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요약

이 프로토콜 수정된 embryoid 몸 단층 메서드를 사용 하 여 마우스 배아 줄기 세포에서 대뇌 피 질의 interneuron 창시자와 포스트 mitotic interneuron 선구자를 생성 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 창시자/선구자 사용 생체 외에서 또는 붙일 정렬 및 운명 결정, 공부에 대 한 신생아 피 질에 이식 하거나 수 치료 응용 프로그램에 사용.

초록

GABAergic 대뇌 피 질의 수는 흥분 성의 피라미드 뉴런의 출력 조절 피라미드 뉴런 앙상블의 출력을 동기화에 중요 한 역할을 하는 셀의 이종 인구. 정신병 무질서, 정신 분열 증, 자폐증, 간 질 등의 다양 한에서 적자 interneuron 함수에 연루 되었습니다. 배아 줄기 세포 로부터 대뇌 피 질의 수의 뿐만 아니라 그들의 개발 및 기능 연구에 대 한 허용 하지만 대뇌 피 질의 interneuron 관련 장애의 병 인을 기본 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 수는 또한, 마이그레이션, 생존과 호스트 대뇌 피 질의 회로 후 이식, 그들 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 이상적인 후보자를 만들기에 통합 놀라운 능력을가지고. 여기, 우리 Nkx2.1 표현 interneuron 창시자와 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs)에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장성, 높은 효율, 수정 embryoid 몸 단층 방법 제시. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 mESC 라인을 사용 하 여, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손 수 형광 활성화 셀 정렬 (FACS)를 통해 격리 되며 이후 다운스트림 응용 프로그램의 숫자에 사용. 우리는 또한 방법을 풍부 하 게 parvalbumin (태양광 발전) 또는 somatostatin (SST) interneuron 하위 그룹을 도움이 될 수 있습니다 운명 결정의 측면을 공부 하거나 사용 하기 위해 하위 그룹 농축 interneuron에서 도움이 될 것 이라고 하는 치료 응용 프로그램에 제공 이식입니다.

서문

두 생쥐와 인간에 대략 절반 모든 대뇌 피 질의 억제 수 (CIns)의 발생 과도 subcortical 구조 중간 절 예 하 (MGE) 어디 라고 내 CIns 및 다른 신경 그리고 glial의 neuroepithelial 창시자 하위 그룹 표현 녹음 방송 요인 Nkx2.11,2. CIn 하위 그룹 또는 하위 형태학, neurochemical electrophysiological, 교차 및 연결 특성3,4로 정의 됩니다. MGE 파생 된 CIns로 그룹화 할 수 있습니다 대부분 비중첩 하위 PV 또는 SST, 특정 electrophysiological 및 연결 추세5와 어떤 관계가 식의 그들의 식에 따라. 부전 수, PV 비율에서 특히 그들의 여러 정신병 무질서 및 질병6,7에 연루 되었습니다. 이 방법의 전반적인 목표는 줄기 세포 유래 mitotic 창시자 및 대뇌 피 질의 interneuron 생물학 연구 및 세포 기반 요법에 사용 하기 위해 태양광 또는 SST CIn 운명에 대 한 농축 철새 선구자입니다.

Interneuron 창시자 표현 하는 Nkx2.1 및 mESCs에서 그들의 자손의 파생에 대 한 확장 가능한, 매우 능률적인 방법을 개발 했습니다. Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP을 사용 하 여 듀얼 기자 mESC 선8, Nkx2.1 창시자 또는 그들의 Lhx6 표현 포스트 mitotic 자손은 FACS를 통해 격리 되 고 이후 다운스트림 응용 프로그램의 수에 사용 될 수 있습니다. 다양 한 신호 경로, 문화, 그리고 성체의 모드를 조작 하 여 우리 붙일 레이블된 interneuron 선구자 다운스트림 응용 프로그램의 호스트에 대 한 적합의 수백만 얻을 수 있습니다.

