Rilevazione di mutazioni Rare in CtDNA mediante sequenziamento di nuova generazione

Riepilogo

Questo manoscritto descrive una tecnica per la rilevazione di mutazioni di bassa frequenza in ctDNA, ER-segg. Questo metodo si differenzia per il suo uso unico di correzione degli errori di bi-direzionale, un fondo speciale filtro ed efficiente acquisizione molecolare.

Abstract

L'analisi del DNA del tumore (ctDNA) utilizzo di sequenziamento di nuova generazione (NGS) in circolo è diventata uno strumento prezioso per lo sviluppo di oncologia clinica. Tuttavia, l'applicazione di questo metodo è impegnativo a causa della sua bassa sensibilità nell'analizzare la quantità in tracce di ctDNA nel sangue. Inoltre, il metodo può generare risultati falsi positivi e negativi da questa analisi di sequenziamento e successiva. Per migliorare la fattibilità e l'affidabilità di rilevazione di ctDNA nella clinica, qui vi presentiamo una tecnica che arricchisce le mutazioni rare per il sequenziamento, arricchire rara mutazione sequenziamento (ER-Seq). ER-Seq può distinguere una singola mutazione fuori 1 x 10⁷ nucleotidi di selvaggio-tipo, che lo rende uno strumento promettente per rilevare le alterazioni genetiche di frequenza estremamente bassa e quindi sarà molto utile nello studio heterogenicity di malattia. In virtù della legatura dell'adattatore unico sequenziamento, questo metodo consente un recupero efficiente di molecole ctDNA, mentre presso lo stesso tempo per correggere errori in entrambe le direzioni (senso e antisenso). La nostra selezione di sonde 1021 kb arricchisce la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni tumore-relativo driver in 12 tumori. Questo metodo economico e universale consente un accumulo in modo univoco successo dei dati genetici. Dopo il filtraggio efficiente errori in background, ER-seq può rilevare precisamente mutazioni rare. Utilizzando un caso di studio, presentiamo un protocollo dettagliato che dimostra sonda progettazione, la costruzione della libreria e metodologie di acquisizione del DNA bersaglio, mentre includendo anche il flusso di lavoro di analisi dei dati. Il processo per effettuare questo metodo in genere dura 1-2 giorni.

Introduzione

Sequenziamento di nuova generazione (NGS), un potente strumento per indagare i misteri del genoma, in grado di fornire una grande quantità di informazioni, che possono rivelare alterazioni genetiche. L'applicazione dell'analisi NGS in clinica è diventato più comune, soprattutto per la medicina personalizzata. Una delle limitazioni più grandi di NGS, tuttavia, è un alto tasso di errore. Sebbene sia ritenuto opportuno per studiare le mutazioni ereditate, l'analisi di mutazioni rare è notevolmente limitato^1,2, soprattutto quando l'analisi del DNA ottenuto da una "biopsia liquida".

Circolazione del tumore (ctDNA) il DNA è DNA libero (cfDNA) nel sangue che è sparso dalle cellule del tumore. Nella maggior parte dei casi, la quantità di ctDNA è estremamente bassa, che rendono la rilevazione e l'analisi molto impegnativo. Tuttavia, ctDNA ha molte caratteristiche interessanti: suo isolamento è minimamente invasiva, può essere individuata nelle prime fasi di crescita del tumore, il livello di ctDNA riflette l'efficienza del trattamento e ctDNA contiene mutazioni del DNA trovate in lesioni sia primari e metastatiche ^{3 , 4 , 5}. quindi, dato il rapido sviluppo della tecnica NGS e analisi, l'applicazione di rilevazione di ctDNA è diventato più attraente.

Sequenziamento massivamente parallelo diversi approcci sono stati utilizzati per il rilevamento di ctDNA, ma nessuno di questi approcci sono stati accettati per uso sistematico in cliniche a causa delle loro limitazioni: bassa sensibilità, mancanza di versatilità e un costo relativamente elevato^{6 ,7,8}. Ad esempio, il sequenziamento duplex, basato su un tag di identificatore univoco (UID), ripetutamente corregge gli errori nel consenso in modo bidirezionale, che rettifica la maggior parte degli errori di sequenziamento. Tuttavia, la fattibilità di questo metodo è persa a causa del suo alto costo e dati a bassa utilizzazione^9,10. Allo stesso modo, CAPP-Seq e iterazione migliorata, CAPP-IDES^11,12, hanno una maggiore praticità nel rilevamento di cfDNA, anche se l'accuratezza e l'universalità di questi metodi devono essere migliorati.

