Détection des Mutations rares dans ADNct à l’aide de prochaine génération séquençage

Résumé

Cet article décrit une technique de détection des mutations de basse fréquence dans ADNct, ER-suiv. Cette méthode se distingue par son utilisation unique de correction d’erreur bidirectionnelle, un fond spécial filtre et acquisition moléculaire efficace.

Résumé

L’analyse d’ADN de tumeur (ADNct) à l’aide de la nouvelle génération séquençage (NGS) en circulation est devenu un outil précieux pour le développement de l’oncologie clinique. Toutefois, l’application de cette méthode est difficile en raison de sa faible sensibilité pour analyser la quantité de trace d’ADNct dans le sang. En outre, la méthode peut générer des résultats faussement positifs et négatifs de cette analyse de séquençage et ultérieure. Afin d’améliorer la faisabilité et la fiabilité de la détection d’ADNct dans la clinique, nous présentons une technique qui enrichit les mutations rares pour le séquençage, enrichir la Mutation Rare séquençage (ER-Seq). ER-Seq peut distinguer une seule mutation hors de 1 x 10⁷ nucléotides de type sauvage, qui en fait un outil prometteur pour détecter les altérations génétiques de fréquence extrêmement basse et est donc très utile dans l’étude heterogenicity de la maladie. En vertu de la ligature de l’adaptateur de séquençage unique, cette méthode permet une récupération efficace des molécules ADNct, tandis que dans le même temps corriger des erreurs dans les deux sens (sens et antisens). Notre sélection de sondes 1021 kb enrichit la mesure des régions cibles qui couvrent plus de 95 % des mutations dans les 12 tumeurs pilote axés sur la tumeur. Cette méthode rentable et universelle permet une accumulation particulièrement bien réussie des données génétiques. Après filtrage efficacement une erreur de fond, ER-seq peut détecter précisément des mutations rares. En utilisant une étude de cas, nous présentons un protocole détaillé démontrant la conception de la sonde, la construction de la bibliothèque et méthodes de capture d’ADN cible, tout en incluant aussi le workflow d’analyse de données. Le processus pour réaliser cette méthode en général prend 1 à 2 jours.

Introduction

Le séquençage de prochaine génération (NGS), un outil puissant pour enquêter sur les mystères du génome, peut fournir une grande quantité d’information, qui peut révéler des altérations génétiques. L’application de l’analyse de la NGS dans la clinique est devenue plus fréquente, en particulier pour la médecine personnalisée. L’une des plus grandes limites de NGS, cependant, est un taux élevé d’erreurs. Même si cela est jugé approprié pour étudier les mutations héritées, l’analyse des mutations rares est grandement limitée^1,2, en particulier lors de l’analyse ADN obtenue une biopsie « liquide ».

Tumeur en circulation ADN (ADNct) est acellulaire ADN (cfDNA) dans le sang qui est versé de cellules tumorales. Dans la plupart des cas, la quantité d’ADNct est très faible, ce qui rend sa détection et analyse très difficile. Cependant, ADNct possède de nombreuses fonctionnalités attrayantes : son isolement est minimalement invasive, il peut être détecté dans les premiers stades de la croissance tumorale, le niveau d’ADNct reflète l’efficacité thérapeutique et ADNct contient des mutations de l’ADN trouvées dans les lésions primaires et métastatiques ^{3 , 4 , 5}. par conséquent, compte tenu de l’évolution rapide de la technique de la NGS et l’analyse, l’application de détection d’ADNct est devenue plus attrayante.

