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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Erzeugung von kortikalen Interneuron Stammväter und Post-mitotische Interneuron Vorstufen aus embryonalen Stammzellen der Maus mit einer veränderten Embryoid Körper-Monolayer-Methode. Diese Vorfahren/Vorstufen können werden verwendet in-vitro- Eindringmittel sortiert und in Neugeborenen Neokortex für das Studium Schicksal Bestimmung verpflanzt oder in therapeutischen Anwendungen eingesetzt.

Zusammenfassung

Kortikale GABAergen Interneuronen sind eine heterogene Bevölkerung der Zellen, die kritische Rollen bei der Regelung des Ausgang des exzitatorischen pyramidale Neuronen sowie synchronisieren die Ausgänge der pyramidalen Neuron Ensembles spielen. Defizite im Interneuron Funktion haben in einer Vielzahl von neuropsychiatrischen Störungen wie Schizophrenie, Autismus und Epilepsie verwickelt. Die Ableitung der kortikale Interneurone aus embryonalen Stammzellen nicht nur für das Studium ihrer Entwicklung und Funktion ermöglicht, sondern bietet einen Einblick in die molekularen Mechanismen der Pathogenese der kortikalen Interneuron-Erkrankungen. Interneuronen haben auch die bemerkenswerte Fähigkeit, überleben, Migration und Integration in Host kortikalen Schaltung nach Transplantation, so dass sie ideale Kandidaten für den Einsatz in zellbasierten Therapien. Hier präsentieren wir Ihnen eine skalierbare, hocheffiziente, modifizierte Embryoid Körper-Monolayer-Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen aus embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs). Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Linie, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6-mit dem Ausdruck nach dem mitotischen Nachkommen isoliert über Fluoreszenz-aktivierte Zelle sortieren (FACS) und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet. Wir bieten auch Methoden bereichern Parvalbumin (PV) oder Somatostatin (SST) Interneuron Untergruppen, die für das Studium Aspekte des Schicksal Bestimmung oder für den Einsatz in therapeutischen Anwendungen möglicherweise hilfreich, die von Interneuron Untergruppe angereicherte profitieren würde Transplantationen.

Einleitung

Bei Mäusen und Menschen, rund die Hälfte aller kortikalen hemmenden Interneuronen (CIns) stammen im Rahmen einer vorübergehenden subkortikale Struktur bekannt als mediale ganglionic Eminenz (MGE), wo neuroepithelialer Vorfahren der CIns und anderen neuronalen und Gliazellen Untergruppen Ausdrücken der Transkriptionsfaktor Nkx2.11,2. CIn Untergruppen oder Subtypen sind durch sich überschneidende morphologische, neurochemische, elektrophysiologische und Konnektivität Merkmale3,4definiert. MGE-abgeleitete CIns in gruppiert werden können meist nicht überlappende Untergruppen basierend auf ihren Ausdruck der PV oder SST, der Ausdruck der welche korreliert mit bestimmten elektrophysiologische und Konnektivität Tendenzen5. Dysfunktion von Interneuronen, insbesondere in der PV-Untergruppe hat in mehreren-neuropsychiatrischen Störungen und Krankheiten6,7verwickelt. Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist, mitotischen Vorläuferzellen Stammzellen abgeleitet und wandernden Vorstufen für PV oder SST CIn Schicksal für kortikale Interneuron Biologie zu studieren und für den Einsatz in zellbasierten Therapien angereichert zu produzieren.

Wir haben eine skalierbare und hocheffiziente Methode zur Ableitung von Nkx2.1 exprimierenden Interneuron Vorfahren und deren Nachkommen von mESCs entwickelt. Mit einem Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter mESC Zeile8, Nkx2.1 Vorfahren oder Lhx6 exprimierenden Post-mitotischen Nachkommen über FACS isoliert und anschließend in einer Reihe von downstream-Anwendungen verwendet werden können. Durch die Manipulation einer Anzahl der Signalwege, Dauer der Kultur und Modus der Neurogenese, erhalten wir Millionen von Eindringmittel beschrifteten Interneuron Vorstufen für eine Vielzahl von downstream-Anwendungen geeignet.

Obwohl einige andere Methoden gibt es zur Erzeugung von MGE-ähnlichen Vorfahren aus mESCs9,10,11,12,13,14, unsere Methode, die stützt sich auf die Wnt Antagonist XAV-939 ist besonders effizient zu generieren Foxg1/Nkx2.1 Co Teleenzephalischer Vorfahren zum Ausdruck zu bringen. Stark erhöht die Fähigkeit, für Interneuron Stammväter oder Post-mitotischen Lhx6 exprimierenden Nachkommen über unser dual Reporter-System wählen die Fähigkeit, verschiedene Vorfahren und deren Nachkommen zu erzeugen.

