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Resumen

Este protocolo describe un método para generar progenitores interneurona cortical y poste-mitotic interneurona precursores de células madre embrionarias del ratón usando un método modificado de cuerpo para monocapa embryoid. Estos progenitores/precursores puede ser usado en vitro fluorescencia ordenados y trasplantado en neocortex neonatal para el estudio de determinación de destino o utilizado en aplicaciones terapéuticas.

Resumen

Interneuronas corticales de GABAérgico son una población heterogénea de células que desempeñan un papel crítico en la regulación de la salida de neuronas piramidales excitatorias como sincronizar las salidas de conjuntos de neuronas piramidales. Déficits en la función de interneurona se han implicado en una variedad de trastornos neuropsiquiátricos, incluyendo autismo, la esquizofrenia y la epilepsia. La derivación de interneuronas corticales de las células madre embrionarias no sólo permite el estudio de su desarrollo y función, sino que proporciona una idea de los mecanismos moleculares subyacentes a la patogénesis de trastornos relacionados con la interneurona corticales. Interneuronas también tienen la notable capacidad de sobrevivir, migrar e integrar en host circuitos corticales poste-trasplante, haciéndolos candidatos ideales para su uso en terapias basadas en células. Aquí, presentamos un método de cuerpo para monocapa embryoid escalable, altamente eficiente, modificado para la derivación de expresa Nkx2.1 interneurona progenitores y su progenie de células madre embrionarias de ratón (troncales). Usando una línea de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP doble reportero mESC, Nkx2.1 progenitores o su progenie poste-mitotic expresando Lhx6 puede ser aislado a través de células activado por fluorescencia (FACS) de clasificación y posteriormente utilizado en un número de aplicaciones posteriores. También ofrecemos métodos para enriquecer parvalbúmina (PV) o somatostatina subgrupos de interneurona (SST), que puede ser útil para estudiar aspectos de la determinación de destino o para su uso en aplicaciones terapéuticas que se beneficiarían de interneurona enriquecido de subgrupo trasplantes.

Introducción

En ratones y seres humanos, aproximadamente la mitad de todo corticales inhibitorios interneurons (CIns) originan dentro de una estructura subcortical transitoria conocida como la eminencia ganglionar medial (MGE), donde los progenitores neuroepiteliales de CIns y neuronal y glial los subgrupos expresan el factor de transcripción Nkx2.11,2. CIn los subgrupos o subtipos son definidos por la intersección electrofisiológicos, neuroquímicos y morfológicas y características de conectividad de3,4. El CIns derivado de MGE se pueden agrupar en subgrupos no superpuestos sobre todo basan en su expresión de PV o SST, la expresión de que se correlaciona con particular electrofisiológicos y conectividad tendencias5. Disfunción de interneuronas, especialmente ésos en el subgrupo de PV, se ha implicado en múltiples neuropsiquiátricos desórdenes y enfermedades6,7. El objetivo general de este método es producir derivados de células mitóticas progenitores y precursores migratorias enriquecidos por PV o SST CIn destino para estudiar biología cortical interneurona y para uso en terapias basadas en células.

Hemos desarrollado un método escalable, altamente eficiente para la derivación de expresa Nkx2.1 interneurona progenitores y su progenie de troncales. Utilizando un Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP reportero doble mESC línea8, Nkx2.1 progenitores o su progenie poste-mitotic expresando Lhx6 puede ser aislado por FACS y posteriormente utilizado en un número de aplicaciones posteriores. Mediante la manipulación de un número de vías de señalización, duración de la cultura y modo de la neurogénesis, podemos obtener millones de precursores de interneurona fluorescente etiquetado adecuados para multitud de aplicaciones posteriores.

Aunque existen varios otros métodos para la generación de MGE-como progenitores de troncales9,10,11,12,13,14, nuestro método, que depende de la Wnt antagonista XAV-939, es particularmente eficaz en generar Foxg1/Nkx2.1 Co expresando progenitores telencéfalo. Además, la capacidad para seleccionar progenitores interneurona o su progenie poste-mitotic Lhx6 expresando a través de nuestro sistema dual de reportero, realza grandemente la capacidad de generar distintos progenitores y su progenie.

Protocolo

Nota: La línea de mESC reportero dual descrita en el presente Protocolo está disponible a petición (sande@mail.med.upenn.edu).