Séquençage massivement parallèle différentes approches ont été utilisées pour la détection d’ADNct, mais aucune de ces approches ont été acceptés pour utilisation en routine dans les cliniques en raison de leurs limitations : faible sensibilité, manque de polyvalence et un coût relativement élevé^{6 ,7,8}. Par exemple, séquençage duplex, basé sur une étiquette identifiant unique (UID), à plusieurs reprises corrige les erreurs dans le consensus de façon bidirectionnelle, remédier à la plupart des erreurs de séquençage. Cependant, la faisabilité de cette méthode est perdue en raison de son coût élevé et les données à faible utilisation^9,10. De même, l’ACPP-Seq et sa version améliorée, CAPP-IDES^11,12, ont une plus grande praticité dans la détection de cfDNA, bien que la précision et l’universalité de ces méthodes doivent être améliorés.

Pour répondre au besoin actuel d’ADNct précis de détection et d’analyse, nous avons élaboré une nouvelle stratégie, enrichir les Mutation Rare séquençage (ER-Seq). Cette approche combine le texte suivant : adaptateurs de séquençage unique pour récupérer efficacement les molécules ADNct, avec correction d’erreur bidirectionnelle et la capacité de distinguer une seule mutation de > 1 × 10⁷ nucléotides de sauvage ; sondes de 1021 kb qui enrichissent la mesure des régions cibles qui couvrent plus de 95 % des mutations liées à la tumeur de 12 tumeurs, y compris le cancer du poumon, cancer colorectal, cancer de l’estomac, cancer du sein, cancer du rein, cancer du pancréas, cancer du foie, cancer de la thyroïde, cancer du col utérin, cancer de l’oesophage et carcinome de l’endomètre (tableau 1) ; et base de données de référence de dépistage rendant efficace et facile à détecter précisément des mutations rares dans ADNct.

Pour construire une base de données de base, trouver toutes les mutations de gène par ER-Seq d’un certain nombre du même type d’échantillons (~ 1000 au début). Ces mutations réelles doivent être vérifiées par plusieurs autres méthodes de détection fiable et analyse. Ensuite, résumer le motif des mutations fausses et toutes les mutations fausses pour construire la base de données de base initial de cluster. Continuez à ajouter des mutations fausses trouvées des expériences subséquentes de séquençage à cette base de données. Cette base de données de base devient donc une base de données étendue dynamique, ce qui améliore la précision de séquençage.

Afin de promouvoir le progrès dans le diagnostic de tumeur et le suivi, nous présentons ER-Seq, une méthode abordable et réalisable pour l’acquisition de données universelles. Nous présentons une étude de cas qui a subi une analyse ER-Seq, démontrer l’exactitude des informations pour la détection des mutations rares et faisabilité pour une utilisation en clinique.

Protocole

échantillons de tumeur et des échantillons de sang ont été obtenus selon un protocole approuvé par le Comité éthique de Peking University peuple ' s Hospital. Consentement éclairé a été obtenu chez les patients à utiliser leurs échantillons. Les participants ont été sélectionnés selon les critères suivants : femelle, avancé Non-Small Cell Lung Cancer, mutation p.L858R EGFR indiquée par précédent Sanger Sequencing, progression de la maladie après deux session de l’EGFR, thérapie à l’Erlotinib, ciblée et ER-Seq, qui fut appliquée aux ADNct pour analyser la cause de la résistance et trouver de nouveaux médicaments cibles.