MESCs9,10,11,12,13,14, 의존 하는 Wnt 우리의 방법에서에서 MGE 같은 창시자를 생성 하기 위한 여러 가지 다른 방법 존재 길 항 근 XAV-939, Foxg1/Nkx2.1 공동 telencephalic 창시자 표현 생성에 특히 효율적입니다. 또한, interneuron 창시자 또는 우리의 듀얼 기자 시스템을 통해 그들의 포스트 mitotic Lhx6 표현 자손에 대 한 선택 수는 크게 고유 창시자 그리고 그들의 자손을 생성 하는 능력을 향상 시킵니다.

프로토콜

참고:이 프로토콜에서 설명 하는 듀얼 기자 mESC 라인은 요청 (sande@mail.med.upenn.edu).

1. 미디어 준비

참고: 모든 미디어 세포 배양에 사용 하기 전에 37 ° C를 따뜻하게.

  1. 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 미디어 (500 mL를 준비)
    1. Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM), 및 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터 449 ml 50 mL 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)를 추가 합니다.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.
  2. N2 미디어 (500 mL를 준비)
    1. 5 mL L-알라닌-L-글루타민 추가 (100 x) 및 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 489.5 ml DMEM: 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F-12), 그리고 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)와 5 mL n 2 보충-B를 추가 합니다. 최대 1 달 동안 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
  3. 혈 청 무료 성장 매체 (KSR) (500 mL를 준비)
    1. 추가 75 mL 혈 청 무료 중간 보충, 5 mL L-글루타민 (100 배), 5 mL MEM 비 필수 아미노산 (MEM-NEAA) (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 개월 4 ° C에서 미디어를 저장 합니다.
  4. 마우스 배아 줄기 세포 미디어 (500 mL를 준비)
    1. 75 mL 줄기 세포 학년 FBS, 5 mL MEM NEAA 추가 (100 배) 5 mL L-글루타민 (100 x), 그리고 500 µ L 2-Mercaptoethanol (55mm) 413.5 mL 비-글루타민을 포함 된 DMEM, 500 mL 0.22 μ m 기 공 필터 장치를 통해 필터링.
    2. 여과 후 1 mL 항균 에이전트 (50 mg/mL)를 추가 합니다. 최대 1 달 또는 약 수 ≤에 저장소에 대 한 어둠 속에서 4 ° C에서 미디어를 저장-20 ° c.

2. 경작 mESCs

  1. 플레이트 mitotically 비활성 MEF 피더 세포 조직 문화에 MEF 미디어에 3-4 x 104 셀/cm2접시를 취급. 적어도 12 h는 mESCs를 도금 하기 전에 ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 셀 문화 인큐베이터에 정착 하도록 허용 합니다. 즉시 사용 하지, MEF 미디어 3 일 마다 교체 합니다. 도금의 7 일 이내 사용 하지 않을 경우 MEFs의 처분.
  2. 마우스 백혈병 금지 요인 (mLIF) (1000 U/mL)를 포함 하는 mESC 미디어에서 MEF 번호판 mESCs (밀도 범위 1-4 x 104 셀/cm2)를 추가 합니다. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
  3. 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)를 사용 하 여 mESCs 통로 (1:5-1:10)는 요리 되 ~ 70-80% 합칠 또는 식민지 터치 하기 시작 하는 경우. 이 일반적으로 2 일 마다 발생 하지만 초기 도금 밀도 따라 4 ~ 5 일이 걸릴 수 있습니다.
  4. Pluripotency를 유지 mESC 매체에서 MEF 급지대 레이어에 mESCs을 유지 관리 합니다.
  5. 차별화를 시작 하기 전에 적어도 한 번 MEFs MEFs 밖으로 희석 없이 젤라틴 코팅 접시에 셀 통로.
    1. 캘리포니아2 +/Mg2 + 취급 하는 조직 문화 접시에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 젤라틴 0.1% 추가 하 여 젤라틴 코팅 접시를 준비 하 고 적어도 1 헤 x 106 세포/10 c m 플레이트 플레이트 1.5-2에 대 한 37 ° C에서 떠나 (2.7-3.6 10 x4 셀/cm2) 차별화를 시작 하기 전에 2 일에 대 한 확장을 세포 허용.

