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要約

このプロトコルでは、変更された胚様体-単層法を用いたマウス胚性幹細胞から皮質介在ニューロン前駆細胞と後細胞分裂の介在ニューロン前駆体を生成するためのメソッドについて説明します。これらの前駆細胞/前駆体生体外で使用することができますまたは蛍光ソート運命決定を研究するため新生児大脳新皮質に移植や治療への応用で使用されます。

要約

Gaba 作動性皮質介在ニューロンは、興奮性錐体細胞の出力を調節するだけでなく、アンサンブル錐体細胞の出力を同期で重要な役割を果たす細胞の異種集団です。介在ニューロン機能の欠損は、さまざまな統合失調症、自閉症、てんかんなどの精神・神経疾患に関与しています。胚性幹細胞から皮質介在ニューロンの導出は、彼らの開発と機能の研究では、だけでなく、皮質介在関連疾患の発症分子メカニズムに洞察力を提供します。介在ニューロンはまた生き残るため、移行、および統合ホスト皮質回路移植後、細胞ベースの治療で使用するための理想的な候補者を作る顕著な能力を持っています。Nkx2.1 を表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫なマウス胚性幹細胞 (mESCs) からの派生にスケーラブルな非常に効率的な変更された胚様体-単層メソッドを紹介します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインを使用して、Nkx2.1 前駆細胞または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫蛍光活性化セル (FACS) を並べ替えを介して分離でき後でダウン ストリーム アプリケーションの数で使用します。我々 はまた運命決定の側面を研究するため、または使用するためサブグループ濃縮介在から寄与する治療への応用に役立つ可能性があります (SST) 介在のサブグループ、パルブアルブミン (PV) またはソマトスタチンの豊かにするメソッドを提供します。移植。

概要

マウスとヒトの両方でほぼすべて皮質抑制性介在ニューロン (CIns) の半分で内側の神経節隆起 (MGE) として知られている一時的な皮質下構造内で発信 CIns 他神経細胞とグリア細胞の上皮細胞内前駆細胞サブグループは、転写因子 Nkx2.11,2を表現します。CIn サブグループまたはサブタイプは、形態学的、神経化学的、電気生理学的の交差と接続特性3,4によって定義されます。MGE 派生 CIns に分けられます太陽光発電または SST、電気生理学的および接続の特定の傾向5どの相関式の表現に基づいて主に非重複のサブグループ。特に PV サブグループ、介在神経の機能不全は、複数神経疾患と疾患6,7に関与しています。このメソッドの全体的な目標は、幹細胞由来細胞分裂前駆細胞と太陽光発電または SST CIn の運命: 皮質介在ニューロンの生物学を勉強するため、細胞ベースの治療で使用するための濃縮渡り鳥の前駆体を生成することです。

Nkx2.1 表現する介在ニューロン前駆細胞とその子孫な mESCs からの派生のためのスケーラブルな非常に効率的な手法を提案します。Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP を使用してデュアル レポーター mESC 行8、Nkx2.1 前駆細胞、または彼らの Lhx6 を表現するポスト mitotic 子孫を FACS による分離し後で多くのダウン ストリーム アプリケーションで使用できます。シグナル伝達経路の数、文化の期間、神経新生のモードを操作することによって数百万の蛍光に分類された介在ニューロン前駆体下流のアプリケーション ホストに適してを取得できます。

MESCs9,10、11,12,13,14, Wnt に依存している私たちのメソッドから MGE のような前駆細胞を生成するためにいくつかの他の方法が存在するが価格 939、拮抗薬は、Foxg1/Nkx2.1 胎生前駆細胞の共発現を生成するに特に効果的です。さらに、介在ニューロン前駆細胞や、デュアル レポーター システムを介して彼らポスト mitotic Lhx6 表現の子孫を選択する能力は大きく異なる前駆細胞および彼らの子孫を生成する能力を高めます。

