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  • Introducción
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  • Discusión
  • Divulgaciones
  • Agradecimientos
  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

Presentamos una cómoda extracción en fase sólida acoplada a cromatografía líquida de alta presión (HPLC) con detección electroquímica (ECD) para la determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina y dos de sus metabolitos en la orina de los bebés. También identificamos el metabolito MHPG como un potencial biomarcador para el diagnóstico precoz de daño cerebral para los niños.

Resumen

La extracción y análisis de los neurotransmisores catecolaminas en fluidos biológicos es de gran importancia en la evaluación de la función del sistema nervioso y las enfermedades, pero su medida exacta es todavía un reto. Muchos protocolos se han descrito para la medición de neurotransmisores por una variedad de instrumentos, incluyendo la cromatografía líquida de alta presión (HPLC). Sin embargo, existen deficiencias, tales como operación complicada o difícil de detectar múltiples objetivos, que no se puede evitar, y en la actualidad, la técnica de análisis dominante sigue siendo HPLC juntada con sensible electroquímica o fluorimétrica detección, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Aquí, se describe un protocolo detallado para el pretratamiento y la detección de catecolaminas con cromatografía líquida de alta presión con detección electroquímica (HPLC-ECD) en muestras de orina real de neonatos, mediante electrospun nanofibras compuesto compuesto de éter de corona poliméricos con el poliestireno como adsorbente, también conocido como el método de extracción (PFSPE) de la fase sólida de fibra lleno. Mostramos cómo orina muestras pueden ser precleaned fácilmente por una columna de fase sólida llena de nanofibras, y cómo los analitos en la muestra pueden enriquecerse rápidamente, desorbida y detectado en un sistema ECD. PFSPE simplifica notablemente los procedimientos de pretratamiento para las muestras biológicas, lo que permite disminución de tiempo, costo y reducción de la pérdida de objetivos.

En general, este trabajo ilustra un protocolo simple y conveniente para la extracción en fase sólida acoplada a un sistema de HPLC-ECD para determinación simultánea de los tres neurotransmisores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) y dos de sus metabolitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) y ácido 3, 4-dihydroxy-fenilacético (DOPAC)) en la orina de los bebés. Se aplicó el protocolo establecido para evaluar las diferencias de catecolaminas urinarias y sus metabolitos entre neonatos de alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos. Análisis comparativo reveló una diferencia significativa de MHPG urinario entre los dos grupos, indicando que los metabolitos de catecolaminas pueden ser un marcador importante candidato para el diagnóstico precoz de casos en riesgo de daño cerebral en recién nacidos.

Introducción

Neurotransmisores de catecolamina y su contenido de metabolitos en los fluidos corporales puede afectan la función neuronal y afectar el equilibrio de los Estados de la respuesta a estímulo a una gran parte1. Anomalías que puede causar una variedad de enfermedades, tales como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma y trastornos neurológicos1,2. La extracción y la determinación de catecolaminas en fluidos corporales es significativo para el diagnóstico de las enfermedades relevantes. Sin embargo, las catecolaminas en muestras biológicas existen en bajas concentraciones y se oxidan fácilmente. Además, son muy difíciles a fin de eluir debido a la gran cantidad de interferencias en el medio3. Por lo tanto, la detección simultánea de catecolaminas en fluidos biológicos es todavía un reto.

Ha habido comentarios demostrando que Catecolaminas urinarias pueden ser una medida de la tensión, y que sus niveles son importantes marcadores biológicos en respuesta a la estimulación táctil en los recién nacidos5. Según la investigación, todos los niños que han sufrido incidentes prematuros están en riesgo de cerebro lesión4,5,6, y lesión puede causar la liberación anormal de catecolaminas y asuntos relacionados a los fluidos. Existen técnicas avanzadas de resonancia magnética que pueden detectar daño cerebral en anteriores fases7,8. Sin embargo, en las primeras 48 h, un proceso de desarrollo neurológico anormal causará lesión cerebral permanente que no será evidente en imágenes médicas11. Además, los recursos de alto costo y escaso instrumento, junto con otros factores, hace imposible para todas las unidades neonatales tener acceso a estas técnicas de neuroimagen especializadas. Sin embargo, el uso de un biomarcador fácilmente accesible y práctico (como las catecolaminas y sus metabolitos) puede superar estas deficiencias, y la proyección de un biomarcador en los fluidos humanos puede ayudar en el diagnóstico precoz de la lesión cerebral y conducir a identificación de los bebés recién nacidos que necesitan neuroprotección9. Las catecolaminas en la orina pueden ser un índice fácil y obvio, debido a la correlación directa entre la cantidad de ellos liberados en líquidos y la función de neuroactivity.