1. preparación de medios de comunicación

Nota: Calentar todos los medios a 37 ° C antes de su uso en cultivo celular.

  1. Medios de fibroblastos embrionarios del ratón (MEF) (para la preparación de 500 mL)
    1. Añadir el suero bovino fetal (FBS) de 50 mL a mL 449 de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), y filtro a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
    2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C hasta 1 mes o alícuota y tienda a ≤-20 ° C.
  2. Medios de N2 (para la preparación de 500 mL)
    1. Añadir 5 mL de L-alanina-L-glutamina (100 x) y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a 489,5 mL DMEM: mezcla de nutrientes F-12 (DMEM/F-12) y el filtro a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
    2. Añadir agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) y 5 mL N2 suplemento-B después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C en la oscuridad durante 1 mes.
  3. Medio de cultivo libre de suero (KSR) (para la preparación de 500 mL)
    1. Añadir 75 mL suplemento medio libre de suero, L-glutamina de 5 mL (100 x), 5 mL MEM aminoácidos no esenciales (AANE-MEM) (100 x), y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a no-413,5 mL de glutamina que contienen DMEM y filtrar a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
    2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C durante 1 mes.
  4. Media de células madre embrionarias de ratón (para la preparación de 500 mL)
    1. Añadir 75 mL células madre grado FBS, 5 mL AANE MEM (100 x), 5 mL de L-glutamina (100 x), y 500 μl 2-Mercaptoetanol (55 mM) a no-413,5 mL de glutamina que contienen DMEM y filtrar a través de una unidad de filtro de poro 500 mL 0,22 μm.
    2. Añadir a agente antimicrobiano 1 mL (50 mg/mL) después de la filtración. Almacenar los medios de comunicación a 4 ° C en la oscuridad hasta 1 mes o alícuota y tienda a ≤-20 ° C.

2. cultivo de troncales

  1. Placa de mitotically inactivas células de alimentador MEF en medios MEF sobre placas de cultivo de tejidos tratado en 3-4 x 104 células/cm2. Permiten por lo menos 12 h que instalarse en una incubadora de cultivo celular a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2 antes de las troncales de la galjanoplastia. Si no se utiliza inmediatamente, vuelva a colocar la media de la MEF cada 3 días. Disponer de MEFs si no se utiliza dentro de los 7 días de la galjanoplastia.
  2. Añadir troncales (densidad entre 1-4 x 104 células/cm2) a las placas MEF en mESC medios que contienen Factor inhibidor de leucemia de ratón (mLIF) (1.000 U/mL). Incube las células a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2.
  3. Troncales con tripsina-EDTA (0.05% tripsina) de paso (1:5-1:10) una vez que el plato se convierte en ~ 70-80% confluente o si las colonias empiezan a tocar. Esto normalmente ocurre cada 2 días, pero puede tomar hasta 4 o 5 días dependiendo de la densidad de placas iniciales.
  4. Mantener las troncales en una capa de alimentador MEF en medio de la mESC mantener la pluripotencialidad.
  5. Antes de comenzar la diferenciación, paso de las células al menos una vez en las placas de gelatina recubierto sin MEFs para diluir a las MEFs.
    1. Preparar las placas de gelatina cubierto mediante la adición de 0.1% gelatina en tampón fosfato salino (PBS) con Ca2 +/Mg2 + a un plato de cultivo de tejidos tratado y dejar a 37 ° C durante por lo menos 1 h. placa de 1.5-2 x 106 células/10 cm la placa (2.7-3.6 x 104 células/cm2) y permitir que las células para expandirse durante 2 días antes de comenzar la diferenciación.

3. diferenciando troncales a progenitores telencéfalo MGE-como

  1. Día de diferenciación (DD) 0 = "células a flotar"
    1. Después de las troncales han crecido placas de gelatina recubierto por 2 días, aspirar los medios de comunicación y lavar las células una vez con PBS sin Ca2 +/Mg2 +. Añadir suficiente tripsina-EDTA (0.05% tripsina) para cubrir la superficie de la placa (normalmente 4 mL tripsina-EDTA para un plato de cultivo de tejidos de 10 cm) y coloque las celdas en la incubadora a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2 4 min.
    2. Después de 4 minutos, apagar el tripsina-EDTA con 2 veces el volumen de medios mESC. Transferir las células a un tubo de tamaño adecuado de la centrífuga y centrifugar las células a 200 x g durante 5 minutos. Después de 5 minutos, retire el tubo y aspirar los medios de comunicación sin perturbar el pellet. Resuspender el precipitado en 1 mL KSR:N2 media (1:1) que contiene el inhibidor BMP 193189 LDN (250 nM) y los inhibidores de Wnt XAV-939 (10 μm).
    3. Medir la concentración de células usando un hemocitómetro o un contador de células automatizado. Inicio crecimiento las células como organismos embryoid (EBs) agregando 75.000 células/mL en medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene LDN-193189 (250 nM) y XAV-939 (10 μm) en platos de cultivo de tejidos no adherente. Incube las células a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2.
  2. En DD1, preparar para celular "aterrizaje" por capa platos de cultivo de tejidos tratado con poli-l-lisina (10 μg/mL en PBS con Ca2 +/Mg2 +) durante la noche (O/N) a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95% o menos de 1 h.
  3. En DD2, aspirar la poli-l-lisina y cubrir las placas con laminina (10 μg/mL en PBS con Ca2 +/Mg2 +) O/N a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95%.
    Nota: O/N es óptima, tan poco como 2 horas puede ser suficiente. Si no se utilizan las placas al día siguiente, Aspire laminina, reemplazar con PBS sin Ca2 +/Mg2 +y almacenar a 4 ° C hasta por 2 semanas.
  4. DD3 ("células de la tierra")
    1. Antes de comenzar la disociación de EB, aspirar la laminina y permita que las placas completamente seco en una campana de cultivo de tejidos. No usar placas que aparecen brillantes o visiblemente húmedo. Transferencia de la EBs con medios de comunicación en un tubo de 15 mL y centrifugar durante 3-4 min a 15 x g o hasta que el EBs han peleteado.
  5. Aspire los medios de comunicación y añadir 3 mL de solución de la separación de células que contienen DNasa (2 U/mL) e incube a 37 ° C con una humedad relativa ≥ 95% y 5% CO2 para 15 minutos película suavemente el tubo cada 3 minutos para facilitar la disociación de EB.
  6. Una vez que el EBs no son accesibles o han transcurrido 15 min, añadir 6 mL KSR:N2 (1:1) que contienen DNasa (1 U/mL) y centrifugar durante 5 min a 200 x g.
  7. Placa las células de KSR:N2 (1:1) que contiene 193189 LDN (250 nM), XAV-939 (10 μm) y el inhibidor Y-27632 de la roca (10 μm) en 4.5-5 x 104 células/cm2.

4. enriquecimiento de SST protocolo: "DD12 GFP alta Sonic Hedgehog (SHH)" (continuación de paso 3.7)

  1. En DD5, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y SSH (50 ng/mL).
  2. Preparar las placas de cultivo de tejidos para volver a platear el día 8 (paso 4.4) siguiendo las instrucciones que se indica en pasos 3.2-3.3.
  3. El DD7, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y SHH (50 ng/mL).
  4. En DD8, volver a la placa de las células.
    Nota: Aunque este paso no es esencial, volver a las células de la galjanoplastia puede reducir tipos celulares diferenciados tempranos, no deseados. Volver a también rompe pelotas de células que dificultan el análisis de immunohistochemical aguas abajo y aumenta la eficacia de FACS en más puntos del tiempo.
    1. Para volver a las células de la placa, separar las células de la placa con tripsina-EDTA (tripsina 0,05%) durante 5 minutos a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2. Sacian el tripsina-EDTA con 2 veces el volumen de KSR:N2, y centrifugar a 200 x g durante 5 minutos filtrar las células a través de un tubo de filtro de 40 μm para remover cualquier matas. Volver a la placa las células a 250.000 células/cm2 en N2/KSR (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) y Y-27632 (10 μm) con SHH (50 ng/mL).
      Nota: Si por el contrario, tomó la decisión es no volver a la placa las células DD8, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 que contienen SHH (50 ng/mL) cada 2 días de DD7 a DD12 y continuar agregar IGF-1 (20 ng/mL) y FGF-2 (10 ng/mL) hasta DD9.
  5. En DD10, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 que contienen SHH (50 ng/mL).
  6. En DD12, para obtener las células que están enriquecidas para los subtipos de SST, use FACS para aislar Lhx6::GFP-expresando solamente las células.
    1. Para separar las células, utilizar un reactivo de disociación celular que contiene tripsina no en lugar de tripsina-EDTA. Lavar las células una vez con PBS sin Ca2 +/Mg2 +. Añadir precalentada no tripsina con disociación celular reactivo con DNasa (2 U/mL) a las células. Colocarlos en la incubadora a 37 ° C con ≥ 95% humedad relativa y 5% CO2 para 10-30 min o hasta que las células se han separado. Golpee suavemente las placas cada 5 min para ayudar a la disociación.
      Nota: Para las culturas DD11-12, sólo 10-15 minutos puede ser necesario. Las culturas DD15-16, 30 min o más puede requerir para la completa disociación.
    2. Una vez que las células han levantado totalmente la placa, proceder al aislamiento de FACS usando protocolos estándar o utilizar las células de otros análisis posteriores.