Protokoll

Hinweis: Die dual Reporter mESC Linie beschrieben in diesem Protokoll sind auf Anfrage möglich (sande@mail.med.upenn.edu).

(1) Media-Vorbereitung

Hinweis: Warm alle Medien auf 37 ° C vor der Verwendung in der Zellkultur.

  1. Maus embryonalen Fibroblasten (MEF) Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. 449 mL Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) und Filter durch eine Filteranlage 500 mL 0,22 µm Pore 50 mL fetalen bovine Serum (FBS) hinzufügen.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.
  2. N2-Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. Geben Sie 5 mL L-Alanin-L-Glutamin (100 X) und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) bis 489,5 mL DMEM: Nährstoff-Mischung f-12 (DMEM/F-12) und Filter durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) und 5 mL N2 Anhang-B nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln bis zu 1 Monat.
  3. Serumfreien Wachstumsmedium (KSR) (für die Zubereitung 500 mL)
    1. Fügen Sie 75 mL serumfreien Medium Ergänzung, 5 mL L-Glutamin (100 X), 5 mL MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (MEM-NEAA) (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C für bis zu 1 Monat.
  4. Maus embryonalen Stammzellen Medien (für die Zubereitung 500 mL)
    1. 75 mL Stammzellen Grade FBS, 5 mL MEM-NEAA hinzufügen (100 X), 5 mL L-Glutamin (100 X), und 500 µL 2-Mercaptoethanol (55 mM) auf 413,5 mL nicht-Glutamin enthält DMEM und Filtern durch eine 500 mL 0,22 µm Pore-Filter-Einheit.
    2. Fügen Sie 1 mL antimikrobieller Wirkstoff (50 mg/mL) nach der Filtration. Speichern Sie die Medien bei 4 ° C im Dunkeln für bis zu 1 Monat oder Aliquote und Store bei ≤-20 ° C.

2. Kultivierung mESCs

  1. Platte mitotically inaktiven MEF Feeder Zellen in MEF Medien auf Gewebekultur behandelt Teller mit 3-4 x 104 Zellen/cm2. Lassen Sie mindestens 12 Stunden für sie in einer Zelle Kultur Inkubator bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 Regeln vor der Beschichtung der mESCs. Wenn nicht sofort verwendet wird, ersetzen Sie die MEF-Medien alle 3 Tage. Entsorgen Sie MEFs, wenn nicht innerhalb von 7 Tagen nach der Beschichtung verwendet.
  2. MEF-Platten in mESC Medien Maus Leukämie hemmenden Faktor (mLIF) (1.000 U/mL) mit fügen Sie mESCs (Dichteumfang von 1-4 x 104 Zellen/cm2 hinzu). Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
  3. Durchgang mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) mESCs (1:5-1:10) Sobald das Gericht wird ~ 70-80 % Zusammenfluss oder wenn die Kolonien beginnen zu berühren. Dies in der Regel erfolgt alle 2 Tage, aber kann bis zu 4 oder 5 Tage, je nach der anfänglichen Beschichtung Dichte nehmen.
  4. Pflegen Sie die mESCs auf einem MEF Feeder Layer mESC Mittel-und Pluripotenz zu halten.
  5. Vor Beginn der Differenzierung, die passage der Zellen mindestens einmal auf Gelatine beschichtete Platten ohne MEFs, die MEFs zu verdünnen.
    1. Bereiten Gelatine beschichtete Platten durch Zugabe von 0,1 % Gelatine in Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit Ca2 +/Mg2 + zu einem Gericht Gewebekultur behandelt und bei 37 ° C für mindestens 1 h Platte 1,5-2 x 106 Zellen/10 cm Platte verlassen (2,7 bis 3,6 x 104 Zellen/cm2) und lassen Sie die Zellen, für 2 Tage vor Beginn der Differenzierung zu erweitern.