Entre los fluidos biológicos, muestras de plasma y líquido cefalorraquídeo (LCR) no son fáciles de conseguir a través de los procedimientos traumáticos, y también es muy difícil deshacerse de interferencia debido a la proteína adhesiva y otras impurezas, conduciendo a una problemática y proceso desperdiciador de tiempo de muestreo que es inadecuado para la detección repetida. También, para los niños, es casi imposible obtener las muestras de manera traumática. Por lo tanto, muestra urinaria es mejor que las otras formas de muestreo, ya que es no invasivo, fácil de manejar y puede hacerse varias veces. Las muestras de orina son abundantes y fáciles de almacenar y mostrar grandes ventajas sobre las otras formas de muestras biológicas.

Los métodos principales para cuantificar las catecolaminas en fluidos biológicos son radioenzymic ensayos10, ensayos inmune absorbente ligado a enzima11, voltametría12 y lente termal espectrometría13. Pero existen deficiencias, tales como operaciones complicadas y difíciles de detectar múltiples objetivos. Hoy en día, la técnica de análisis dominante es cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC)14, juntada con sensibles electroquímico15 o fluorimétrica detección16, debido a su alta sensibilidad y buena selectividad. Con la tecnología de espectrometría de masas tándem, como la cromatografía líquida/espectrometría de masas (LC/MS) y cromatografía de líquidos/masas espectrometría/espectrometría de masas (LC/MS/MS), el análisis y cuantificación de los neurotransmisores pueden alcanzar altos exactitud y especificidad17,18. Sin embargo, la técnica MS requiere costosa instrumentación así como mano de obra calificada considerablemente, dificultando el método a aplicarse universalmente en los laboratorios más convencionales. Sistemas de HPLC-ECD se equipan comúnmente en laboratorios clínicos y más convencionales y así se han convertido en una común y buena opción para grupos de investigación a utilizar para la determinación química, pero requieren la muestra introducida en el sistema de limpia y de microescala volumen19. Por lo tanto, es de gran importancia para purificar y condensar la muestra antes del análisis. El método clásico para el paso de la purificación es la extracción líquido-líquido14,15,20 y extracción en fase sólida off-line, incluyendo columna de alúmina activada21,22 y diphenylborate (DPBA) complejación23,24,25,26.

Myeongho Lee et al. han estado utilizando resina de polímero modificada químicamente con éter de corona como adsorbente para extraer selectivamente las catecolaminas de la orina humana desde 200727. También, en 2006, Haibo He et al. demostró un enfoque de síntesis fácil de boronate afinidad extracción solvente byutilizing un compuesto de base nanomagnetic nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricos poliédricos (POSS) y aplicarlo en el enriquecimiento de catecolaminas en orina humana (noradrenalina y epinefrina, isoprenalina)28. También se aprovechó de los nanomateriales para cumplir con el trabajo, utilizando una tecnología llamada nano-electrospinning y formando el material fibroso del polímero en la nanoescala. El proceso de centrifugado eléctrico puede ajustar el diámetro, morfología y alineación espacial del producto controlando la tensión de trabajo y cambiar el contenido de la solución de hilatura junto con otros parámetros29. En comparación con el cartucho SPE convencional, nanofibras electrospun son altamente convenientes extraer y enriquecer analitos de una matriz compleja, ya que cuentan con alta relación superficie-área-volumen para los analitos con alta eficiencia, y exhiben más fácilmente controlado superficie propiedades químicas, permitiendo que el práctico accesorio de los compuestos objetivo. Estas propiedades hacen buenas opciones para adsorbentes SPE, reducción de la fase sólida y la desorción de solvente cantidad30,31,32,33. De catecolaminas en orina, nanofibras electrospun compuestos de éter de corona apolymeric con poliestireno (PCE-PS) se utilizan para extraer selectivamente tres catecolaminas (NE, E y DA)34. El documento indica que el éter corona selectivo adsorbe los objetivos de la NE, E y DA, que se basó en su geometría correcta para atar las catecolaminas a través de la formación de enlaces de hidrógeno. Los resultados muestran el material éter corona eficazmente, eliminar otros compuestos interferentes en las muestras biológicas. Inspirado en este informe, un nuevo método fue desarrollado para la extracción selectiva de las catecolaminas por uso de nanofibras compuesto electrospun compuesto por PCE-PS.