3. 차별화 MGE 같은 Telencephalic 창시자 향해 mESCs

  1. 차별화 일 (DD) 0 = "셀 플 로트"
    1. mESCs 성장 후 젤라틴 코팅 판 2 일에 대 한 미디어를 발음 하 고 한번 없이 캘리포니아2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 충분 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin) 4 분 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 배양 기에 다시 셀을 (일반적으로 4 mL 트립 신-EDTA 한 10cm 조직 문화 접시), 판의 표면을 커버를 추가 합니다.
    2. 4 분 후 트립 신-EDTA mESC 미디어 2 배 볼륨을 사용 하 여 끄다. 적절 한 크기의 원심 분리기 튜브에 세포를 전송 하 고 5 분 동안 200 x g에서 세포를 원심. 5 분 후 튜브를 제거 하 고 미디어는 펠 렛을 방해 하지 않고 발음. 1 ml KSR:N2 미디어 (1:1) 펠 릿 포함 된 BMP 억제제 LDN-193189 resuspend (250 nM) 및 Wnt 억제제 XAV-939 (10 µ M).
    3. Hemocytometer 또는 자동화 된 셀 카운터를 사용 하 여 셀 농도 측정 합니다. LDN-193189를 포함 하는 KSR:N2 미디어 (1:1)에 75, 000 셀/mL을 추가 하 여 셀 embryoid 몸 (EBs)으로 성장 하는 시작 (250 nM) 및 XAV-939 (10 µ M) 비 점착 조직 문화 요리에서. ≥ 95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 세포를 품 어.
  2. DD1에 셀에 대 한 "방문" 폴 리-L-리 신 (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +) 코팅 처리 하는 조직 문화 요리에 의해 하룻밤 (O/N) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에 또는 적어도 1 시간에 대 한 준비.
  3. DD2, 폴 리-L-리 신을 발음 하 고 laminin (10 µ g/mL PBS에 캘리포니아2 +/Mg2 +)와 플레이트 코트 O/N ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서.
    참고: O/N은 최적의 조금은 2 h 수 있습니다 충분. 다음 날 접시 사용 되지 않는, laminin를 발음 하 고 없이 Ca2 +/Mg2 +, PBS 바꿉니다 4 ° C에서 최대 2 주 동안 저장.
  4. DD3 ("토지는 세포")
    1. EB 분리를 시작 하기 전에 laminin 발음 하 고 하 판 조직 문화 후드에 완전히 건조. 나타나는 반짝 또는 가시 젖은 접시를 사용 하지 마십시오. 15 mL 튜브 15 g x 또는 EBs는 수송과 때까지 3-4 분 동안 원심 분리기로 미디어와 EBs를 전송 합니다.
  5. 미디어를 발음 하 고 DNase를 포함 하는 세포 분리 솔루션의 3 개 mL를 추가 (2 U/mL) ≥ 95% 상대 습도와 37 ° C에서 품 어와 15 분의 5% CO2 는 부드럽게 EB 분리에 도움 관 모든 3 분 영화.
  6. EBs는 더 이상 표시 하거나 15 분 경과, 추가 6 mL KSR:N2 (1:1) 포함 하는 DNase (1 U/mL) 및 200 x g에 5 분 동안 원심 분리기.
  7. KSR:N2 (1:1) LDN-193189를 포함 하는 셀을 접시 (250 nM), XAV-939 (10 µ M), 그리고 바위 억제제 Y-27632 (10 µ M) 4.5-5 x 104 셀/c m2에.

