación secuencia (ER-Seq). Este enfoque combina las siguientes: adaptadores de secuencia única para recuperar eficientemente las moléculas de ctDNA, con corrección de errores de bidireccional y la capacidad para distinguir una sola mutación de > 1 × 10⁷ nucleótidos de tipo salvaje; sondas de 1021 kb que enriquecen la medida de las regiones de destino que cubren más de 95% de las mutaciones relacionadas con el tumor de 12 tumores, incluyendo cáncer de pulmón, cáncer colorrectal, cáncer gástrico, cáncer de mama, cáncer de riñón, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de tiroides, cáncer de cuello uterino, cáncer de esófago y carcinoma endometrial (tabla 1); y base de datos de línea de base lo que es eficaz y fácil para precisamente detectar mutaciones raras en ctDNA.

Para construir una base de datos de línea de base, encontrar todas las mutaciones de gene por ER-Seq de varios del mismo tipo de muestras (~ 1000 al principio). Estas mutaciones reales deben ser verificadas por otros métodos de detección confiable y análisis. A continuación, resume el patrón de mutaciones falsa y cluster todas las mutaciones falsa para construir la base de datos de línea de base inicial. Seguir añadiendo falso mutaciones encontradas en experimentos de secuenciación posterior a esta base de datos. Por lo tanto, esta base de datos de línea de base se convierte en una mayor base de datos dinámica, que mejora significativamente la precisión de la secuencia.

Para promover el progreso en el diagnóstico del tumor y seguimiento, presentamos ER-Seq, un método de bajo costo y factible para la adquisición de datos universal. Presentamos un caso de estudio que experimentó el análisis ER-Seq, demostrando su exactitud para detectar mutaciones raras y factibilidad para el uso en la clínica.

Protocolo

tumor especímenes y muestras de sangre fueron obtenidas según un protocolo aprobado por el Comité de ética de Pekín Universidad pueblo ' s Hospital. Consentimiento informado escrito fue obtenido de los pacientes a utilizar sus muestras. Los participantes fueron evaluados según los siguientes criterios: mujer, avanzado cáncer de pulmón de células no pequeñas, mutación de EGFR p.L858R indique previa secuenciación de Sanger, progresión de la enfermedad después de dos sesiones de EGFR dirigidos terapia con Erlotinib, y ER-Seq que se aplicó a ctDNA para analizar la causa de la resistencia y encontrar nuevos fármacos objetivo.

1. extracción de ADN de sangre periférica para cfDNA y DNA genómico (gDNA)

1. recoger 10 mL de sangre periférica en un tubo de recogida, invierta suavemente arriba y abajo 6 - 8 veces para mezclar. Evitar corte de célula. Muestras de sangre se pueden almacenar en el tubo de la colección a 6-37 ° C durante 72 horas.
2. Centrifugar el tubo de la colección a temperatura ambiente durante 10 min a 1600 (±150) x g.
3. Transferir el sobrenadante (plasma) desde el tubo de la colección cuatro limpio 2 ml debidamente etiquetados los tubos de centrífuga utilizando una pipeta desechable sin alterar la capa de sedimento (glóbulos blancos).
4. Transfer1 mL de las células utilizando una pipeta desechable limpias para 2 mL debidamente etiquetados tubo de centrífuga. Las células pueden ser almacenadas a-20 ° C o más frío antes de paso 1.8.
5. Centrifugar el plasma (en el paso 1.3) por 10 min a 4 ° C y 16000 (±150) x g.
6. Transferir el plasma para limpiar los tubos de centrífuga correctamente etiquetados como " plasma ", dejar ~0.1 mL de volumen residual en la parte inferior para evitar la contaminación. Almacenar el plasma a-80 ° C hasta el paso 1.7.
7. Use 3 mL de plasma de paso 1.6 para aislar cfDNA (contiene ctDNA) usando un kit disponible comercialmente, después el fabricante ' instrucciones s.
8. Uso de 200 μL de células de sangre blancas en el paso 1.3 para aislar gDNA usando un kit disponible comercialmente, después el fabricante ' instrucciones s.
   Nota: Tanto cfDNA y gDNA pueden conservarse a-20 ° C antes de su uso.
9. Aplicar diferentes controles de calidad para cfDNA y gDNA (tabla 2). Realizar control de calidad por un método estandarizado para el Bioanalizador determinar niveles de degradación de la muestra o gDNA contaminación. Análisis de pico de la calidad de extracción de cfDNA deben aparecer similar a la figura 1.
   Nota: El tamaño máximo de cfDNA es alrededor de 170 BP nota que aumenta la cantidad de ADN resultará en una biblioteca de calidad superior para la detección eficaz de mutaciones raras en cfDNA. Se recomienda utilizar al menos 30 ng cfDNA (30.000 copias).