3. mESCs in Richtung MGE-ähnliche Teleenzephalischer Stammväter Differenzierung

  1. Differenzierung-Tag (TT) 0 = "float Zellen"
    1. Nachdem die mESCs gewachsen sind, auf Gelatine beschichtete Platten für 2 Tage, aspirieren Sie die Medien und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie genügend Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) bedecken die Oberfläche der Platte (in der Regel 4 mL Trypsin-EDTA für eine 10 cm Gewebekultur Teller), und legen Sie die Zellen wieder in den Brutschrank bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 4 min.
    2. Stillen Sie nach 4 min die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit mESC Medien. Die Zellen auf eine entsprechend dimensionierte Zentrifugenröhrchen übertragen und die Zellen bei 200 X g für 5 min zentrifugieren. Entfernen Sie nach 5 min das Rohr und aspirieren Sie die Medien ohne zu stören das Pellet. Aufschwemmen das Pellet in 1 mL KSR:N2 Medien (1:1) mit der BMP-Inhibitor LDN-193189 (250 nM) und der Wnt-Inhibitor XAV-939 (10 µM).
    3. Messen Sie die Zellkonzentration unter Verwendung eines Hemocytometer oder automatisierte Zelle Zähler. Start wachsenden Zellen als Embryoid Körper (EBs) durch Zugabe von 75.000 Zellen/mL in KSR:N2 Medium (1:1) mit LDN-193189 (250 nM) und XAV-939 (10 µM) in Gewebekultur-anhaftende Gerichte. Inkubation der Zellen bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2.
  2. Am DD1 bereiten Sie für Zelle "Landung" durch Beschichtung Gewebekultur behandelt Gerichte mit Poly-L-Lysin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) über Nacht (O/N) bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte oder mindestens 1 h.
  3. DD2, Aspirieren der Poly-L-Lysin und Beschichten der Platten mit Laminin (10 µg/mL in PBS mit Ca2 +/Mg2 +) O/N bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchtigkeit.
    Hinweis: Während O/N optimal ist, weniger als 2 h kann ausreichend sein. Wenn Platten nicht am nächsten Tag verwendet werden, Aspirieren Laminin, ersetzen mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +und bei 4 ° C für bis zu 2 Wochen aufbewahren.
  4. DD3 ("land Zellen")
    1. Vor Beginn der EB Dissoziation, Aspirieren der Laminin und die Platten trocken in einer Gewebekultur-Haube. Verwenden Sie keine Platten, die glänzende oder sichtbar nass erscheinen. Übertragen Sie die EBs mit Medien in eine 15 mL-Tube und Zentrifuge für 3-4 min 15 x g oder bis der EBs haben oelletiert.
  5. Aspirieren Sie die Medien und 3 mL Zelle Ablösung Lösung mit DNase (2 U/mL) und Inkubation bei 37 ° C mit ≥ 95 % relativer Luftfeuchte und 5 % CO2 für 15 min. sanft flick das Rohr alle 3 min um EB Dissoziation zu erleichtern.
  6. Sobald der EBs sind nicht mehr sichtbar oder 15 Minuten vergangen sind, fügen Sie 6 mL KSR:N2 (1:1) mit DNase (1 U/mL) und Zentrifuge für 5 min bei 200 X g.
  7. Die Zellen in KSR:N2 (1:1) mit LDN-193189 Platte (250 nM), XAV-939 (10 µM), und der ROCK-Inhibitor Y-27632 (10 µM) bei 4,5-5 x 104 Zellen/cm2.

(4) SST-Anreicherung Protokoll: "DD12 GFP hohe Sonic Hedgehog (SHH)" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Ändern Sie auf DD5, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SSH (50 ng/mL).
  2. Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder am Tag 8 (Schritt 4.4) Beschichtung mit in Schritte 3.2-3.3 aufgeführten Anweisungen.
  3. Ändern Sie auf DD7, Medien mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und SHH (50 ng/mL).
  4. Auf DD8 Platte wieder die Zellen.
    Hinweis: Während dieser Schritt nicht notwendig ist, kann wieder galvanischen Zellen frühen differenziert, unerwünschte Zelltypen reduzieren. Re Beschichtung auch Kugeln aus Zellen, die die nachgelagerten immunhistochemische Analysen erschweren bricht, und erhöht die Effizienz der FACS zu späteren Zeitpunkten.
    1. Neu Platte Zellen, die Zellen von der Platte mit Trypsin-EDTA (0,05 % Trypsin) für 5 min bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2zu lösen. Die Trypsin-EDTA mit 2 Mal das Volumen mit KSR:N2 zu stillen und Zentrifuge bei 200 X g für 5 min. filtern die Zellen durch einen 40 µm Filter Schlauch, Klumpen zu entfernen. Platte wieder die Zellen bei 250.000 Zellen/cm2 N2/KSR (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL) und Y-27632 (10 µM) mit SHH (50 ng/mL).
      Hinweis: Wenn stattdessen die Entscheidung getroffen wird, nicht auf die Zellen auf DD8 Re Platte wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL) alle 2 Tage ab DD7, DD12 und IGF-1 hinzufügen (20 ng/mL) und FGF-2 (10 ng/mL) bis DD9.
  5. Auf DD10, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit SHH (50 ng/mL).
  6. Auf DD12, um Zellen zu erhalten, die für SST Untertypen angereichert sind, verwenden FACS, um Lhx6::GFP zu isolieren-Zellen nur zum Ausdruck zu bringen.
    1. Um die Zellen zu entfernen, verwenden Sie eine nicht-Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz als Trypsin-EDTA. Waschen Sie Zellen einmal mit PBS ohne Ca2 +/Mg2 +. Fügen Sie vorgewärmt nicht Trypsin enthaltenden Zelle-Dissoziation Reagenz mit DNase (2 U/mL) auf die Zellen. Legen Sie sie in den Inkubator bei 37 ° C mit ≥95 % Relative Luftfeuchtigkeit und 5 % CO2 für 10-30 Minuten oder bis die Zellen getrennt haben. Klopfen Sie leicht die Platten alle 5 min um die Dissoziation zu unterstützen.
      Hinweis: Für DD11-12 Kulturen kann nur 10-15 Minuten erforderlich sein. Für DD15-16 Kulturen kann 30 Minuten oder mehr für vollständige Dissoziation erforderlich.
    2. Sobald die Zellen komplett von der Platte gehoben haben, fahren Sie mit FACS Isolierung unter Verwendung von standard-Protokollen oder verwenden Sie die Zellen in anderen nachgeschalteten Analysen.