Per soddisfare l'esigenza attuale ctDNA accurato rilevamento e analisi, abbiamo sviluppato una nuova strategia, arricchire rara mutazione Sequencing (ER-Seq). Questo approccio combina le seguenti: schede di sequenziamento unico per recuperare in modo efficiente le molecole di ctDNA, con correzione di errore bidirezionale e la capacità di distinguere una singola mutazione su > 1 × 10⁷ nucleotidi di selvaggio-tipo; sonde di 1021 kb che arricchiscono la misurazione delle regioni di destinazione che coprono oltre 95% delle mutazioni da 12 tumori, tra cui il cancro del polmone, cancro colorettale, cancro gastrico, cancro al seno, cancro del rene, cancro del pancreas, cancro del fegato, cancro della tiroide, tumore-relativa cancro cervicale, cancro esofageo e carcinoma dell'endometrio (tabella 1); e database di riferimento di screening rende efficienti e facili da rilevare precisamente rare mutazioni in ctDNA.

Per creare un database di riferimento, è possibile trovare tutte le mutazioni di gene di ER-Seq da un numero dello stesso tipo di campioni (~ 1000 all'inizio). Queste mutazioni reale devono essere verificate da diversi altri metodi di rilevazione affidabili e analisi. Successivamente, riassumere il pattern di mutazioni false e tutte le mutazioni false per creare il database di previsione iniziale del cluster. Continuare ad aggiungere false mutazioni trovate da esperimenti di ordinamento successivo a questo database. Questo database di riferimento diventa quindi un database dinamico espanso, che migliora notevolmente la precisione di sequenziamento.

Per promuovere il progresso nella diagnosi del tumore e di monitoraggio, presentiamo ER-Seq, un metodo di basso costo e fattibile per l'acquisizione di dati universale. Presentiamo un caso di studio che hanno subito l'analisi ER-Seq, dimostrando l'esattezza per la rilevazione di mutazioni rare e fattibilità per l'utilizzo in clinica.

Protocollo

esemplari del tumore ed i campioni di sangue sono stati ottenuti secondo un protocollo approvato dal comitato etico di Pechino Università popolo ' s Hospital. Consenso informato è stato ottenuto dai pazienti di utilizzare i loro campioni. I partecipanti sono stati selezionati secondo i seguenti criteri: donna, avanzato Non a piccole cellule cancro ai polmoni, mutazione di EGFR p.L858R indicato dal precedente sequenziamento Sanger, progressione di malattia dopo due sessione di EGFR terapia con Erlotinib, mirata e ER-Seq, che è stato applicato a ctDNA per analizzare la causa della resistenza e trovare nuovi farmaci a bersaglio.

1. estrazione del DNA da sangue periferico per cfDNA e DNA genomico (gDNA)

1. raccogliere 10 mL di sangue periferico in un tubo di raccolta, capovolgere delicatamente su e giù 6 - 8 volte per mescolare. Evitare il cesoiamento delle cellule. Campioni di sangue possono essere conservati nel tubo di raccolta a 6-37 ° C fino a 72 ore.
2. Centrifugare la provetta di raccolta a temperatura ambiente per 10 min a 1600 (± 150) x g.
3. Trasferire il surnatante (plasma) dal tubo di raccolta a quattro pulito 2 mL opportunamente etichettato provette da centrifuga utilizzando una pipetta monouso senza disturbare lo strato di pellet (globuli bianchi).
4. Transfer1 mL di celle utilizzando una pipetta monouso pulito a un 2 mL opportunamente etichettati provetta da centrifuga. Le cellule possono essere conservati a-20 ° C o a temperature inferiori prima di passaggio 1.8.
5. Centrifugare il plasma (dal punto 1.3) per 10 min a 4 ° C e 16000 (± 150) x g.
6. Trasferire il plasma per pulire adeguatamente etichettati come due provette da centrifuga " plasma ", lasciare ~0.1 mL di volume residuo nella parte inferiore per evitare la contaminazione. Conservare il plasma a-80 ° C fino al punto 1.7.
7. Uso 3 mL di plasma dal passaggio 1.6 per isolare cfDNA (contiene ctDNA) utilizzando un kit disponibile in commercio, seguendo il produttore ' istruzioni s.
8. Uso 200 µ l di cellule bianche del sangue dal passaggio 1.3 per isolare gDNA utilizzando un kit disponibile in commercio, seguendo il produttore ' istruzioni s.
   Nota: Entrambi cfDNA e gDNA possono essere conservati a-20 ° C prima dell'uso.
9. Applicare diversi controlli di qualità per cfDNA e gDNA (tabella 2). Eseguire il controllo di qualità di un metodo standardizzato per il bioanalyzer determinare i livelli di degradazione del campione e/o contaminazione gDNA. Analisi della qualità dell'estrazione cfDNA di picco dovrebbero apparire simile a Figura 1.
   Nota: Le dimensioni di picco di cfDNA sono di circa 170 BP. nota che aumentando la quantità di DNA si tradurrà in una libreria di qualità superiore per un'efficace individuazione di mutazioni rare in cfDNA. Si consiglia di utilizzare almeno 30 ng cfDNA (30.000 copie).