2. Preparación de biblioteca

Nota: construcción de biblioteca base de ADN fragmentado, cfDNA existe en fragmentos con un pico tamaño ~ 170 bp y por lo tanto no necesita ser fragmentado.

Muestra

1. fragmento del control (gDNA) por sonicación para obtener fragmentos de 200-250 bp.
   1. Preparar 1 μg de muestra gDNA en 100 μl de buffer Tris-EDTA en un tubo limpio de sonicación.
   2. Establecer el programa de sonicación 30 s on y 30 s de para 12 ciclos para un total de 12 minutos
   3. Después de la sonicación, confirmar el producto (5 μl) contiene fragmentos de 200-250 bp ejecutando un análisis con el gel de agarosa al 2%.
   4. Todos los productos de fragmentación de la transferencia a un nuevo tubo de 1,5 mL e incubar con 150 μL de bolas magnéticas durante 5 min seleccionar los fragmentos correctos.
   5. Quitar el sobrenadante colocando el tubo sobre una rejilla magnética para 30 s.
   6. Lavar los granos con 200 μL de etanol al 80% (recién preparada) con el tubo en la rejilla magnética. Incubar durante 30 s antes de retirar el sobrenadante. Repetir una vez.
   7. Secar los granos con la tapa de tubo abierta durante su estancia en la rejilla magnética. Evitar granos resultarse para asegurarse de que el destino del ADN se recupera bien. Eluir fragmentos de ADN de los granos mediante la adición de 32 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 8) para las cuentas para resolver los fragmentos de ADN seguidos de cuantificación por espectroscopía UV/Vis.
      Nota: al menos 200 ng es necesario para los experimentos siguientes.
2. Reacción de preparación final
   Nota: seguir fabricante ' instrucción s y modificar según sea necesario. Uso 30 ng de cfDNA; y 1 μg del gDNA como control.
   1. 7 Añadir μl de tampón de reacción, 3 μl de la mezcla de enzima, 30 ng de cfDNA en un tubo estéril libre de nucleasas y ddH ₂ O volumen total de 60 μL. En un tubo separado, agregar los componentes anteriores, pero con 1 μg de gDNA en lugar de cfDNA.
   2. Mezcla e incubar la mezcla a 20 ° C durante 30 min seguido de 65 ° C durante 30 minutos en un termociclador sin la tapa calientada. Proceder inmediatamente al siguiente paso.
3. Adaptador ligadura
   1. Añadir 30 μl de la mezcla principal de ligadura, 1 μl de potenciador de la ligadura y 4 μL de los adaptadores de secuencia única a la mezcla del paso 2.2.
   2. Incubar a 20 ° C durante 15 minutos en un termociclador sin la tapa calentado.
   3. Vortex para resuspender las bolas magnéticas y dejar los granos a temperatura ambiente durante al menos 30 min antes del siguiente paso.
   4. Añadir μl 87 de las bolas magnéticas resuspendidas a la mezcla anteriormente mencionada; mezclar bien mediante pipeteo arriba y abajo y luego incubar a temperatura ambiente durante 5 min.
   5. Lavado y aire seco los granos como se describe en el paso 2.1.
   6. Eluir el destino del ADN de los granos añadiendo 20 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
4. Enriquecimiento de fragmentos ligadas con adaptador
   1. Añadir 20 μl de adaptador ligarse DNA fragmentos, 5 μl del Primer índice/i7 (2,5 μl Primer-P7 (22:00) y 2.5 μl de Primer-P5 (22:00), para los propósitos de la secuencia), 25μl de Biblioteca amplificación master mix y ddH ₂ O hasta un volumen total de 50 μl.
   2. PCR amplifica el ADN adaptador ligada y ciclo térmico como sigue: desnaturalización inicial a 98 ° C por 45 s, seguidos de 8 ciclos (cfDNA) o 4 ciclos (gDNA) de recocido ° C por 15 s, 65 ° C durante 30 s, 72 ° C por 30 s) y una extensión final a 72 ° C durante 60 s, a continuación, manteniendo la temperatura a 4 ° C.
   3. Añadir 45 μl de suspensión bolas magnéticas del ADN PCR enriquecido para obtener fragmentos adquiridos.
   4. Fragmentos de ADN de eluir con adaptadores en 30 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Control de calidad de la biblioteca
   1. siga el fabricante ' protocolo de s para el kit comercial medir adaptador ligarse concentración de ADN. Utilice el equipo bioanalyzer para determinar la calidad del ADN.