1. Extraction de l’ADN du sang périphérique pour cfDNA et l’ADN génomique (ADNg)

1. recueillir 10 mL de sang périphérique dans un tube de prélèvement, inverser doucement de haut en bas 6 - 8 fois pour mélanger. Éviter le cisaillement de la cellule. Des échantillons de sang peuvent être stockés dans le tube de prélèvement à 6-37 ° C pendant 72 heures.
2. Centrifuger le tube de prélèvement à température ambiante pendant 10 min à 1600 (±150) x g.
3. Transférer le surnageant (plasma) du tube collection à quatre mL 2 nettoyer convenablement étiquetés tubes à centrifuger à l’aide d’une pipette jetable sans remuer le pellet (globules blancs).
4. Santé1 mL des cellules à l’aide d’une pipette propre jetable à une 2 mL convenablement étiquetés tube à centrifuger. Les cellules peuvent être stockées à-20 ° C ou plus froid avant l’étape 1.8.
5. Centrifuger le plasma (de l’étape 1.3) pendant 10 min à 4 ° C et 16000 (±150) x g.
6. Transférer le plasma pour nettoyer les tubes à centrifuger correctement étiquetés comme " plasma ", laisser ~0.1 mL de volume résiduel en bas pour éviter toute contamination. Conserver le plasma à-80 ° C jusqu'à l’étape 1.7.
7. Utiliser 3 mL de plasma de l’étape 1.6 pour isoler cfDNA (contient des ADNct) à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, après le fabricant ' instructions de s.
8. Utilisation 200 µL de cellules de sang blanches de l’étape 1.3 pour isoler la génomique à l’aide d’un kit disponible dans le commerce, après le fabricant ' instructions de s.
   NOTE : Les cfDNA et gDNA peuvent être stockés à-20 ° C avant utilisation.
9. S’appliquent à différents contrôles de qualité pour cfDNA et ADNg (tableau 2). Réaliser un contrôle de qualité par une méthode normalisée pour le bioanalyzer déterminer les niveaux de contamination ADNg et/ou de dégradation de l’échantillon. L’analyse de la qualité de l’extraction de cfDNA pic doit ressembler à la Figure 1.
   Remarque : La taille de la pointe de cfDNA est environ 170 BP. Note que, augmentant la quantité d’ADN se traduira par une bibliothèque de qualité supérieure pour la détection efficace des mutations rares dans cfDNA. Nous vous recommandons d’utiliser au moins 30 ng cfDNA (30 000 exemplaires).

2. Préparation de la bibliothèque

Remarque : concernant la construction de bibliothèque de base sur les fragments d’ADN, cfDNA existe dans les fragments avec un pic taille ~ 170 bp et n’a donc pas besoin d’être fragmentés.