2. Preparazione di biblioteca

Nota: per quanto riguarda la costruzione della libreria di base su DNA frammentato, cfDNA esiste in frammenti con un picco dimensione ~ 170 bp e così non ha bisogno di essere frammentati.

1. Frammento il controllo campione (gDNA) mediante sonicazione per ottenere frammenti di bp 200-250.
   1. Preparare 1 µ g di campione gDNA in 100 µ l di tampone Tris-EDTA in una provetta pulita sonicazione.
   2. Impostare il programma di sonicazione come 30 s s on e 30 fuori per 12 cicli per un totale di 12 min.
   3. Dopo sonicazione, confermare il prodotto (5 µ l) contiene frammenti di 200-250 bp eseguendo un'analisi con gel di agarosio al 2%.
   4. Trasferire tutti i prodotti di frammentazione in una nuova provetta da 1,5 mL e incubare con 150 µ l di biglie magnetiche per 5 min selezionare i frammenti corretti.
   5. Rimuovere il surnatante mettendo il tubo su un rack magnetico per 30 s.
   6. Lavare le perle con 200 µ l di etanolo di 80% (preparata) con il tubo di soggiornare sul rack magnetico. Incubare per 30 s prima di rimuovere il surnatante. Ripetere un' volta.
   7. Le perle con il coperchio del tubo aperto mentre soggiornate sul rack magnetico asciugare all'aria. Evitare sovraessiccati perline per assicurarsi che il DNA bersaglio recupera bene. Eluire frammenti di DNA dalle perle aggiungendo 32 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8) per le perline per risolvere i frammenti di DNA seguiti da quantificazione di spettroscopia di UV/Vis.
      Nota: almeno 200 ng è necessaria per i seguenti esperimenti.
2. Fine Prep reazione
   Nota: Segui produttore ' Istruzione s e modificare come necessario. Uso 30 ng di cfDNA; e 1 µ g di gDNA come il controllo.
   1. Aggiungere 7 µ l di tampone di reazione, 3 µ l della miscela enzimatica, 30 ng di cfDNA in una provetta sterile privo di nucleasi e aggiungere ddH ₂ O al volume totale di 60 µ l. In un tubo separato, aggiungere i componenti di cui sopra ma con 1 µ g di gDNA invece di cfDNA.
   2. Mix e incubare la miscela a 20 ° C per 30 min seguita da 65 ° C per 30 min in un termociclatore senza il coperchio riscaldato. Procedere immediatamente alla fase successiva.
3. Adattatore legatura
   1. aggiungere 30 µ l di mix master legatura, 1 µ l del rinforzatore di legatura e 4 µ l delle schede di sequenziamento unico alla miscela dal passaggio 2.2.
   2. Incubate a 20 ° C per 15 min in un termociclatore senza il coperchio riscaldato.
   3. Vortex per risospendere le microsfere magnetiche e lasciare le perline a temperatura ambiente per almeno 30 min prima del passaggio successivo.
   4. µ L 87 dei branelli magnetici sedimento alla miscela precedentemente accennato; mescolare bene pipettando su e giù e poi incubare a temperatura ambiente per 5 min.
   5. Lavare e asciugare all'aria le perle come descritto nel punto 2.1.
   6. Eluire il DNA bersaglio dalle perline con l'aggiunta di 20 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
4. Frammenti di arricchimento di DNA legati con adattatore
   1. aggiungere 20 µ l di DNA adattatore legato frammenti, 5 µ l di Primer Indice/i7 (2,5 µ l Primer-P7 (22) e 2,5 µ l di Primer-P5 (22), per scopi di sequenziamento), 25 µ l di mix master di amplificazione di biblioteca e ddH ₂ O ad un volume totale di 50 µ l.
   2. PCR amplificare il DNA adattatore legato e ciclo termico come segue: denaturazione iniziale a 98 ° C per 45 s, seguita da 8 cicli (cfDNA) o 4 cicli (gDNA) di ricottura ° C per 15 s, 65 ° C per 30 s, 72 ° C per 30 s) e un'estensione finale a 72 ° C per 60 s, poi tenendo la temperatura a 4 ° C.
   3. Aggiungere 45 µ l di biglie magnetiche sospese al DNA PCR-arricchita per ottenere frammenti acquisite.
   4. Frammenti di DNA eluire con adattatori in 30 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Libreria di controllo di qualità
   1. seguire il produttore ' protocollo di s per il kit commercio misurare adattatore legato concentrazione di DNA. Utilizzare il bioanalyzer per determinare la qualità del DNA.