3. Objetivo de captura de ADN

Nota: enriquecimiento objetivo fue realizada usando una secuencia personalizada-sonda de captura diseñado específicamente para una región de enriquecimiento de 1021 kb blanco cubriendo las mutaciones conductor conocido tumor-associated del 12 diferentes tipos de tumores. Modificaciones al fabricante ' Protocolo s se detallan en los siguientes pasos.

1. Bloqueo
   1. añadir 1.5 μg de la agrupación de bibliotecas (número máximo de bibliotecas a piscina cfDNA es 6, gDNA es 20) desde el paso 2, 8 μl de 8 μl de Block(100P) P7 y P5 Block(100P) y 5 μl de ADN Cot-1 (1 μg/μl) en un tubo estéril. Secar el contenido del tubo utilizando un concentrador de vacío a 60 ° C.
2. Hybridize la captura de ADN sondas con la biblioteca.
   1. Añadir los siguientes componentes en el tubo de paso 3.1: 8,5 μl de tampón de hibridación de X 2, 2.7 μl de reforzador de la hibridación y 1,8 μl de ddH libre de nucleasa ₂ O.
   2. Mezclar por pipeteo arriba y abajo e incubar en un Termomezcladores a 95 ° C durante 10 minutos
   3. Tras la incubación, añadir 4 μL de la sonda de medida. Incubar las muestras en un termociclador en 65 & #176; C con la tapa caliente a 75 ° C por 4 h.
3. Captura de fragmentos de ADN
   1. incubar el ADN diana hibridizado con estreptavidina granos siguió lavando los granos para eliminar el ADN no Unido. Utilizar el kit comercial según fabricante ' fragmentos de instrucciones para obtener un final de 20 μl de granos resuspendidos con ADN capturado.
4. Fragmentos de amplificación de la DNA capturada
   1. realizar PCR utilizando el comercial kit con oligonucleótidos de backbone de 2 μm según fabricante ' instrucciones s.
   2. Reacción de cuando la PCR se ha completado, agregar 45 μl de suspensión granos directamente al producto PCR y enriquecer los fragmentos de ADN amplificados objetivo vinculados a las cuentas por elución con 30 μl de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Los fragmentos de ADN con el kit de cuantificación de la biblioteca de cuantificar y determinar la longitud del fragmento promedio por equipo Bioanalyzer ( figura 2).

4. secuenciación

1. secuencia multiplexado bibliotecas usando 75 bp emparejado-end se ejecuta en un secuenciador de sobremesa para 18 h. Total datos producidos son hasta 60 Gigabytes, 15 G se requiere para cfDNA de la muestra del paciente y 1G para control muestra gDNA.

5. flujo de datos análisis

Nota: figura 3 muestra el proceso de análisis de datos y flujo de trabajo general. Parámetros de análisis de datos y comandos son las siguientes.