5. PV-Anreicherung Protokoll: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Gewebekultur Platten vorbereiten, wieder Beschichtung auf DD8 (Schritt 4.4) mit die Anweisungen gemäß 3.2-3.3 Schritte.
  3. Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  4. Auf DD8, neu Platte Zellen wie unter Schritt 4.4 mit folgenden Ausnahmen: Wenn die Zellen neu Plattieren, SHH mit gespachtelten Agonist zu ersetzen (SAG; 30 nM) und atypische PKC-Hemmer (aPKCi; 2 µM) hinzufügen. Zusammengenommen, die erneut Galvanik Medien jetzt N2/KSR (1:1) enthält FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µM), SAG (30 nM), und aPKCi (2 µM).
  5. Auf DD10 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM).
  6. DD11
    Hinweis: an dieser Stelle sind Nkx2.1::mCherry+ Zellen angereichert um PV CIns zu werden.
    1. Trennen Sie die Zellen aus der Platte für FACS verwenden das gleiche Protokoll in Schritt 4.6 beschrieben. Wenn die Entscheidung getroffen wird, um Nkx2.1::mCherry+ Zellen an einem späteren Tag Differenzierung zu sammeln, ignorieren Sie diesen Schritt.
  7. Auf DD12 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD14 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Auf DD16 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 mit aPKCi (2 µM). Sammeln Sie auf DD17 die Nkx2.1::mCherry+ Zellen unter Verwendung des gleichen Protokolls in Schritt 4.6 beschrieben.

(6) PV-Anreicherung Protokoll: "DD17 mCherry Low SHH" (Fortsetzung von Schritt 3,7)

  1. Auf DD5, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL). Am DD7, wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1) mit FGF-2 (10 ng/mL) und IGF-1 (20 ng/mL).
  2. Auf DD9 wechseln Sie das Medium mit KSR:N2 (1:1). Ab diesem Zeitpunkt sind keine zusätzliche Wachstumsfaktoren notwendig.
    1. Weiterhin die Medien alle 2 Tage bis zur Ernte der Zellen auf DD17 ändern.

Ergebnisse

Das Protokoll in diesem Dokument beschriebenen ist eine modifizierte Version von unseren veröffentlichten Protokolle15,16,17 und wurde für den Einsatz mit unseren Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP Dual-Reporter mESC optimiert. Durch das Hinzufügen der Wnt-Inhibitors XAV-939 DD0-5, kombiniert mit neu bei DD8 Beschichtung, erreichen wir robuste Nkx2.1 Induktion, wobei mehr als 50 % der alle DAPI + Kerne...

Diskussion

Während diese Methode ist sehr effektiv bei der Musterung J1 abgeleitet mESCs (SCRC-1010), erlebten wir Variablen Erfolg mit anderen mESC Linien und klonale Isolate. Zum Beispiel, Foxg1::venus mESCs (EB3 abgeleitet; Danjo Et al. 13) reagieren schlecht auf dieses Protokoll und Foxg1 Induktion durch DD12 ist in der Regel in der Größenordnung von 1 %-2 %. Aus Gründen, die wir nicht vollständig verstehen, produziert ein weiteres Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual Reporter Klon (genannt JQ59)...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Wir sind dankbar, Qing Xu für die Entwicklung der Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP dual Reporter mESC Linie und Jennifer Tyson, Asif Maroof, sowie Tim Petros für ihre frühen Arbeiten zu helfen, dieses Protokoll zu entwickeln. Wir danken auch den CHOP Flow Cytometry Kern für technische Hilfe. Diese Arbeit wurde von einem NIH R01 MH066912 (SA) und F30 MH105045-02 (DT) unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Bottle-top vacuum filter systemCorningCLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% Gelatin SolutionATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939Stemgent04-0046Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2R&D Systems233-FBResuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2R&D Systems291-G1Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632)Tocris1254Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG)Millipore566660-1MGResuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, MyristoylatedEMD Millipore539624Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

Referenzen

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