4. SST 풍요롭게 프로토콜: "DD12 GFP 높은 소닉 고슴도치 (쉬)" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), ssh (50 ng/mL).
  2. 다시 하루 8 (단계 4.4)에 도금을 위한 조직 배양 배지 준비 단계 3.2 3.3에에서 설명 된 지침을 사용 하 여.
  3. DD7, 변경 FGF-2를 포함 하는 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 그리고 쉬이 잇 (50 ng/mL).
  4. DD8에 다시 셀 접시.
    참고:이 단계는 필수, 다시 도금 셀 줄일 수 있습니다, 원치 않는 초기 분화 세포 유형. 다시 도금 다운스트림 immunohistochemical 분석을 어렵게 하는 셀의 공을 휴식 그리고 나중 시간 포인트에서 FACS의 효율을 증가.
    1. 다시 셀을 접시, ≥95% 상대 습도 및 5% CO2와 37 ° C에서 5 분에 대 한 트립 신-EDTA (0.05 %trypsin)와 플레이트에서 세포를 분리. 트립 신-EDTA와 KSR:N2, 2 배 볼륨을 사용 하 여 담금질 및 5 분에 대 한 200 x g에서 원심 분리기 필터 어떤 덩어리를 제거 하려면 40 µ m 필터 튜브를 통해 셀. FGF-2 포함 된 N2/로켓 (1:1)에서 250, 000 셀/c m2 에서 셀을 다시 접시 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), 및 Y-27632 (10 µ M) 쉬와 (50 ng/mL).
      참고: 다시 DD8 셀 접시 않기로 결정 했다 대신, 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL) DD7에서 DD12 2 일 마다 계속 IGF-1을 추가 하 고 (20 ng/mL)와 FGF-2 (10 ng/mL) DD9까지.
  5. DD10에 쉬를 포함 하는 KSR:N2와 미디어 변경 (50 ng/mL).
  6. 에 DD12, SST 하위 유형에 대 한 풍성 하 게 하는 셀을 얻기 위해을 사용 하 여 FACS Lhx6::GFP-만 셀을 표현.
    1. 세포를 분리, 트립 신-EDTA 보다는 비 트립 신 포함 휴대-분리 시 약을 사용 합니다. 한 번 없이 Ca2 +/Mg2 +PBS 가진 세포를 씻어. 미리 데워 진된 비 트립 신 포함 하 셀 분리 시 약 DNase를 포함 추가 (2 U/mL)는 세포에. 10-30 분 또는 세포가 분리 될 때까지 ≥95% 상대 습도 및 5% CO2 와 37 ° C에서 인큐베이터에 배치 합니다. 부드럽게 분리를 돕기 위해 접시 마다 5 분을 누릅니다.
      참고: DD11-12 문화에 대 한 10-15 분만 필요할 수 있습니다. DD15-16 문화에 대 일 분 이상 완전 한 분리에 대 한 필요할 수 있습니다.
    2. 일단 세포는 접시에서 완전히 해제 됩니다, FACS 절연 표준 프로토콜을 사용 하 여 진행 하거나 다른 다운스트림 분석 셀을 사용 합니다.

5. PV 풍요롭게 프로토콜: "DD11/DD17 mCherry + aPKCi" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD8에 다시 도금 조직 문화 접시 준비 3.2 3.3 단계 (단계 4.4)에 설명 된 지침을 사용 하 여.
  3. DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  4. DD8에 다시 접시 셀 다음 예외 4.4 단계에서 설명한 대로: 다시 셀 도금, 쉬 흐려져 주 작동 근으로 대체 (SAG; 30 nM) 비정형 PKC 억제제 (aPKCi; 2 µ M)를 추가 하 고. 합쳐, 다시 도금 미디어는 지금 N2/로켓 (1:1) 포함 된 FGF-2 (10 ng/mL), IGF-1 (20 ng/mL), Y-27632 (10 µ M), 처 짐 (30 nM), 및 aPKCi (2 µ M).
  5. DD10에 KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경.
  6. DD11
    참고:이 시점에서, Nkx2.1::mCherry+ 세포는 풍부 하 게 될 태양광 발전 CIns.
    1. FACS 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 접시에서 세포를 분리 합니다. 나중 차별화 하루에 Nkx2.1::mCherry+ 세포를 수집 결정 경우이 단계를 무시 하십시오.
  7. 에 DD12, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD14, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. 에 DD16, KSR:N2 aPKCi (2 µ M)를 포함 하는 미디어 변경. DD17에서 Nkx2.1::mCherry+ 셀 단계 4.6에서에서 설명 하는 동일한 프로토콜을 사용 하 여 수집 합니다.