En este trabajo, el método divulgado previamente34 fue mejorado y se emplea no sólo para analizar con éxito E, NE y DA, sino también sus metabolitos, MHPG y DOPAC, en orina. También exploramos nuevas posibilidades para el mecanismo del proceso de adsorción. El método muestra satisfactoria eficiencia de extracción y selectividad para los cinco analitos, y el método se verificó en el análisis de orina de bebés en alto riesgo con daño cerebral perinatal y controles sanos.

Protocolo

Se obtuvo consentimiento informado de los padres, y se obtuvo la aprobación de la Junta de revisión institucional para el estudio. El estudio se realizó según el código de ética de la Asociación Médica Mundial (declaración de Helsinki) para experimentos con seres humanos. Cuidadores de todos los participantes siempre consentimiento para ser incluidos en el estudio. Aprobación del Comité ético del Hospital Zhongda, afiliado con la Universidad del sureste, también se obtuvo.

1. preparación de las soluciones necesarias para la extracción y la determinación de catecolaminas y columnas

  1. Preparar la columna PFSPE. 1-2 mg de nanofibras PCE-PS se dividen en alícuotas de 5 y 6 y utilizar una varilla fina de acero de 0,5 mm de diámetro para comprimirlos ordenada en el extremo de una punta de pipeta con un volumen de 200 μl.
  2. Preparar la orina artificial pesando urea 2,427 g 0,034 g el ácido úrico, creatinina 0,09 g, citrato trisódico 0,297 g, 0,634 g de cloruro de sodio, 0,45 g de cloruro de potasio, 0,161 g de cloruro de amonio, 0,089 g cloruro de calcio dihidratado, sulfato de magnesio 0,1 g heptahidratado, g 0,034 bicarbonato de sodio, oxalato de sodio 0,003 g, 0,258 g sulfato de sodio, dihidrogenofosfato de sodio 0,1 g y fosfato de hidrógeno disódico 0,011 g y disolver los productos químicos arriba en 200 mL desionizada agua.
  3. Prepare 2 mg/mL solución de diphenylborate (DPBA) solución disolviendo 2 mg del compuesto en 1 mL de agua destilada. Almacenar la solución en la oscuridad a 4 ° C.
  4. Estándar del analito
    Nota: La estructura química y propiedades de las catecolaminas son inestables y se descomponen fácilmente. El proceso de preparación de las normas tiene que ser muy rápido y debe evitar la exposición a luz solar directa.
    1. Pesar 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC y estándar interno 3, 4-dihydroxybenzylamine bromhidrato DHBA en tubos de microcentrífuga de 1,5 mL separadas. Diluir la solución DHBA en agua a 100 ng/mL antes de su uso.
    2. Oscilan los estándares dispuestos en la oscuridad a una velocidad alta hasta que los analitos se disuelven completamente. Esta es la acción principal; almacenar a-20 ° C por hasta varias semanas.
    3. Preparar a las poblaciones de analito secundario de 1.000 ng/mL. NE, E, DA, DOPAC y MHPG, transferir 5 μl de cada analito principal población a 4.975 μl de agua destilada en un tubo de centrífuga 5 mL y almacenar en la oscuridad a 4 ° C hasta su uso. Preparar diariamente de estas soluciones. Para DHBA, transfiera 5 μl de caldo primario en 4.995 μl de agua destilada en un tubo de centrífuga 5 mL y almacenar en la oscuridad por separado a 4 ° C.
    4. Hacer más diluciones con el stock de analito secundaria para crear una curva estándar (por ej., tabla 2 suplementaria). Almacene las soluciones en la oscuridad a 4 ° C y preparar todos los días.
    5. Prueba de la tensión óptima de detector ECD con los valores estándar de concentración adecuada. Variar el voltaje para encontrar un valor donde los analitos tienen el mejor aspecto de pico.
  5. Preparar el eluant con ácido fosfórico al 30%, 15% acetonitrilo, y 55% agua destilada. Para 10 mL de disolvente eluant, utilizar 5,5 mL de agua destilada y añadir 1.5 mL de acetonitrilo y 3 mL de ácido fosfórico gota a gota en el agua.

2. preparación de las muestras de orina Real y fase móvil

  1. Tienen las madres recoger la primera orina de la mañana de sus hijos usando tazas de orina aséptica. Transferir las muestras en tubos de polipropileno y etiqueta inmediatamente. A continuación, almacenar las muestras en un congelador de-20 ° C.
  2. Vortex y centrifugar las muestras urinarias en 1.510 x g durante 10 min a la temperatura (RT) para eliminar interferencias de partículas más ambiente. Deseche el sedimento y se reúnen los sobrenadantes para experimentos adicionales. Para extraer analitos con eficacia, proceder al tratamiento previo de PFSPE (paso 3) inmediatamente después de la centrifugación.
  3. Preparar la fase móvil
    1. Preparar una botella limpia, por lo menos 1 L. La composición de la fase móvil aparece en complementario tabla 1; para la fase móvil de 1 L, medida 6,7242 g de ácido cítrico, 93,06 mg de sal disódica del etileno diamina tetra acético (EDTA), 7,02 g de ortofosfato de sodio monometálicas, 404,5 mg de sal de sodio del ácido 1-heptanesulfonic y 3,5 g de sodio hidratan en la botella. Añadir 40 mL acetonitrilo y agua destilada agua a 1000 mL. Agita y vibra ultrasónicamente durante 15 min hasta que se disuelva la materia en la solución.
    2. Utilizando un medidor de pH con un electrodo de vidrio, ajustar el pH de la fase móvil a la 4.21 con una solución saturada de hidróxido de sodio.
    3. La fase móvil con un 0.45 μm del polivinilideno membrana microporosa fluoruro y un dispositivo de succión de vacío para eliminar las impurezas del filtro.
    4. Utiliza vibración ultrasónica durante 15 min a desgasificar la fase móvil cada vez que lo use.

3. PFSPE extracción y análisis de HPLC

  1. Activar las nanofibras. Prensa 100 μl de metanol y 100 μl de agua secuencialmente a la columna PFSPE utilizando una jeringa de 5 mL de forma lenta, gota a gota.
  2. Mezclar 100 μl de orina de la muestra con 100 μl de DPBA 2 mg/ml de la solución y 30 μL 100 ng/ml de solución DHBA (si, estándar interno) en un tubo 0,5 mL EP, luego transferir la solución mezclada a la columna PFSPE. Presione la solución mezclada a través de la columna PFSPE con una jeringa de plástico hermético de 5 mL usando la fuerza de la presión de aire.
  3. Lixiviación a la columna tres veces por la carga de 100 μl de solución DPBA (2 mg/mL) en la columna SPE y empuje la solución lentamente a través del cartucho con presión de aire con una jeringa de 5 mL de plástico hermético.
  4. 50 μl del eluant en la columna PFSPE de carga y empuje a través de la columna, que recoge el efluente con un tubo de 0,5 mL EP.
  5. Encienda el desgaseador de HPLC para desgasificar el aire en el sistema. Antes del análisis de las muestras, el sistema debe funcionar durante más de 0,5 h con la fase móvil para equilibrar y reducir el ruido de línea de base. Ver complementarios tabla 1 muestra los parámetros de configuración del sistema HPLC.
  6. Muestra de 20 μl de eluido con un muestreador automático y luego lo inyectan en el sistema HPLC-ECD.
  7. Una vez terminadas las carreras, apagar la celda del detector mediante la interfaz del detector. NO apague el celular con el interruptor en la parte posterior del detector, ya que podría dañar el instrumento.
  8. Cambiar manualmente la composición de la fase móvil a 10% de metanol y el 90% de agua. Duración de al menos 30 minutos. A continuación, cambiar manualmente la fase móvil metanol grado HPLC. Funcionar durante aproximadamente 15 minutos proteger el sistema en metanol. Para ejecutar este paso después del tiempo en marcha recomendado podría resultar en daños a la columna y el detector. Apague el flujo, luego apague el desgasificador.

4. ácido de Phenylboronic extracción de cartuchos (PBA)

PBA cartucho extracción procedimientos eran similares al esquema en Kumar et al. (2011) 25. todas las soluciones son empujadas a través del cartucho de la PBA (100 mg, 1 mL) con aire forzado por una jeringa.

  1. La condición del cartucho con 1 mL 80: 20 acetonitrilo-agua (v/v) que contiene 1% de ácido fórmico y 1 mL de 50 mM de tampón fosfato (pH 10) secuencialmente.
  2. Presione la muestra de orina tamponada (1 mL de orina y 2 mL de tampón fosfato, pH 8,5) a través del cartucho de la PBA.
  3. Lavar el cartucho con 1 mL 50: 50 v/v acetonitrilo-tampón de fosfato (10 mM, pH 8,5).
  4. Procederá a la elución del cartucho con 1 mL de acetonitrilo-agua (80: 20 v/v) que contiene 1% de ácido fórmico.

5. identificación y cuantificación de catecolaminas

  1. Linealidad de
    1. Diluir la acción secundaria de analitos con orina artificial a seis concentraciones (1.5, 3, 12, 25, 50 y 100 ng/mL); el volumen de dilución de la orina artificial sigue complementario tabla 2. Hacer tres muestras paralelas con cada concentración para obtener 18 analitos soluciones experimentales para construir curvas de calibración.
    2. Diluir 10 veces acción secundaria DHBA con orina artificial a 100 ng/mL de la solución experimental.
    3. Prepare todas las soluciones del analito de 5.1.1, según el paso 3 (procedimientos de extracción de PFSPE). Como en el paso 3, inyectar 20 μl de cada efluente correspondiente en el sistema HPLC-dpi para obtener un cromatograma HPLC.
    4. Construir curvas de calibración de los cinco analitos trazando la proporción del área pico (objetivos/es) como el eje Y contra la relación de concentraciones (objetivos/es) como el eje X, como se muestra en la figura 1 complementaria.
  2. LOD y LOQ el valor de la sensibilidad
    1. Inyectar 20 μl de orina artificial en blanco en el sistema HPLC-ECD (como en el paso 3), para obtener el cromatograma HPLC de la muestra.
    2. En el cromatograma de 5.2.1, recoger 11 valores de señal en blanco y calcular el valor medio Xb ybde la desviación estándar S. Calcular la mínima señal de una sustancia que puede detectarse un cierto nivel de confianza, XL, como XL = Xb+ K * Sb (K es el coeficiente determinado por el nivel de confianza, Sb refleja el nivel de ruido de la método de medición y el nivel de ruido de la máquina). Por lo tanto, LOD = (XL-Xb) / s = (K * Sb) / s (S está parado para el valor de la pendiente de la curva de trabajo).
    3. Definir un número de 3:1 (K = 3) como el límite de detección (LOD) y un número de 10:1 (K = 10) como el límite de cuantificación (LOQ).
  3. Evaluar las recuperaciones
    1. Preparar las muestras de orina real y pinchos. Diluir la acción secundaria de analitos con orina real a tres concentraciones (5, 50, 100 ng/mL) para obtener las muestras de orina con picos. Preparar tres muestras paralelas para cada solución del analito. Cuenta la concentración con picos como la cantidad de compuestos de la blanco tacon en la muestra de orina. Definir este valor como unas.
    2. Stock DHBA diluida a 100 ng/mL, como en el paso 5.1.2.
    3. Proceso de cada solución de la muestra de 5.3.1 según el paso 3 (procedimientos de extracción de PFSPE) e inyectar 20 μl de cada eluant correspondiente en el sistema HPLC-dpi para obtener el resultado del cromatograma. El valor de los analitos se contará como una cantidad de compuestos de target en la muestra de orina con picos. Definir este valor como unat.
    4. Inyectar 20 μl de muestra de orina en el sistema HPLC-ECD (como en el paso 3) para obtener el resultado del cromatograma. El valor de los analitos se contará como una cantidad inicial de blanco compuestos de cuantificado en la muestra de orina. Definir este valor como unyo.
    5. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. El porcentaje de recuperación se estima como metodológico recuperación % = (t - A) × 100 / (unas). Valores se muestran en la tabla 1.
  4. Evaluar la imprecisión
    1. Preparar las muestras de orina artificial con picos de 5, 50 y 100 concentraciones de ng/mL como en el paso 5.3.1. Preparar seis muestras paralelas para cada solución del analito. Preparar muestras experimentales frescas todos los días.
    2. Diluir el caldo DHBA a 100 ng/mL como en el paso 5.1.2.
    3. Evaluar la precisión intra-día (n = 6). Cada solución de la muestra en 5.4.1 según el paso 3 del proceso e inyectar 20 μl de cada corresponsal eluant en el sistema de HPLC-DIT para el cromatograma. Hacer la misma operación seis veces en el mismo día.
    4. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. Bajo la misma concentración del mismo compuesto, se determina la desviación estándar relativa (RSD) de los seis ensayos en un día como precisión intra-día. Valores se muestran en la tabla 1.
    5. Evaluar la precisión (n = 6). Al mismo tiempo cada día en los seis días alternativamente, preparar las muestras de orina artificial con picos para tres concentraciones de 5, 50 y 100 ng/mL, como en 5.4.1 y 5.4.2. y cada solución de analito de la muestra según el paso 3 del proceso.
    6. Inyectar 20 μl de cada efluente correspondiente de 5.4.5 en el sistema HPLC-dpi para obtener resultados de cromatograma cada día. Calcular la cantidad de compuestos de la blanco en las muestras de la ecuación de la curva estándar. Precisión interdía se expresa por el RSD de la cantidad de ensayos de las muestras de orina artificial con picos en las tres concentraciones en seis días alternativamente. Valores se muestran en la tabla 1.

Resultados

Este protocolo es un método simple y conveniente de PFSPE pretratar las muestras de orina y enriquecer las cinco catecolaminas para la detección mediante el sistema de HPLC-ECD; en la figura 1muestra un diagrama del proceso. El protocolo incluye principalmente cuatro pasos activación, carga, enjuague y liberador - junto con una pequeña cantidad de nanofibras PCE-PS y un dispositivo de extracción en fase sólida simple. La morfología de nanofibras PCE-PS...

Discusión

El método PFSPE propuesto en este documento puede ser significativa y significativa con respecto a su rapidez, sencillez y comodidad. Los adsorbentes utilizados en el protocolo son nanofibras electrospun, que tienen una proporción de volumen de área de superficie alta y por la adsorción de los analitos con alta eficiencia. El procedimiento sólo necesita unos pocos miligramos de nanofibras y un pequeño volumen de disolvente eluant y no requiere un paso de evaporación para concentrar los analitos. Aquí, hemos prese...

Divulgaciones

Los autores certifican que no existe ningún conflicto de interés con cualquier entidad financiera sobre el material discutido en este artículo.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por la nacional ciencia Fundación de China (No.81172720, Nº 81673230), el Departamento de tecnología (Nº y Social desarrollo investigación programa de Jiangsu provincia de ciencia BE2016741), ciencia y tecnología de China la Administración General de supervisión de calidad, inspección y cuarentena (2015QK055), el programa del proyecto abierto del laboratorio clave de ciencia del Ministerio de educación, de aprendizaje y desarrollo del niño Universidad del sureste (CDL-2016-04). Reconocemos sinceramente Song Yuan y Ping Liu que nos ayudaron en la recogida de muestras.

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipcolumn to contain nanofibers
PCE-PS nanofibersmaterial for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter)fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml)compress solution into the end of the tip
methanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408complex reagent
norepinephrine(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyte
epinephrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyte
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781interior label
acetonitrileSigma-Aldrich.Inc75-05-8eluriant and mobile phase
phosphoric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriant
uric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2artifical urine
creatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5artifical urine
trisodium citrateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3artifical urine
KClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7447-40-7artifical urine
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9artifical urine
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326artifical urine
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0artifical urine
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6artifical urine
disodium hydrogen phosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4artifical urine
ureaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6artifical urine
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5artifical urine
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artifical urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8artifical urine
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0artifical urine
citric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9artifical urine and mobile phase
EDTA disodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6mobile phase
monometallic sodium orthophosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6mobile phase
sodium hydroxideSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column)Aglilent12102018PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm columnDikma5020-06731HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACauto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid ChromatographyShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detectorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60Adetector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAsurface and porosity analyzer 

Referencias

  1. Elhwuegi, A. S. Central monoamines and their role in major depression. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 28, 435-451 (2004).
  2. Da, C. F., Ngoabdalla, S., Houzel, J. C., Rehen, S. K. Murine model for Parkinsons disease: From 6-OH dopamine lesion to behavioral test. J. Vis. Exp. (35), e1376 (2010).
  3. Varley, H., Gowenlock, A. H. The clinical chemistry of monoamines. Brit. Med. J. 2, 1330 (1963).
  4. Wang, X., Rousset, C. I., Hagberg, H., Mallard, C. Lipopolysaccharide-induced inflammation and perinatal brain injury. Semin. Fetal. Neonatal. Med. 11, 343-353 (2006).
  5. Inder, T. E., Volpe, J. J. Mechanisms of perinatal brain injury. Semin. Neonatol. 5, 3-16 (2000).
  6. Miller, S. P., Ferriero, D. M. From selective vulnerability to connectivity: Insights from newborn brain imaging. Trends. Neurosci. 32, 496-505 (2009).
  7. Barkovich, A. J., et al. Proton MR spectroscopy for the evaluation of brain injury in asphyxiated, term neonates. Am. J. Neuroradiol. 20, 1399-1405 (1999).
  8. Liauw, L., van Wezel-Meijler, G., Veen, S., van Buchem, M. A., van der Grond, J. Do apparent diffusion coefficient measurements predict outcome in children with neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy?. Am. J. Neuroradiol. 30, 264-270 (2009).
  9. Varsami, M., et al. Inflammation and oxidative stress biomarkers in neonatal brain hypoxia and prediction of adverse neurological outcome: A review. J. Pediatr. Neonat. Individual. Med. 2, e020203 (2013).
  10. Cooper, R. L., Walker, R. F. Microradioenzymic assays for the measurement of catecholamines and serotonin. Methods. Enzymol. 103, 483-493 (1983).
  11. Murphy, J. F. The development of enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) for the catecholamines adrenaline and noradrenaline. J. Immunol. Methods. 154, 89-98 (1992).
  12. Jones, S. R., Mickelson, G. E., Collins, L. B., Kawagoe, K. T., Wightman, R. M. Interference by pH and Ca2+ ions during measurements of catecholamine release in slices of rat amygdala with fast-scan cyclic voltammetry. J. Neurosci. Methods. 52, 1-10 (1994).
  13. Sanchismallols, J. M., Villanuevacamañas, R. M., Ramisramos, G. Determination of unconjugated catecholamine in urine as dopamine by thermal lens spectrometry. Analyst. 117, 1367-1371 (1992).
  14. Lan, C., Liu, W. Determination of catecholamines by HPLC-ECD in urine. Medical Laboratory Science and Clinics. , (2007).
  15. Tsunoda, M., Aoyama, C., Ota, S., Tamura, T., Funatsu, T. Extraction of catecholamines from urine using a monolithic silica disk-packed spin column and high-performance liquid chromatography-electrochemical detection. Anal. Methods. 3, 582-585 (2011).
  16. Bartolini, B., et al. Determination of monoamine oxidase activity by HPLC with fluorimetric detection. Neurobiology (Bp). 7, 109-121 (1999).
  17. Dunand, M., Gubian, D., Stauffer, M., Abid, K., Grouzmann, E. High throughput and sensitive quantitation of plasma catecholamines by ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometryusing a solid phase microwell extraction plate. Anal. Chem. 85, 3539-3544 (2013).
  18. He, H., Carballo-Jane, E., Tong, X., Cohen, L. H. Measurement of catecholamines in rat and mini-pig plasma and urine by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with solid phase extraction. J. Chromatogr. B. 997, 154-161 (2015).
  19. Simon, N., Young, P. How to increase serotonin in the human brain without drugs. J. Psychiatry. Neurosci. 32, 394-399 (2007).
  20. Grossi, G., et al. Improvements in automated analysis of catecholamine and related metabolites in biological samples by column-switching high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A. 541, 273-284 (1991).
  21. Iwamot, T., Yoshiura, M., Iriyama, K. Liquid chromatographic identification of urinary catecholamine metabolites adsorbed on alumina. J. Liq. Chromatogr. R. T. 10, 1217-1235 (1987).
  22. Maycock, P. F., Frayn, K. N. Use of alumina columns to prepare plasma samples for liquid-chromatographic determination of catecholamines. Clin. Chem. 33, 286-287 (1987).
  23. Grossi, G., Bargossi, A., Lippi, A., Battistoni, R. A fully automated catecholamines analyzer based on cartridge extraction and HPLC separation. Chromatographia. 24, 842-846 (1987).
  24. Rondelli, I., et al. New method for the resolution of the enantiomers of 5,6-dihydroxy-2-methyl-aminotetralin by selective derivatization and HPLC analysis: Application to biological fluids. Chirality. 8, 381-389 (1996).
  25. Kumar, A., Hart, J. P., McCalley, D. V. Determination of catecholamines in urine using hydrophilic interaction chromatography with electrochemical detection. J. Chromatogr. A. 1218, 3854-3861 (2011).
  26. Sabbioni, C., et al. Simultaneous liquid chromatographic analysis of catecholamines and 4-hydroxy-3-methoxyphenylethylene glycol in human plasma: Comparison of amperometric and coulometric detection. J. Chromatogr. A. 1032, 65-71 (2004).
  27. Lee, M., et al. Selective solid-phase extraction of catecholamines by the chemically modified polymeric adsorbents with crown ether. J. Chromatogr. A. 1160, 340-344 (2007).
  28. He, H., et al. Facile synthesis of a boronate affinity sorbent from mesoporous nanomagnetic polyhedral oligomeric silsesquioxanes composite and its application for enrichment of catecholamines in human urine. Anal. Chim. Acta. 944, 1-13 (2016).
  29. Subbiah, T., Bhat, G. S., Tock, R. W., Parameswaran, S., Ramkumar, S. S. Electrospinning of nanofibers. J. Appl. Polym. Sci. 96, 557-569 (2005).
  30. Hu, W. Y., et al. Packed-fiber solid-phase extraction coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry for determination of diethylstilbestrol, hexestrol, and diedestrol residues in milk. J. Chromatogr. B. 957, 7-13 (2014).
  31. Liu, Z., Kang, X., Fang, F. Solid phase extraction with electrospun nanofibers for determination of retinol and α-tocopherol in plasma. Microchim. Acta. 168, 59-64 (2010).
  32. Qi, D., Kang, X., Chen, L., Zhang, Y., Wei, H., Gu, Z. Electrospun polymer nanofibers as a solid-phase extraction sorbent for the determination of trace pollutants in environmental water. Anal. Bioanal. Chem. 390, 929-938 (2008).
  33. Kang, X. J., Chen, L. Q., Zhang, Y. Y., Liu, Y. W., Gu, Z. Z. Performance of electrospun nanofibers for SPE of drugs from aqueous solutions. J. Sep. Sci. 31, 3272-3278 (2008).
  34. Chen, L. Q., Wang, Y., Qu, J. S., Deng, J. J., Kang, X. J. Selective extraction of catecholamines by packed fiber solid-phase using composite nanofibers composing of polymeric crown ether with polystyrene. Biomed. Chromatogr. 29, 103-109 (2015).
  35. Chen, L. Q., Zhu, X. H., Shen, J., Zhang, W. Q. Selective solid-phase extraction of catecholamines from plasma using nanofibers doped with crown ether and their quantitation by HPLC with electrochemical detection. Anal. Bioanal. Chem. 408, 4987-4994 (2016).
  36. Hu, H., Zhang, Y., Zhang, Y., Huang, X., Yuan, D. Preparation of a new sorbent based on boronate affinity monolith and evaluation of its extraction performance for nitrogen-containing pollutants. J. Chromatogr. A. 1342, 8-15 (2014).
  37. Chen, J., et al. Sensitive determination of four camptothecins bysolid-phase microextraction-HPLC based on a boronic acid contained polymer monolithic layer. Anal. Chim. Acta. 879, 41-47 (2015).
  38. Li, D., Chen, Y., Liu, Z. Boronate affinity materials for separation and molecular recognition: structure, properties and applications. Chem. Soc. Rev. 44, 8097-8123 (2015).
  39. Yan, J., Springsteen, G., Deeter, S., Wang, B. The relationship among pKa, pH, and binding constants in the interactions between boronic acids and diols: It is not as simple as it appears. Tetrahedron. 60, 11205-11209 (2004).
  40. Reuster, T., Rilke, O., Oehler, J. High correlation between salivary MHPG and CSF MHPG. Psychopharmacology. 162, 415-418 (2002).
  41. Beckmann, H., Goodwin, F. K. Urinary MHPG in subgroups of depressed patients and normal controls. Neuropsychobiology. 6, 91-100 (1980).
  42. Mitoma, M., et al. Stress at work alters serum brain-derived neurotrophic factor (BDNF) levels and plasma 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) levels in healthy volunteers: BDNF and MHPG as possible biological markers of mental stress?. Prog. Neuropsychopharmacol. Biol. Psychiatry. 32, 679-685 (2008).
  43. Ressler, K. J., Nemeroff, C. B. Role of Norepinephrine in the Pathophysiology and Treatment of Mood Disorders. Biol. Psychiatry. 46, 1219-1233 (1999).
  44. Alonso-Spilsbury, M., et al. Perinatal asphyxia pathophysiology in pig and human: A review. Anim. Reprod. Sci. 90, 1-30 (2005).
  45. Shalak, L., Perlman, J. M. Hypoxic-ischemic brain injury in the term infant: Current concepts. Early. Hum. Dev. 80, 125-141 (2004).
  46. Maas, J. W., Leckman, J. F. relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary MHPG and other norepinephrine metabolites. MHPG: Basic Mechanisms and Psychopathology. , 33-43 (1983).
  47. Maas, J. W. Relationships between central nervous system noradrenergic function and plasma and urinary concentrations of norepinephrine metabolites. Adv. Biochem. Psychopharmacol. 39, 45-55 (1984).
  48. Peyrin, L., Pequignot, J. M., Chauplannaz, G., Laurent, B., Aimard, G. Sulfate and glucuronide conjugates of 3-methoxy-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) in urine of depressed patients: Central and peripheral influences. J. Neural. Transm. 63, 255-269 (1985).
  49. Peyrin, L. Urinary MHPG sulfate as a marker of central norepinephrine metabolism: A commentary. J. Neural. Transm. 80, 51-65 (1990).

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