1. Fragment du contrôle de l’échantillon (ADNg) par sonication pour obtenir des fragments de bp 200-250.
   1. Préparer 1 µg d’échantillon ADNg dans 100 µL de tampon Tris-EDTA dans un tube propre sonication.
   2. Définir le programme de sonication que 30 s sur et 30 s éteint pendant 12 cycles pour un total de 12 min.
   3. Après sonication, vérifiez le produit (5 µL) contient des fragments de bp 200-250 en exécutant une analyse avec le gel d’agarose à 2 %.
   4. Transférer tous les produits de fragmentation dans un nouveau tube de 1,5 mL et incuber avec 150 µL de billes magnétiques pendant 5 min sélectionner les fragments correctes.
   5. Enlever le surnageant en plaçant le tube sur un support magnétique pendant 30 s.
   6. Laver les billes avec 200 µL d’éthanol à 80 % (fraîchement préparé) avec le tube en restant sur le support magnétique. Incuber pendant 30 s avant de retirer le surnageant. Répéter une fois.
   7. Sécher à l’air les perles avec le couvercle de tube ouvert tout en restant sur le support magnétique. Évitez les perles overdried pour s’assurer que la cible ADN récupère bien. Éluer les fragments d’ADN de talons en ajoutant 32 µL de 10 mM Tris-HCl (pH 8) aux talons pour résoudre les fragments d’ADN suivies de quantification par spectroscopie UV/Vis.
      NOTE : au moins 200 ng est nécessaire pour les expériences suivantes.
2. Fin Prep réaction
   Remarque : fabricant de suivre ' instruction s et modifier au besoin. Utilisation 30 ng de cfDNA ; et 1 µg d’ADNg comme contrôle.
   1. 7 Ajouter µL de tampon de réaction, 3 µL du mélange enzymatique, 30 ng de cfDNA dans un tube stérile exempte de nucléase et ajoutez des ddH ₂ O au volume total de 60 µL. Dans une éprouvette, ajoutez les composants ci-dessus mais avec 1 µg d’ADNg au lieu de cfDNA.
   2. Mix et incuber le mélange à 20 ° C pendant 30 min, suivie de 65 ° C pendant 30 min dans un thermocycleur lorsque le couvercle est chauffé. Procéder immédiatement à l’étape suivante.
3. Adaptateur ligature
   1. Ajouter 30 µL du mélange maître ligature, 1 µL de l’enrichisseur de ligature et 4 µL des cartes uniques de séquençage au mélange de l’étape 2.2.
   2. Incuber à 20 ° C pendant 15 min dans un thermocycleur lorsque le couvercle est chauffé.
   3. Vortex pour remettre en suspension les billes magnétiques et laisser les perles à température ambiante pendant au moins 30 min avant la prochaine étape.
   4. Ajouter 87 µL de billes magnétiques remises en suspension au mélange mentionné précédemment ; bien mélanger en pipetage de haut en bas et puis incuber à température ambiante pendant 5 min.
   5. Lavage et l’air sec les perles comme décrit au point 2.1.
   6. Éluer la cible de l’ADN de la Perle en ajoutant 20 µL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
4. Enrichissement des fragments d’ADN ligaturés avec adaptateur
   1. fragments d’ajouter 20 µL d’ADN adaptateur ligaturé, 5 µL d’Index Primer/i7 (2,5 µL Amorce-P7 (22:00) et 2,5 µL de Primer-P5 (22:00), à des fins de séquençage), 25 µL de Bibliothèque amplification mix master et FD ₂ O pour un volume total de 50 µL.
   2. PCR amplifier l’ADN adaptateur ligaturé et cycle thermique comme suit : une dénaturation initiale à 98 ° C pour 45 s, suivie de 8 cycles (cfDNA) ou 4 cycles (ADNg) de recuit ° C pendant 15 s, 65 ° C pendant 30 s, 72 ° C pendant 30 s) et une extension finale à 72 ° C pendant 60 s, ensuite en maintenant la température à 4 ° C.
   3. Ajouter 45 µL de suspension perles magnétiques à l’ADN enrichi en PCR pour obtenir des fragments acquis.
   4. Fragments d’ADN éluer avec adaptateurs dans 30 µL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Bibliothèque de contrôle de la qualité
   1. suivre le fabricant ' s protocole pour la trousse commerciale mesurer l’adaptateur ligaturé concentration d’ADN. Utilisez le bioanalyzer pour déterminer la qualité de l’ADN.

3. Ciblées de capture de l’ADN

Remarque : enrichissement de la cible a été réalisée en utilisant une séquence personnalisée-sonde de capture qui est spécialement conçue pour une région d’enrichissement cible 1021 kb couvrant les mutations connues associées à la tumeur pilote du 12 différents types de tumeurs. Modifications le fabricant ' protocole s sont détaillées dans les étapes suivantes.

1. Blocage
   1. Ajouter 1,5 µg de mise en commun des bibliothèques (nombre maximal de bibliothèques à la piscine de cfDNA est 6, ADNg est 20) de l’étape 2, 8 µL de P5 Block(100P), 8 µL de P7 Block(100P) et 5 µL d’ADN de Cot-1 (1 µg/µL) dans un tube stérile. Sécher le contenu du tube à l’aide d’une pompe à vide à 60 ° C.
2. Hybrident la capture de l’ADN des sondes avec la bibliothèque.
   1. Ajouter les composants suivants pour le tube de l’étape 3.1 : 8,5 µL de tampon d’hybridation de X 2, 2,7 µL du rehausseur de l’hybridation et 1,8 µL de ddH exempte de nucléase ₂ O.
   2. Mix par pipetage de haut en bas et incuber dans un thermomixer à 95 ° C pendant 10 min.
   3. Après l’incubation, ajouter immédiatement 4 µL de la sonde de mesure. Incuber les échantillons dans un thermocycleur à 65 & #176 ; C avec couvercle chauffé à 75 ° C pendant 4 h.
3. Fragments d’ADN capture
   1. Incuber l’ADN cible hybridée avec des perles de streptavidine lavés les perles pour supprimer l’ADN non lié. Utilisez la trousse commerciale selon fabricant ' instructions de s pour obtenir un final 20 µL de billes remises en suspension avec l’ADN capturé fragments.
4. Fragments d’amplification de l’ADN capturé
   1. PCR à effectuer à l’aide de la publicité kit avec 2 oligonucléotides d’épine dorsale µM, selon fabricant ' instructions de s.
   2. Réaction PCR le quand est terminée, ajouter 45 µL de suspension perles directement sur le produit PCR et enrichir les fragments d’ADN amplifiés cible liés aux talons par élution avec 30 µL de 10 mM Tris-HCl (pH 8).
5. Quantifier les fragments d’ADN avec le kit de quantification de bibliothèque et de déterminer la longueur des fragments de moyenne par le Bioanalyzer ( Figure 2).