6. 태양광 발전 풍부 프로토콜: "DD17 mCherry 낮은 쉬" (단계 3.7에서에서 계속)

  1. DD5, KSR:N2 (1:1) FGF-2를 포함 하는 미디어 변경 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL). DD7, 변경 포함 된 FGF-2 KSR:N2 (1:1)와 미디어 (10 ng/mL) 및 IGF-1 (20 ng/mL).
  2. DD9, KSR:N2 (1:1)와 함께 미디어 변경 합니다. 이 시점에서 앞으로, 아니 추가 성장 요인이 필요 하다.
    1. 계속 미디어 DD17에 셀 수확까지 2 일 마다 변경.

결과

이 문서에 설명 된 프로토콜 우리의 게시 프로토콜15,,1617 의 수정된 된 버전 이며, 우리의 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼-기자 mESC 선으로 사용 하기 위해 최적화 되었습니다. DD0-5, 다시 도금 DD8에서 결합 XAV 939 Wnt 억제제를 추가 하 여 우리는 어떤 점에서 모든 DAPI + 핵 문화에서의 50% 이상을 또한 Nkx2.1 표현 (

토론

이 메서드는 J1 파생 된 mESCs (SCRC-1010) 패턴에 매우 효과적인, 우리 다른 mESC 라인과 클론 분리 변수 성공을 경험 했다. 예를 들어, Foxg1::venus mESCs (EB3 파생; Danjo 외. 이 프로토콜을 Foxg1 DD12에 의해 유도 제대로 13) 응답은 일반적으로 1-2%의 순서. 이유로 우리가 완전히 이해 하지 않는 또 다른 Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP 듀얼 기자 클론 (나 JQ59) (JQ27 불리)이이 프로토콜에서 설명 하는 라...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

우리는이 프로토콜을 개발 하는 데 도움에 그들의 초기 작업에 대 한 Nkx2.1::mCherry:Lhx6:GFP 듀얼 기자 mESC 라인으로 제니퍼 타이슨, Asif Maroof 및 팀 페트 로스를 개발 하기 위한 청나라 Xu에 감사. 우리는 또한 빨리 흐름 cytometry 핵심을 기술 지원에 대 한 감사합니다. 이 작품은 NIH R01 MH066912 (SA)와 F30 MH105045-02 (DT)에 의해 지원 되었다.

자료

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Test Tube with Cell Strainer Snap CapThermoFisherCorning 352235
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L-glutamine (100x)ThermoFisher25030081
MEM-NEAA (100x)ThermoFisher11140050
2-MercaptoethanolThermoFisher21985023
KnockOut DMEMThermoFisher10829018Also known as non-glutamine containing DMEM. References: 9,11
Hyclone FBSVWR82013-578Also known as stem cell grade FBS. References: 9,11
Tissue culture treated dish (10cm)BD Falcon353003
Non-adherent sterile petri dish (10cm)VWR25384-342
Leukemia inhibitory factor (mLIF)ChemiconESG1107Do not freeze, store at 4'C. References: 9,11
DMEM/F12ThermoFisher11330032
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LamininSigmaL2020
Poly-L-lysineSigmaP6282
Trypsin-EDTA (0.05%)ThermoFisher25300054
AccutaseThermoFisherA1110501Also known as non-trypsin containing cell dissociation reagent. References: 9,11
RQ1 RNase-Free DNasePromegaM610A
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XAV939Stemgent04-0046Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
rhFGF-2R&D Systems233-FBResuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
rhIGF-2R&D Systems291-G1Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
ROCK inhibitor (Y-27632)Tocris1254Resuspend in DMSO and store at -80'C in single use aliquots
Smoothened agonist (SAG)Millipore566660-1MGResuspend in H20 and store at -80'C in single use aliquots
rm Sonic Hedgehog/SHHR&D Systems464-SH-025Resuspend in PBS with 0.1% BSA and store at -80'C in single use aliquots
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