プロトコル

注: このプロトコルで記述されているデュアル レポーター mESC ラインはリクエスト制 (sande@mail.med.upenn.edu です)。

1. メディアの準備

注: は、細胞培養で使用する前に 37 ° C にすべてのメディアを温めます。

  1. (500 mL の準備) のマウス萌芽期の繊維芽細胞 (MEF) メディア
    1. ダルベッコ変更イーグル培地 (DMEM) と 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターの 449 mL に 50 mL のウシ胎児血清 (FBS) を追加します。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の 4 ° C でメディアを格納-20 ° C
  2. (500 mL の準備) のための N2 メディア
    1. 5 mL L アラニン L-グルタミンを追加 (100 x) と 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 489.5 mL DMEM: 栄養混合物 F-12 (DMEM/F-12)、および 500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルター。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL)、5 mL N2 サプリメント B を追加します。最大 1 ヶ月間、暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管します。
  3. (500 mL の準備) の成長の無血清培地 (KSR)
    1. 75 mL 無血清培地のサプリメントは、5 mL の L グルタミンを追加 (100 x) 5 mL MEM 非必須アミノ酸 (MEM NEAA) (100 倍) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月の 4 ° C でメディアを格納します。
  4. (500 mL の準備) のマウス胚性幹細胞のメディア
    1. 75 mL 幹細胞グレード FBS、5 mL MEM NEAA を追加 (100 x) 5 mL L グルタミン (100 x) 500 μ L 2-メルカプトエタノール (55 mM) 413.5 mL 非グルタミンを含む DMEM、500 mL 0.22 μ m 孔フィルター ユニットを介してフィルターと。
    2. ろ過後 1 mL 抗菌剤 (50 mg/mL) を追加します。1 ヶ月または因数 ≤ で店の暗闇の中で 4 ° C でメディアを保管-20 ° C

2. 培養 mESCs

  1. 3-4 × 10 の4セル/cm2で扱われる組織培養プレートに MEF メディアで有糸分裂アクティブ MEF フィーダー細胞をプレートします。少なくとも 12 h ≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で細胞文化のインキュベーターで、mESCs をめっきする前に解決するを許可します。すぐに使用しない、3 日おきに MEF のメディアを交換してください。処分 MEFs めっき後 7 日以内に使用されていない場合。
  2. マウス白血病の抑制的な要因 (mLIF) (1,000 U/mL) mESC 培地で MEF プレートに mESCs (× 104セル/cm21 4 から密度範囲) を追加します。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  3. トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) を使用して mESCs の通路 (1:5-1:10) 皿になったら ~ 70-80% の合流や植民地が接触し始めているかどうか。これは通常、2 日ごとに発生しますが、初期めっき密度に応じて 4 または 5 日にかかることが。
  4. MESC 中多能性を維持する MEF の送り装置の層の mESCs を維持します。
  5. 分化を開始する前に少なくとも一度 MEFs、MEFs を希釈することがなくゼラチン コーティング プレートの上に細胞を通路します。
    1. ゼラチンをリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) Ca2 +/Mg2 +扱われる細胞培養用ディッシュに 0.1% ゼラチン コーティング プレートを準備し、37 ° c 少なくとも 1 h. プレート 1.5-2 x 10 の6セル/10 cm プレートを残して (10 x 2.7 3.64セル/cm2) の細胞は分化を開始する前に 2 日間の拡大して。