4. séquençage

1. séquence multiplexés bibliothèques utilisant 75 bp jumelé-fin s’exécute sur un séquenceur de benchtop pour données Total 18 h produites sont jusqu'à 60 gigaoctets, 15 G est nécessaire pour l’échantillon de patients cfDNA et 1G pour contrôle échantillon ADNg.

5. flux de données analyse

Remarque : la Figure 3 affiche le processus d’analyse travaux généraux de débit et de données. Paramètres d’analyse de données et commandes sont décrites ci-dessous.

1. Filtre lectures de faible qualité et corriger les erreurs et le masquage des UID à l’aide de NCfilter.
   NCfilter(own)
   NCfilter filtrer -l 5 - q 0,5 -n 0,1 -T fastq1 - G -1 3-2 fastq2
   realSeq(own)
   python bin/realRealSeq MaskUID -1 fq1-2 fq2 -o sortie dir PS - préfixe -u 4 a 7 - m 3 -i uidFile-f.
2. Référencement génome hg19 (génome humain 19), recherchez les résultats de séquençage à l’aide de mem BWA (version 0.7.12-r1039) et réaligner avec Genome Analysis Toolkit (GATK) (version 3.4-46-gbc02625).
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
   java-d64-server - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g - Xmx10g -
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar
   GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-connu dbsnp —
   allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 - j’ai cancerBam-j’ai normalBam
   java-d64-serveur - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g —
   Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-connu dbsnp
   - allowPotentiallyMisencodedQuals — targetIntervals intervalles-je cancerBam-je normalBam
Les doublons selon les UID et la position des fragments de modèle, qui permettra de corriger l’erreur bases introduites par PCR/séquençage et modifier la qualité de base de cluster
3. .
   realSeq(own)
   CLUSTER de python realSeq/bin/realSeq - b unmarkdup_sort_merge.bam - r chipRegion -o output_dir -p
   préfixe -m 6
4. ré-aligner les doublons en cluster par BWA MEM
   BWA mem -t 3 hg19 fastq1 fastq2
5. effectuer un remaniement des locaux suivie d’un réétalonnage de partition de base de qualité à l’aide de GATK (version 3.4-46-gbc02625).
   Réalignement du local : java-d64-server - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T RealignerTargetCreator -R hg19 -L targetRegion-connu dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals -nt 10 -Je cancerBam-je normalBam
   java-d64-server - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T IndelRealigner -R hg19-connu dbsnp - allowPotentiallyMisencodedQuals - targetIntervals intervalles-je cancerBam-je normalBam
   base recalibrage de qualité-score : java-d64-server - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/ - jar GenomeAnalysisTK.jar -T BaseRecalibrator -R hg19 -L targetRegion - knownSites dbsnp - knownSites cosmique - allowPotentiallyMisencodedQuals - nct 10 - j’ai java de grp bam -o-d64-server - XX : + UseParallelGC - XX : ParallelGCThreads = 8-Xms2g-Xmx10g-Djava.io.tmpdir=/tmp/-jar GenomeAnalysisTK.jar -T PrintReads-j’ai bam BQSR - grp -o outbam -R hg19 - nct 8 - allowPotentiallyMisencodedQuals
6. pour SNV (variante mononucléotidiques) et appel de INDEL (petites insertions ou suppressions), la précision des faible fréquence des mutations est encore confirmée par GSR (bon soutien lectures) avec les deux brin avant et arrière lire paires et filtration à travers le groupe de contrôle (mutations germinales) et la base de données de référence.
   realDcaller(own)
   python realDcaller -f hg19 - r chipRegion - C baselineDB - O -L 2 cancerBam normalBam -p 30
7. utiliser des échantillons de référence sous forme de contrôle pour les appels de la CNV (variation de nombre de copie).
   NCcnv(own)
   python NCcnv -o cnvdir -t tmpdir - r chipRegion cnv--normgt normalBam--tumgt cancerBam--repdb repeatMarsk
8. réalignement non cartographiée, clips et des lectures de couple discordant à appeler SV (Variations structurales).
   NCsv(own)
   python NCsv -t tmpdir - r hg19 -o outputdir x - transcription -w bwapath -n 4 normalBam cancerBam