1. Filtro Lee de baja calidad y corregir errores y enmascaramiento de UID con NCfilter.
   NCfilter(own)
   NCfilter filtro -l 5 - q 0.5 -n 0.1 -T fastq1 - G -1 3-2 fastq2
   realSeq(own)
   python bin/realRealSeq fq1 MaskUID -1-2 fq2 -o salida dir -p prefijo -u 4 -s 7 - m 3 -i uidFile-f.
2. Referencia genoma hg19 (genoma humano 19), localizar los resultados de secuenciación con mem BWA (versión 0.7.12-r1039) y realinear con genoma análisis Toolkit (GATK) (versión 3.4-46-gbc02625).
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
   GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conocido dbsnp —
   allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - I cancerBam-I normalBam
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conocido dbsnp
   - allowPotentiallyMisencodedQuals — intervalos de targetIntervals-I cancerBam-I normalBam
3. Cluster los duplicados según la UID y la posición de los fragmentos de plantilla, que corregirá el error bases introducidas por la PCR/secuenciación y modificar la calidad base.
   realSeq(own)
   CLUSTER de python realSeq/bin/realSeq - b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
   prefijo -m 6
4. volver a alinear los duplicados agrupados por BWA recordar:
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
5. realizar una realineación local seguida de una recalibración de la puntuación de calidad base con GATK (versión 3.4-46-gbc02625).
   Loacal realineación: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-conocido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -CancerBam-me normalBam
   java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-conocido dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalos-I cancerBam-I normalBam
   recalibración de puntuación de calidad base: java-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp knownSites - cósmico - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - I java de bam -o PRFV-d64-servidor - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-I bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
6. para SNV (variante del solo-nucleótido) y llamadas de INDEL (pequeñas inserciones o deleciones), la exactitud de las mutaciones de baja frecuencia es confirmada más a fondo por GSR (buen apoyo Lee) con ambos hebra adelante y atrás Lee pares y filtración a través del grupo de control (mutaciones de línea germinal) y la base de datos de línea base.
   realDcaller(own)
   python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam p - 30
7. utilizar las muestras de referencia como control para llamar CNV (variación en número de copias).
   NCcnv(own)
   python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv--normgt normalBam--tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk
8. Realigned asignada, clips y Lee par discordante a SV (variaciones estructurales).
   NCsv(own)
   python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x transcripción -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

Resultados

Las sondas de 1021 kb regiones blanco enriquecido utilizadas en ER-Seq se muestran en la tabla 1, que cubre más del 95% de las mutaciones de gene de tumores comunes 12. La amplia gama de estas puntas de prueba hace este proceso aplicable a la mayoría de pacientes con cáncer. Además, nuestros adaptadores de secuencia única y proyección de la base de datos de línea de base permiten detectar mutaciones raras precisamente.

Discusión

La existencia de circulación ADN del tumor (ctDNA) fue descubierta hace más de 30 años, sin embargo la aplicación del análisis ctDNA es todavía no habitual en la práctica clínica. Interés en la aplicación práctica de métodos de ctDNA ha aumentado con el desarrollo de tecnologías para la detección de ctDNA y análisis. Tumor de monitoreo con ctDNA ofrece un acercamiento como mínimo invasor para la evaluación de enfermedad residual microscópica, respuesta a la terapia y perfiles moleculares del tumor bajo ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51105	DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Measure cfDNA concentration
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32853	Measure library concentration
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent	5067-1504	Measure cfDNA and library fragments
The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	E7645L	Library Preparation
Agencourt SPRIselect Reagent	Beckman	B23317	DNA fragment screening and purification
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	Dissolution
xGen Lockdown Probes	IDT	——	xGen Custom Probe
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Targeted DNA capture
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Targeted DNA capture
xGen Lockdown Reagents	IDT	1072281	Targeted DNA capture
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	post-capture PCR enrichment libraries
KAPA Library Quantification Kit	KAPA	KK4602	Measure library concentration
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Measure gDNA concentration
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantify
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubation
16-tube DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina