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要約

本稿では葉緑体 ER 以下の低頻度の変異を検出するための手法を説明しますこのメソッドは、2 方向エラー訂正、特別なバック グラウンド フィルター、および分子の効率的な獲得の独自の使用によって区別されます。

要約

次世代シーケンス (NGS) を用いた腫瘍 DNA (葉緑体) の循環の解析臨床腫瘍学の発展のための貴重なツールとなっています。ただし、このメソッドのアプリケーションは葉緑体血液中のトレース量の分析で低感度のために挑戦。さらに、メソッドは、この順序付けとその後の分析から偽の肯定的な否定的な結果を生成する可能性があります。実現可能性とクリニックで葉緑体検出の信頼性を向上させるため、ここで紹介豊かにまれな変異配列 (ER Seq) 配列のためまれな突然変異を豊かにする手法。ER Seq 1 x 107野生型ヌクレオチドから超低周波の遺伝子変異を検出する有望なツールになりますし、したがって病 heterogenicity の勉強に非常に役に立つでしょう単一の突然変異を識別できます。ユニークなシーケンス アダプターの ligation のおかげでは、このメソッドは、双方向のエラー (センスおよびアンチセンス) を同じ時間補正が葉緑体分子の効率的な回復をできます。1021 kb プローブの我々 の選択を豊かにそのカバーの上ターゲット領域の測定 12 腫瘍における腫瘍関連ドライバー変異の 95%。この費用対効果および普遍的な方法は一意に成功した遺伝的データ蓄積をできます。グラウンドでエラーを効率的にフィルター処理後 ER seq はまれな突然変異を正確に検出できます。事例を使用して、データ解析のワークフローも、プローブの設計、図書館の建設や、ターゲット DNA キャプチャ方法論を示す詳細なプロトコルを提案する.通常このメソッドを実行するプロセスは、1-2 日かかります。

概要

次世代シーケンス (NGS) ゲノムの謎を調査するための強力なツールは、大量の情報は、遺伝子変異を明らかにする可能性を提供できます。クリニックで NGS 解析のアプリケーションより一般的な特に個人化された薬のためになりました。NGS の最大の制限の 1 つは、高いエラー率です。勉強の受継がれた突然変異に最適と判断されるがまれな突然変異の解析は大幅に制限された1,2, 特に「液体生検」から得られた DNA を分析です。

DNA (葉緑体) 腫瘍を循環腫瘍細胞から流された血の DNA (cfDNA) では。ほとんどの場合、葉緑体の量は極めて低いを作るその検出と分析非常に挑戦的です。ただし、緯度は多くの魅力的な機能: その分離は低侵襲、それが腫瘍の成長の初期の段階で検出できる、葉緑体レベルは、治療効果を反映、葉緑体を含むプライマリおよび転移性の病変は、DNA の変異3,4,5します。 したがって、NGS の手法と分析の急速な発展を考えると、葉緑体の検出アプリケーションがより魅力的になります。

大量並列シーケンスの異なるアプローチは、葉緑体の検出のため利用されているが、これらの方法のどれも彼らの制限のための診療所で日常的に受け入れられている: 低感度、汎用性の欠如、コストが比較的高い6 ,7,8。たとえば、両面印刷順序は、一意の識別子 (UID)、タグに基づいて繰り返しほとんどのシーケンス エラーの是正、コンセンサスの双方向でのエラーを修正します。ただし、この手法の有効性は、その高コストと低データ利用9,10のため失われます。同様に、CAPP Seq およびその改良型反復、CAPP IDE11,12、大きい実用性にある cfDNA 検出精度とこれらの方法の普遍性改善が必要、

正確な緯度の検出と解析のための現在の必要性を満たすためには、我々 は豊かにまれな変異配列 (ER Seq)、新しい戦略を開発しました。このアプローチを組み合わせた次: 緯度分子、双方向エラー訂正とのうち単一の突然変異を区別する能力を効率的に回復するユニークなシーケンス アダプター > 1 × 107野生型ヌクレオチド;豊かにそのカバーの上ターゲット領域の測定プローブは 1021 kb 12 腫瘍、肺癌、大腸癌、胃癌、乳癌、腎臓癌、膵臓癌、肝臓癌、甲状腺癌などの腫瘍関連遺伝子変異の 95%子宮頸癌、食道癌、子宮体癌 (表 1)。ベースライン データベースが効率的かつ正確に葉緑体のまれな突然変異を検出する簡単なことをスクリーニングします。

ベースライン データベースを構築するには、サンプル (冒頭 ~ 1000) のタイプの同じ数から ER Seq によってすべての遺伝子変異を見つけます。これらの実際の突然変異は、いくつかの他の信頼性の高い検出方法および分析によって確認されなければなりません。次に、偽の突然変異のパターンを要約し、クラスターの最初のベースライン データベースを構築するすべての偽の突然変異。このデータベースにそれに続くシーケンス実験から発見された偽の変異を追加していきます。したがって、このベースライン データベース配列決定精度が大幅に向上、動的拡張のデータベースとなります。

腫瘍診断および監視の進歩を促進するため、ER-Seq、普遍的なデータの取得のため低コストかつ実現可能な手法を提案する.クリニックでまれな突然変異との使用のための可能性を検出するための精度を示す ER Seq 解析を施行した症例の検討を提案します。

プロトコル

の腫瘍の標本、血液サンプルは、北京大学人々 の倫理委員会によって承認されたプロトコルに従って得られた ' s 病院。書面によるインフォームド コンセントは、それらのサンプルを使用する患者から得られました。参加者は、次の基準に従って上映: 女性、非小細胞肺癌を高度な egfr 遺伝子の 2 つのセッションの後、病気の進行、エルロチニブ併用療法を対象とした、以前サンガー シーケンスによって示される egfr 遺伝子の p.L858R 変異と抵抗の原因を分析し、新薬のターゲットを見つけるに葉緑体に適用した ER-Seq

。

1 です。 cfDNA とゲノム DNA (gDNA) の末梢血からの DNA 抽出

  1. 10 mL 採取管の末梢血を収集、反転優しく上下 6-8 回をミックス。細胞の剪断を避けるため。72 時間 6-37 ° C でコレクションの管に血液サンプルを格納できます
    2. 。
  2. 1600 (± 150) で 10 分間室温でコレクションの管を遠心分離機 g. x
  3. コレクションの管からペレット層 (白血球) を乱すことがなく使い捨てピペットを用いた遠心管を適切にラベル 4 つのきれいな 2 mL に上清 (プラズマ) を転送します
    4. 。 きれいな使い捨てピペット 2 ml を適切に使用するセルの
  4. Transfer1 mL 遠心管をラベル付けされます。セルは、-20 ° C で保存またはステップ 1.8 の前に寒いをすることができます
    5. 。
  5. 遠心分離機の 4 ° C で 10 分間の 16000 (± 150) (手順 1.3) からプラズマ x の g.
  6. 転送として正しくラベル付け遠沈管をきれいにするプラズマ " プラズマ "、汚染を避けるために下部 ~0.1 mL 残気量を残します。ステップ 1.7 まで-80 ° C でプラズマを格納します
    7. 。
  7. CfDNA (緯度が含まれています) を分離するステップ 1.6 からプラズマ 3 mL を使用して次のメーカー市販のキットを使用して ' の指示
    8. 。
  8. 次のメーカー市販のキットを使用して gDNA を分離する手順 1.3 から白血球細胞の使用 200 μ L ' の指示
    。 注: 両方 cfDNA と gDNA を使用する前に-20 ° C で保存できます
    9. 。
  9. は、cfDNA と gDNA (表 2) のさまざまな品質コントロールを適用します。バイオアナライザー サンプル劣化や gDNA 汚染のレベルを決定するための標準化された方法によって品質管理を実行します。CfDNA 抽出の質のピーク解析を 図 1 のように表示されます
    。 注: cfDNA のピーク時のサイズは約 170 跪く注 cfDNA でまれな突然変異の検出に効果的で高品質ライブラリである DNA の量を増やすこと。少なくとも 30 ng cfDNA (30,000 枚) の使用をお勧めします
    10. 。

2。図書館準備

注: 断片化された DNA の基本ライブラリ構築に関する cfDNA ピーク サイズ 〜 170 bp の断片的に存在して、断片化される必要はありません

。 200-250 bp フラグメントを取得する超音波処理によって
  1. フラグメント コントロール サンプル (gDNA)。
    1. GDNA クリーン超音波管内トリス EDTA バッファーの 100 μ L のサンプルの準備 1 μ g.
    2. 超音波処理プログラムを 30 として設定 s 12 分の合計のための 12 のサイクルをオフにおよび 30 s
    3. 、超音波処理後製品 (5 μ L) 2% の agarose のゲルの分析を実行して、200-250 bp の断片が含まれて確認します
      4. 。
    4. の断片化のすべての製品を新しい 1.5 mL チューブに転送し、正しいフラグメントを選択する 5 分用の磁気ビーズの 150 μ L でインキュベートします
      5. 。
    5. 磁気ラック 30 用に管を置くことによって上澄みを除去 s ・
    6. は、磁気のラックの上にチューブ (新鮮な) 80% エタノール 200 μ L でビーズを洗ってください。30 間インキュベート上澄みを削除する前に s。もう一度繰り返します
      7. 。
    7. エアー乾燥管蓋が磁気ラックにとどまっている間開いたままビーズです。DNA ターゲットがうまく回復するかどうかを確認する overdried ビーズを避けてください。紫外/可視分光法による定量化続く DNA のフラグメントを解決するビーズに 10 mm トリス-HCl (pH 8) 32 μ L を追加することによってビーズからの DNA のフラグメントを溶出します
      。 注: 少なくとも 200 ng は次の実験に必要な
      8. 。
  2. 終わり準備反応
    注: フォロー メーカー ' s 命令し必要に応じて変更します。CfDNA; の使用 30 ngコントロールと gDNA 1 μ g。 滅菌ヌクレアーゼ フリー チューブで cfDNA の
    1. を追加 7 μ L 反応バッファー、酵素ミックス、30 の 3 μ L の ng ddH 2 O 60 μ L の容量を追加するとします。別のチューブで上記のコンポーネントを追加、1 μ g の cfDNA ではなく gDNA
      2. 。
    2. ミックスと 20 ° C、30 分続いて、たちで 30 分の 65 ° C 加熱蓋なしで混合物を孵化させなさい。次のステップに進んでください
      3. 。
  3. アダプター結紮
    1. 結紮マスター ミックスの追加 30 μ L、結紮エンハンサーの 1 μ L と 2.2 の段階から混合物に一意のシーケンス アダプターの 4 μ L.
    2. 20 の ° c 加熱蓋なしたちで 15 分間加温します
      3. 。
    3. 磁気ビードを再停止しなさい、次のステップの前に少なくとも 30 分間室温でビーズを残して渦
      4. 。
    4. 前述のように混合物に再懸濁の磁気ビーズの 87 μ L を追加; 上下ピペッティングでよく混ぜるし 5 分間室温でインキュベート
    5. 洗浄し、空気乾燥ビーズ ステップ 2.1 で説明されているようです
      6. 。
    6. 10 mM トリス-HCl (pH 8) の 20 μ L を追加することによってビーズから DNA ターゲットを溶出します
      7. 。
  4. アダプターと結紮濃縮 DNA 断片
    1. 追加 20 μ L アダプター結紮 DNA のフラグメント化、インデックス プライマー/i7 の 5 μ L (2.5 μ L プライマー P7 (22) とシーケンス用プライマー P5 (22) の 2.5 μ L) の 25µLライブラリ増幅マスター ミックスと ddH 2 O 50 μ L の総ボリュームにします
      2. 。
    2. PCR 増幅アダプター結紮 DNA と熱サイクル通り: 45 98 ° C で初期変性 s、15 ° C の熱処理の後に 8 サイクル (cfDNA) または 4 サイクル (gDNA) s、65 ° C、30 s、72 ° C、30 s)、および 60 のための 72 ° C で最終的な拡張 s、4 で温度を保持し、° C
    3. に買収したフラグメントを取得する DNA を PCR 濃縮浮遊磁気ビーズの追加 45 μ L.
    4. 溶出 DNA 断片の 10 mm トリス-HCl (pH 8) 30 μ L でアダプターを使用します
      5. 。
  5. ライブラリ品質管理
    1. 製造元に従う ' s プロトコル アダプターを測定する市販キットの結紮 DNA 濃度。バイオアナライザーを使用して DNA の品質を決定します
      2. 。

3。ターゲット DNA キャプチャ

注: ターゲット濃縮を特別に設計されたカスタム シーケンス キャプチャ ・ プローブを使用してカバーする 12 から知られている腫瘍関連ドライバー変異 1021 kb ターゲット濃縮地域をして行った異なったタイプの腫瘍です。メーカーに変更 ' s プロトコルの詳細については、次の手順を実行します

。
  1. ライブラリをプールのブロック
    1. 追加 1.5 μ g (cfDNA のプールにライブラリの最大数は 6、gDNA は 20) ステップ 2 で P5 Block(100P) P7 Block(100P) の 8 μ L、5 μ L ベッド 1 DNA の 8 μ L (1 μ g/μ L) 生殖不能の管に。60 に設定真空濃縮を使用して管の内容を乾燥 ° C
  2. DNA キャプチャ プローブ ライブラリを交配させる。
  3. 3.1: 8.5 μ L 2 X 交配バッファー、交配エンハンサーとヌクレアーゼ フリー ddH 2 O. 1.8 μ L の 2.7 μ L のステップからチューブに次のコンポーネントを追加
    1. ミックスで上下にピペッティングおよび 95 ° C で 10 分間で thermomixer で孵化させなさい
    2. 次の孵化、すぐにカスタム プローブの 4 μ L を追加。65 ・ #17 でサーマルサイクラーにサンプルをインキュベートします。6;4 h の 75 ° C に加熱してふた付き C
  4. DNA 断片のキャプチャ
    1. 非連結の DNA を削除するビーズ洗浄続いてストレプトアビジン ビーズを交配させられたターゲット DNA を孵化させなさい。メーカーによると市販のキットを使用して ' フラグメントのキャプチャされた DNA の再懸濁のビーズの最終的な 20 μ L を得るための指示します
      2. 。
  5. キャプチャされた DNA の増幅断片
    1. コマーシャルを使用して実行の PCR は、メーカーによると 2 μ M のバックボーンのオリゴヌクレオチド、キット ' の指示
      2. 。
    2. ビーズ 10 mm トリス-HCl (pH 8) 30 μ L の溶出によってバインドされる増幅対象 DNA のフラグメントの場合、PCR の反作用が完了すると、PCR の製品に直接中断されたビーズの 45 μ L を追加豊か
      3. 。
  6. ライブラリ定量キットと DNA のフラグメントを定量化し、バイオアナライザー ( 図 2) で平均フラグメントの長さを決定します
。

4 シーケンス

  1. シーケンスが生成された 18 h 合計データは最大 60 ギガバイト ベンチトップ シーケンサー上で 75 bp ペアエンド動作を使用してライブラリを多重化、15 G は制御サンプル gDNA 患者サンプル cfDNA と 1 G 必要です。
。

5。 データ解析ワークフロー

注: 図 3 一般的な作業の流れとデータ分析のプロセスが表示されます。データ解析パラメーターとコマンドは以下に示す

。
  1. 低画質読み取りのフィルター処理、エラーおよび NCfilter を使用して UID のマスキング用に修正します
    。 NCfilter(own)
    NCfilter フィルター -l 5 - q 0.5 n 0.1 T 3 G-1 fastq1-2 fastq2
    realSeq(own)
    python 箱/realRealSeq MaskUID-1 fq1-2 fq2 o 出力ディレクトリ -p プレフィックス -u 4 s 7 m 3 -i uidFile-f.
  2. 参照ゲノム hg19 (ヒトゲノム 19) を見つけて mem BWA (バージョン 0.7.12-r1039) を使用して結果を配列ゲノム解析ツールキット (GATK) (バージョン 3.4-46-gbc02625) を再編成します
    。 bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
    java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
    Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
    GenomeAnalysisTK.jar T RealignerTargetCreator R hg19 -L targetRegion-dbsnp 知られている —
    allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - 私 cancerBam-私 normalBam
    java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
    Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T IndelRealigner R hg19-dbsnp を知られています。
    - allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals 間隔-私 cancerBam-私 normalBam
  3. クラスター UID と拠点 PCR/シーケンスによって導入された、基本品質を変更エラーを修正テンプレート フラグメントの位置によると重複します
    。 realSeq(own)
    python realSeq/箱/realSeq クラスター b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o しかし-p
    プレフィックス -m 6
  4. BWA 槍玉によるクラスターの重複を再調整
    bwa mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
  5. GATK (バージョン 3.4-46-gbc02625) を使用して基本品質スコアの再校正に続いてローカル再編を実行します
    。 付近の再編: java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T RealignerTargetCreator R hg19 -L targetRegion-dbsnp allowPotentiallyMisencodedQuals を知られている -nt 10● cancerBam-私 normalBam
    java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar T IndelRealigner R hg19-dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals-targetIntervals を知られています。間隔-私 cancerBam-私 normalBam
    基本品質スコア再校正: java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/- GenomeAnalysisTK.jar -T の瓶 BaseRecalibrator R hg19 -L targetRegion -knownSites dbsnp - knownSites 宇宙 allowPotentiallyMisencodedQuals 高専 10 - 私 bam-o grp java-d64-サーバー - XX: + UseParallelGC - XX: ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-GenomeAnalysisTK.jar -T の jar PrintReads-私 bam - BQSR grp ooutbam -R hg19 高専 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
  6. SNV (単一ヌクレオチドのバリアント) や塩基 (小さな挿入または削除) を呼び出す、低周波変異の精度はさらに確認 GSR (良いサポート読み取り) で両方の前方および逆引きのストランドを読むペアと対照群 (生殖細胞系突然変異) とベースライン データベースによるろ過します
    。 realDcaller(own)
    python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O-L 2 cancerBam normalBam -p 30
  7. CNV (コピー数変異) を呼び出すのためのコントロールとして基準サンプルを使用します
    。 NCcnv(own)
    python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv - normgt normalBam - tumgt cancerBam - repdb repeatMarsk
  8. Realigned、マップされていないクリップと耳障りなペアの読み取り SV (構造変化) を呼び出します
    。 NCsv(own)
    python NCsv-t tmpdir - r hg19-o outputdir x トラン スクリプト -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

結果

1021 kb プローブの ER Seq で使用される濃縮対象地域は、表 1に示すように 12 の共通の腫瘍における遺伝子変異の 95% 以上をカバーします。これらのプローブの広い範囲は、癌患者の大半に適用されるこのプロセスになります。さらに、当社独自シーケンス アダプターとベースライン データベース スクリーニング、まれな突然変異を正確に検出...

ディスカッション

しかし葉緑体解析法の応用はまだ臨床ルーチンではない循環腫瘍 DNA (葉緑体) の存在は 30 年以上も前を発見されました。葉緑体メソッドの実用的なアプリケーションに興味は、葉緑体の検出・解析技術の開発と増加しています。腫瘍監視緯度微小残存病変、療法および腫瘍の進化と腫瘍内の不均一性の13、背景の下で腫瘍分子プロファイルへの応答の評価のための低侵襲...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

この作品は、Geneplus-北京研究所によってサポートされます。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
QIAamp Circulating Nucleic Acid KitQiagen55114DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA
QIAamp DNA Blood Mini KitQiagen51105DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay KitInvitrogenQ32854Measure cfDNA concentration
Quant-iT dsDNA BR Assay KitInvitrogenQ32853Measure library concentration
Agilent DNA 1000 ReagentsAgilent5067-1504Measure cfDNA and library fragments
The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for IlluminaNEBE7645LLibrary Preparation
Agencourt SPRIselect ReagentBeckmanB23317DNA fragment screening and purification
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100MLSigma93283Dissolution
xGen Lockdown ProbesIDT——xGen Custom Probe
Human Cot-1 DNALife15279-011Targeted DNA capture
Dynabeads M-270 StreptavidinLife65305Targeted DNA capture
xGen Lockdown ReagentsIDT1072281Targeted DNA capture
KAPA HiFi HotStart ReadyMixKAPAKK2602post-capture PCR enrichment libraries
KAPA Library Quantification KitKAPAKK4602Measure library concentration
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)illuminaFC-404-2002Sequence
Centrifuge5810eppendorf5810
Nanodrop8000Thermo Scientific8000Measure gDNA concentration
Qubit 2.0InvitrogenQuantify
Agilent 2100 BioanalyzerAgilent
ThermoMixer CeppendorfIncubation
16-tube DynaMagTM-2 MagnetLife12321D
Concentrator pluseppendorf
PCRABsimplyamp
QPCRAB7500Dx
NextSeq 500illumina

参考文献

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126 cfDNA DNA ER Seq

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