3. Mirati acquisizione di DNA

Nota: arricchimento di destinazione è stato effettuato usando una sequenza personalizzata-sonda di cattura che è specificamente progettata per un'area di arricchimento di destinazione 1021 kb che coprono le mutazioni driver noto tumore-collegati da 12 diversi tipi di tumori. Modifiche il produttore ' protocollo s sono dettagliati di seguito.

1. Blocco
   1. aggiungere 1,5 µ g di pool di librerie (numero massimo di librerie per piscina per cfDNA è 6, gDNA è 20) dal passaggio 2, 8 µ l di Block(100P) P5, 8 µ l di Block(100P) P7 e 5 µ l di DNA Cot-1 (1 µ g / µ l) in una provetta sterile. Asciugare il contenuto del tubo utilizzando un concentratore a vuoto impostato a 60 ° C.
2. Hybridize l'acquisizione di DNA sonde con la libreria.
   1. Aggiungere i seguenti componenti per il tubo dal punto 3.1: 8,5 µ l di tampone di ibridazione di X 2, 2,7 µ l di esaltatore di ibridazione e 1,8 µ l di ddH nucleasi-free ₂ O.
   2. Mix di pipettaggio su e giù e incubare in un thermomixer a 95 ° C per 10 min.
   3. a seguito di incubazione, immediatamente aggiungere 4 µ l di sonda Custom. Incubare i campioni in un termociclatore a 65 & n. 176; C con il coperchio riscaldato a 75 ° C per 4 h.
3. Cattura frammenti di DNA
   1. Incubare il DNA dell'obiettivo ibridato con streptavidina perline seguite da lavare le perle per rimuovere il DNA non legato. Utilizzare il kit commerciale secondo produttore ' s istruzioni per ottenere un finale 20 µ l di sedimento perline con DNA acquisito frammenti.
4. Frammenti di amplificazione del DNA acquisito
   1. eseguire PCR utilizzando commercio kit con oligonucleotidi di spina dorsale 2 µM, secondo produttore ' istruzioni s.
   2. Reazione di PCR the quando è completato, aggiungere 45 µ l di sospensione perline direttamente al prodotto PCR e arricchire i frammenti di DNA amplificati destinazione vincolati ai talloni eluizione con 30 µ l di 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Quantificare i frammenti di DNA con il kit di quantificazione di libreria e determinare la lunghezza del frammento medio di Bioanalyzer ( Figura 2).

4. sequenziamento

1. sequenza multiplexed librerie utilizzando 75 piste accoppiato-fine di bp su un sequencer di benchtop per 18 h. totale dei dati prodotti è fino a 60 Gigabyte, 15 G è necessario per il campione del paziente cfDNA e 1G per controllo campione gDNA.