Résultats

Les sondes de 1021 kb enrichi cible les régions utilisées en ER-Seq sont affichées dans le tableau 1, qui couvre plus de 95 % de ces mutations de gène dans 12 tumeurs courantes. L’éventail de ces sondes rend ce processus applicable à une majorité de patients atteints de cancer. En outre, nos adaptateurs de séquençage de l’unique et la projection de base de données de base permettent de détecter des mutations rares précisément.

Discussion

L’existence d’ADN de tumeur (ADNct) en circulation a été découvert plus de 30 ans, mais l’application d’analyses ADNct n’est toujours pas systématique dans la pratique clinique. Intérêt dans l’application pratique des méthodes d’ADNct a augmenté avec le développement de technologies pour la détection d’ADNct et d’analyse. La surveillance des tumeurs avec ADNct offre une approche mini-invasive pour l’évaluation de la maladie résiduelle microscopique, réaction au traitement et les profils m...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit	Qiagen	55114	DNA Extraction from Peripheral Blood for cfDNA
QIAamp DNA Blood Mini Kit	Qiagen	51105	DNA Extraction from Peripheral Blood for gDNA
Quant-iT dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen	Q32854	Measure cfDNA concentration
Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen	Q32853	Measure library concentration
Agilent DNA 1000 Reagents	Agilent	5067-1504	Measure cfDNA and library fragments
The NEBNext UltraII DNA Library Prep Kit for Illumina	NEB	E7645L	Library Preparation
Agencourt SPRIselect Reagent	Beckman	B23317	DNA fragment screening and purification
Tris-HCl (10 mM, pH 8.0)-100ML	Sigma	93283	Dissolution
xGen Lockdown Probes	IDT	——	xGen Custom Probe
Human Cot-1 DNA	Life	15279-011	Targeted DNA capture
Dynabeads M-270 Streptavidin	Life	65305	Targeted DNA capture
xGen Lockdown Reagents	IDT	1072281	Targeted DNA capture
KAPA HiFi HotStart ReadyMix	KAPA	KK2602	post-capture PCR enrichment libraries
KAPA Library Quantification Kit	KAPA	KK4602	Measure library concentration
NextSeq 500 High Output Kit v2((150 cycles)	illumina	FC-404-2002	Sequence
Centrifuge5810	eppendorf	5810
Nanodrop8000	Thermo Scientific	8000	Measure gDNA concentration
Qubit 2.0	Invitrogen		Quantify
Agilent 2100 Bioanalyzer	Agilent
ThermoMixer C	eppendorf		Incubation
16-tube DynaMagTM-2 Magnet	Life	12321D
Concentrator plus	eppendorf
PCR	AB	simplyamp
QPCR	AB	7500Dx
NextSeq 500	illumina