3. MGE のような胎生前駆細胞に対する mESCs の差別化

  1. 分化の日 (DD) 0 =「浮遊細胞」
    1. MESCs で育った後 2 日間ゼラチン コーティング プレートはメディアを吸引し、Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄を行う。十分なトリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) (通常 4 mL トリプシン-EDTA 1 つ 10 cm 培養皿のため)、プレートの表面をカバーし、4 分の ≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° c の定温器に戻るセルに配置を追加します。
    2. 4 分後 mESC メディアで 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を癒します。適切なサイズの遠心管にセルを転送し、200 x g で 5 分で細胞を遠心分離します。5 分後チューブを削除し、ペレットを乱すことがなくメディアを吸引します。LDN 193189 BMP 阻害剤を含む KSR:N2 メディア (1:1) 1 mL にペレットを再懸濁します (250 nM) および wnt シグナル阻害剤価格 939 (10 μ M)。
    3. 検定または自動化された細胞カウンターを用いた細胞濃度を測定します。LDN 193189 を含む KSR:N2 メディア (1:1) で 75,000 セル/mL を追加することによって胚様体 (EBs) として細胞を成長を開始 (250 nM) および価格 939 (10 μ M) 非付着ティッシュの培養皿で。≥ 95% 相対湿度と 5% CO2と 37 ° C でセルを孵化させなさい。
  2. DD1、≥ 95% 相対湿度、37 ° C で (O/N)「着陸」ポリ-L-リジン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) のコーティング処理ティッシュの培養皿で一晩セルのまたは少なくとも 1 時間のために準備します。
  3. Dd2 は、ポリ-L-リジンを吸引し、ラミニン (10 μ g/mL PBS で Ca2 +/Mg2 +) でプレートをコート O/N ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で。
    注: O/N は最適な少し中 2 h が十分かもしれません。次の日に板を使用しない場合ラミニンを吸引せず Ca2 +/Mg2 +PBS の変更、4 ° C で 2 週間まで保存します。
  4. DD3 (「セルの土地」)
    1. EB 解離を開始する前に、ラミニンを吸引し、プレートをティッシュ文化フードで完全に乾燥します。光沢のあるまたはぬれた目に見えて表示される板は使用しないでください。15 mL チューブに 15 g x または EBs がペレットまでで 3 〜 4 分間遠心するメディアと EBs を転送します。
  5. メディアを吸引し、DNase を含む細胞剥離溶液 3 mL を加える (2 U/mL) と, ≥ 95% 相対湿度、37 ° C で 15 分 5% CO2優しくはじく 3 毎分 EB 解離を支援します。
  6. EBs が表示されなくまたは 15 分が経過した, DNase を含む 6 mL KSR:N2 (1:1) に追加 (1 U/mL) と 200 x g で 5 分間遠心します。
  7. LDN 193189 を含む KSR:N2 (1:1) で細胞をプレート (250 nM)、価格 939 (10 μ M)、ROCK 阻害剤の Y-27632 (10 μ M) で 4.5-5 104セル/cm2倍。

4. SST 豊かプロトコル:「DD12 GFP 高ソニック ・ ザ ・ ヘッジホッグ (SHH)」(3.7 手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、および SSH (50 ng/mL)。
  2. 日 8 (ステップ 4.4) に再めっき組織培養プレートを準備手順 3.2 3.3 で説明されている手順を使用して。
  3. DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と SHH (50 ng/mL)。
  4. DD8、上プレート細胞の再。
    注: この手順は必須ではありません、再めっきセル初期分化、不要な細胞の種類減らすことができます。再メッキして、下流の免疫組織化学的解析を難しく細胞のボールを分割後時点で FACS の効率を高めます。
    1. 再細胞をプレート、≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 5 分間トリプシン-EDTA (0.05% トリプシン) でプレートから細胞を分離します。KSR:N2 と 2 倍のボリュームを使用してトリプシン-EDTA を消すし、200 x g で 5 分間遠心フィルターいずれかの塊を削除する 40 μ m のフィルター チューブを介して細胞。FGF 2 を含む 250,000 セル/cm2で N2/KSR (1:1) セルを再プレート (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL) と Y-27632 (10 μ M) SHH と (50 ng/mL)。
      注: 代わりに、再 DD8 に細胞をプレートに決定、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL) DD7 から DD12 2 日おき IGF-1 に追加して、(20 ng/mL) と FGF 2 (10 ng/mL) DD9 まで。
  5. DD10、SHH を含む KSR:N2 とメディアを変更 (50 ng/mL)。
  6. DD12、SST のサブタイプの濃縮細胞を得るためには、使用 FACS して切り離します Lhx6::GFP-のみ発現細胞。
    1. セルをデタッチするには、トリプシン-EDTA よりもむしろ非トリプシン含有細胞解離試薬を使用します。細胞 Ca2 +/Mg2 +なし PBS で 1 回洗浄します。DNase を含む予め温めておいた非トリプシン含有細胞解離試薬を追加 (2 U/mL) のセルにします。≥95% の相対湿度と 5% CO2と 37 ° C で 10-30 分またはセルをデタッチするまでのインキュベーターに入れます。解離を支援するために 5 分ごとの板が軽きます。
      注: DD11 12 文化の 10-15 分のみ必要があります。用 dd15 用 16 文化のため 30 分以上必要があります完全な解離のため。
    2. セルが完全にプレートを持ち上げ、一度 FACS 分離標準プロトコルを使用してに進むか、その他の下流解析のセルを使用します。

5. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD11/DD17 mCherry + aPKCi」(3.7 の手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  2. DD8 再めっきの組織培養プレートを準備 3.2 3.3 の手順 (手順 4.4) に記載されている手順を使用して。
  3. DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  4. DD8 に再セルを次の例外を除き、手順 4.4 で説明したプレート: セルは再メッキしているとき、に置き換える SHH 滑らかアゴニスト (サグ; 30 nM) と非定型の PKC 阻害剤 (aPKCi; 2 μ M) を追加。まとめると、再メッキのメディアは今 N2/KSR (1:1) を含む FGF 2 (10 ng/mL)、IGF-1 (20 ng/mL)、Y-27632 (10 μ M)、サグ (30 nM)、および aPKCi (2 μ M)。
  5. DD10、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。
  6. DD11
    注: この時点で、Nkx2.1::mCherry+ 細胞は、太陽光発電 CIns になる濃縮されています。
    1. ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して FACS のためプレートから細胞をデタッチします。決定は後日分化 Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集する場合は、この手順を無視してください。
  7. DD12、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD14、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。国鉄 DD16、aPKCi (2 μ M) を含む KSR:N2 のメディアを変更します。DD17、ステップ 4.6 に記載されている同じプロトコルを使用して Nkx2.1::mCherry+ 細胞を収集します。

6. 太陽光発電豊かプロトコル:「DD17 mCherry 低分子機構」(3.7 手順からの続き)

  1. DD5、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。DD7、FGF 2 を含んでいる KSR:N2 (1:1) とメディアを変更 (10 ng/mL) と IGF-1 (20 ng/mL)。
  2. DD9、KSR:N2 (1:1) では、メディアを変更します。これ以降に成長因子を追加する必要はありません。
    1. DD17 のセルを収穫まで 2 日おきに、メディアを変更していきます。

結果

このペーパーで説明したプロトコルの公開プロトコル15,16,17の修正版で、私たち Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP デュアル レポーター mESC ラインでの使用に最適化されています。DD0 ~ 5 DD8、再メッキと組み合わせる価格 939 wnt シグナル阻害剤を追加することにより前記の文化のすべての DAPI + 核の 50% 以上も Nkx2....

ディスカッション

この方法は J1 から派生した mESCs (SCRC-1010) をパターンで非常に効果的な他 mESC 回線とクローン分離変数の成功を経験した.たとえば、Foxg1::venus mESCs (EB3 派生;男女ら13) 応答このプロトコルと DD12 Foxg1 誘導が不十分な通常 1-2% 程度です。理由は我々 は完全に理解していないが、(JQ27 と呼ばれる) この議定書に記載されている行と同時に分離された (JQ59 と呼ばれる) もう一?...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

このプロトコルを開発することの彼らの初期の作品の Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP デュアル レポーター mESC ライン ジェニファー タイソン、アシフ Maroof、ティム ・ ペトロスを開発するため清徐に感謝しております。また、テクニカル サポートにチョップ流れ cytometry コアを感謝いたします。この作品は、NIH R01 MH066912 (SA) と F30 MH105045 02 (DT) によって支えられました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Bottle-top vacuum filter systemCorningCLS430769
Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
Mouse embryonic fibroblasts (CF-1 MEF IRR 7M)MTI-GlobalstemGSC-6101G1 vial of 7M MEFs is sufficient for four 10-cm TC plates. References: 29,35
FBSAtlanta BiologicalsS11150H
PrimocinInvivogenAnt-pm-2Also known as antimicrobial agent. Do not filter with base media -- add after filtration. References: 9,11,36,37
N2 supplement-BStemcell Technologies7156Do not filter with base media -- add after filtration
Glutamax (100x)ThermoFisher35050061Also known as L-alanine-L-glutamine. References: 9,11,38,39
KnockOut Serum Replacement (KSR)ThermoFisher10828028Also known as serum-free medium supplement. References: 9,11
L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
0.1% Gelatin SolutionATCCATCC PCS-999-027
LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
LDN-193189Stemgent04-0074Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
XAV939Stemgent04-0046Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2R&D Systems233-FBResuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2R&D Systems291-G1Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632)Tocris1254Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG)Millipore566660-1MGResuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
PKCζ Pseudosubstrate Inhibitor, MyristoylatedEMD Millipore539624Resuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots

参考文献

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