5. enriquecimiento de PV protocolo: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (continuación de paso 3.7)

  1. En DD5, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Preparar las placas de cultivo de tejidos para volver a la galjanoplastia en DD8 (paso 4.4) siguiendo las indicaciones dadas en los pasos 3.2-3.3.
  3. El DD7, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
  4. En DD8, placa vuelve a las células como se describe en el paso 4.4 con las siguientes excepciones: cuando vuelva a las células de la galjanoplastia, reemplace SHH agonista pulida (SAG; 30 nM) y agregar inhibidor PKC atípica (aPKCi; 2 μm). Tomados en conjunto, los medios de comunicación re-galjanoplastia es ahora N2/KSR (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 μm), SAG (30 nM) y aPKCi (2 μm).
  5. En DD10, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm).
  6. DD11
    Nota: en este punto, las células Nkx2.1::mCherry+ se enriquecen para convertirse en PV CIns.
    1. Separar las células de la placa para FACS, usando el mismo protocolo descrito en el paso 4.6. Si la decisión se toma para recoger las células Nkx2.1::mCherry+ en un día posterior de diferenciación, omita este paso.
  7. En DD12, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD14, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD16, cambiar los medios de comunicación con KSR:N2 con aPKCi (2 μm). En DD17, recoger las células de Nkx2.1::mCherry+ utilizando el mismo protocolo descrito en el paso 4.6.

6. PV-enriquecimiento de protocolo: "DD17 mCherry baja SHH" (continuación de paso 3.7)

  1. En DD5, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL). El DD7, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1) que contiene FGF-2 (10 ng/mL) y el IGF-1 (20 ng/mL).
  2. En DD9, cambiar los medios de comunicación KSR:N2 (1:1). Partir de este momento, no hay factores de crecimiento adicionales son necesarios.
    1. Seguir cambiar el medio cada 2 días hasta la cosecha de las células en DD17.

Resultados

El protocolo descrito en este documento es una versión modificada de nuestros protocolos publicados15,16,17 y ha sido optimizado para su uso con nuestra línea de mESC dual-reportero de Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP. Mediante la adición de los inhibidores de Wnt XAV-939 de DD0-5, combinado con nuevo chapado en DD8, logramos robusta inducción Nkx2.1, en donde más del 50% de todos los núcleos DAPI...

Discusión

Mientras que este método es altamente efectivo en patrones derivados de J1 troncales (SCRC-1010), hemos experimentado éxito variable con otras líneas de mESC y aislamientos clonales. Por ejemplo, Foxg1::venus troncales (EB3-derivado; Danjo et al. 13) responden mal a este protocolo y Foxg1 inducción por DD12 es típicamente del orden de 1-2%. Por razones que no entendemos, Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP otro reportero doble clon (llamado JQ59) fue aislado simultáneamente como la línea des...

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a Xu Qing para el desarrollo de la Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP reportero doble mESC línea como Jennifer Tyson, Asif Maroof y Tim Petros por su temprano trabajo en ayudar a desarrollar este protocolo. También agradecemos a la base de citometría de flujo CHOP para asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 MH066912 (SA) y F30 MH105045-02 (DT).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
Bottle-top vacuum filter systemCorningCLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% Gelatin SolutionATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939Stemgent04-0046Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2R&D Systems233-FBResuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2R&D Systems291-G1Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632)Tocris1254Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG)Millipore566660-1MGResuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, MyristoylatedEMD Millipore539624Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

Referencias

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