5. flusso di lavoro analisi dati

Nota: nella figura 3 viene visualizzato il processo di analisi dati e flusso di lavoro generale. Parametri di analisi di dati e i comandi sono riportati di seguito.

1. Filtro letture di bassa qualità e correggere errori e mascheramento dell'UID utilizzando NCfilter.
   NCfilter(own)
   NCfilter filtro -l 5 - q 0,5 -n 0,1 -T fastq1 - G -1 3-2 fastq2
   realSeq(own)
   python bin/realRealSeq fq1 MaskUID -1-2 fq2 -o uscita dir -p prefisso -u 4 -s 7 - m. 3 -i uidFile-f.
2. Hg19 di referenziamento genoma (genome umano 19), individuare i risultati di sequenziamento utilizzando mem BWA (versione 0.7.12-r1039) e riallineare con Genome Analysis Toolkit (GATK) (versione 3.4-46-gbc02625).
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
   java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
   GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-noto dbsnp —
   allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - io cancerBam-io normalBam
   java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-noto dbsnp
   - allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervalli-io cancerBam-io normalBam
I duplicati secondo l'UID e la posizione dei frammenti modello, che verrà corretto l'errore basi introdotte dalla PCR/sequenziamento e modificare la qualità di base del cluster
3. .
   realSeq(own)
   CLUSTER python realSeq/bin/realSeq - b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
   prefisso -m 6
4. ri-allineare i duplicati in cluster di BWA MEM.
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
5. eseguire un riallineamento locale seguito da una ricalibrazione del Punteggio di qualità base utilizzando GATK (versione 3.4-46-gbc02625).
   Riallineamento sassarese: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-noto dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Io cancerBam-io normalBam
   java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-noto dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalli-io cancerBam-io normalBam
   base Punteggio di qualità ricalibrazione: java-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites cosmico - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - ho java di grp -o bam-d64-server - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-ho bam - BQSR grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
6. per SNV (variante del singolo-nucleotide) e chiamando il INDEL (piccoli inserimenti o eliminazioni), la precisione delle mutazioni a bassa frequenza è ulteriormente confermata da GSR (buon supporto legge) con entrambi strand e inversa di leggere coppie e filtrazione attraverso il gruppo di controllo (mutazioni germinali) e il database di riferimento.
   realDcaller(own)
   python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30
7. usare i campioni della linea di base come un controllo per CNV (copia numero variazione) chiamate.
   NCcnv(own)
   python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk
8. Realigned non mappati, filmati e letture di coppia discordante di chiamare SV (variazioni strutturali).
   NCsv(own)
   python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir - x trascrizione -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

Risultati

Le sonde di 1021 kb regioni arricchiti di destinazione utilizzato nell'ER-Seq sono riportate nella tabella 1, che copre oltre il 95% delle mutazioni di gene in 12 tumori comuni. La vasta gamma di queste sonde rende questo processo applicabile alla maggior parte dei malati di cancro. Inoltre, nostro unico sequenziamento adattatori e lo screening basale database rendono possibile rilevare mutazioni rare precisamente.

Discussione

L'esistenza di circolazione del tumore DNA (ctDNA) è stato scoperto più di 30 anni fa, tuttavia l'applicazione di analisi di ctDNA è ancora non di routine nella pratica clinica. Interesse per l'applicazione pratica dei metodi di ctDNA sono aumentata con lo sviluppo di tecnologie per il rilevamento di ctDNA e analisi. Monitoraggio del tumore con ctDNA offre un approccio mini-invasivo per la valutazione della malattia residua microscopica, risposta alla terapia e profili molecolari del tumore sotto lo sfondo di tumore e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51105	DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Measure cfDNA concentration
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32853	Measure library concentration
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent	5067-1504	Measure cfDNA and library fragments
The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	E7645L	Library Preparation
Agencourt SPRIselect Reagent	Beckman	B23317	DNA fragment screening and purification
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	Dissolution
xGen Lockdown Probes	IDT	——	xGen Custom Probe
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Targeted DNA capture
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Targeted DNA capture
xGen Lockdown Reagents	IDT	1072281	Targeted DNA capture
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	post-capture PCR enrichment libraries
KAPA Library Quantification Kit	KAPA	KK4602	Measure library concentration
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Measure gDNA concentration
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantify
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubation
16-tube DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina