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Resumo

Apresentamos uma conveniente extração de fase sólida acoplada a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) com deteção eletroquímica (ECD) para a determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina e dois dos seus metabolitos na urina dos bebês. Também identificamos o metabólito MHPG como um potencial biomarcador para o diagnóstico precoce de lesões cerebrais para infantes.

Resumo

A extração e a análise dos neurotransmissores catecolaminas em fluidos biológicos é de grande importância na avaliação da função do sistema nervoso e doenças relacionadas, mas sua medida precisa ainda é um desafio. Muitos protocolos têm sido descritos para medição do neurotransmissor por uma variedade de instrumentos, incluindo cromatografia líquida de alta pressão (HPLC). No entanto, existem deficiências, tais como a operação complicada ou difícil de detectar alvos múltiplos, que não podem ser evitados, e atualmente, a técnica de análise dominante é ainda HPLC acoplado com sensível eletroquímico ou detecção de fluorimétrica, devido a sua sensibilidade elevada e boa seletividade. Aqui, um protocolo detalhado é descrito para o pré-tratamento e a detecção de catecolaminas com cromatografia líquida de alta pressão com deteção eletroquímica (HPLC-ECD) em amostras de urina real dos lactentes, usando electrospun de nanofibras composto composto de éter de coroa poliméricas de poliestireno como adsorvente, também conhecido como o método de extração (PFSPE) embalado-fibra de fase sólida. Mostramos como urina amostras podem ser facilmente precleaned por uma coluna de fase sólida nanofibras-embalados, e como os analitos na amostra podem ser rapidamente enriquecidos, em estudo dessorvida e detectado em um sistema ECD. PFSPE simplifica os procedimentos de pré-tratamento de amostras biológicas, permitindo a diminuição do tempo gasto e redução da perda de alvos.

Em geral, este trabalho ilustra um protocolo simples e conveniente para a extração de fase sólida acoplada a um sistema de HPLC-ECD para determinação simultânea de três neurotransmissores monoamina (norepinefrina (NE), epinefrina (E), dopamina (DA)) e dois de seus metabólitos (3-metoxi-4-hydroxyphenylglycol (MHPG) e ácido 3,4-diidroxi-fenilacético (DOPAC)) na urina dos bebês. O protocolo estabelecido foi aplicado para avaliar as diferenças de catecolaminas urinárias e seus metabolitos entre lactentes de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis. Análise comparativa revelou uma diferença significativa entre os dois grupos, indicando que os metabólitos de catecolaminas podem ser um marcador de candidato importante para o diagnóstico precoce dos casos em risco de danos cerebrais em crianças em MHPG urinário.

Introdução

Os neurotransmissores catecolaminas e seus conteúdos metabolito em fluidos corporais podem afetar a função neural e afetam o equilíbrio dos Estados de estímulo-resposta-à uma extensão grande1. Abnormities pode causar uma variedade de doenças, tais como pheochromacytoma, ganglioneuroma, neuroblastoma e distúrbios neurológicos1,2. A extração e a determinação de catecolaminas em fluidos corporais é significativo para o diagnóstico das doenças relevantes. No entanto, catecolaminas em amostras biológicas existem em baixas concentrações e são facilmente oxidadas. Além disso, eles são muito difíceis de eluir devido à grande quantidade de interferência no médio3. Assim, a deteção simultânea de catecolaminas em fluidos biológicos ainda é um desafio.

Tem havido comentários mostrando que catecolaminas urinárias podem ser uma medida de stress, e que seus níveis são importantes marcadores biológicos respondendo à estimulação tátil processamento em recém-nascidos5. De acordo com a pesquisa, todas as crianças que sofreram de incidentes prematuros correm risco de lesão de cérebro a4,5,6, e lesão pode causar anormal liberação de catecolaminas e assuntos afins para os fluidos. Existem técnicas avançadas de ressonância magnética que podem detectar danos cerebrais em anteriores fases7,8. No entanto, dentro as primeiras 48 horas, um processo de desenvolvimento neurológico anormal causará danos cerebrais permanentes que não será evidente em imagens médicas11. Além disso, os recursos de alto custo e escassos instrumento, juntamente com outros fatores, torna impossível para todas as unidades neonatais ter acesso a estas técnicas especializadas de neuro-imagem. No entanto, o uso de um biomarcador facilmente acessível e prático (como catecolaminas e seus metabólitos) poderia superar estas deficiências, e a seleção de um biomarcador em fluidos humano pode ajudar no diagnóstico precoce de lesão cerebral e levar a solicitar identificação dos infantes recém-nascidos necessitam de neuroproteção9. As catecolaminas na urina podem ser um índice de fácil e óbvio, devido a correlação direta entre a quantidade deles lançado em fluidos e neuroactivity função.

Entre os fluidos biológicos, líquido cerebrospinal (CSF) e amostras de plasma não são fáceis de obter através de procedimentos traumáticos existentes, e também é muito difícil se livrar de interferência devido a proteína adesiva e outras impurezas, levando a uma incômoda e processo de amostragem demorada que é inadequado para a deteção repetida. Além disso, para as crianças, é quase impossível conseguir as amostras de forma traumática. Portanto, a amostragem urinária é melhor do que as outras formas de amostragem, como é não-invasivo, fácil de operar e pode ser feito repetidamente. Amostras de urina são abundantes e fáceis de armazenar e mostrar grandes vantagens sobre as outras formas de amostras biológicas.

Os principais métodos para quantificar as catecolaminas em fluidos biológicos incluem ensaios de radioenzymic10, ensaios imune-adsorvente enzima-lig11, voltametria12 e lente térmica espectrometria13. Mas existem deficiências, tais como operações complicadas e difíceis de detectar alvos múltiplos. Hoje, a técnica de análise dominante é a cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)14, juntamente com o sensível eletroquímica15 ou fluorimétrica deteção16, devido à sua alta sensibilidade e seletividade de boa. Com a tecnologia de espectrometria de massa em tandem, tais como cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS) e espectrometria de massa cromatografia líquida/espectrometria de massa (LC/MS/MS), a análise e quantificação dos neurotransmissores podem alcançar alto precisão e especificidade17,18. No entanto, a técnica requer instrumentação cara, bem como mão de obra qualificada substancialmente, dificultando o método a aplicar-se universalmente em laboratórios mais convencionais. Sistemas de HPLC-ECD são comumente equipados em laboratórios clínicos e mais convencionais e tornaram-se assim uma escolha comum e bom para grupos de pesquisa a ser usado para determinação de química, mas eles exigem a amostra introduzida no sistema para ser limpo e de microescala volume19. Assim, é de grande importância para purificar e condensar a amostra antes da análise. O método clássico para a etapa de purificação é extração líquido-líquido14,15,20 e off-line extração de fase sólida, incluindo alumina ativada coluna21,22 e diphenylborate (DPBA) complexação23,24,25,26.

Myeongho Lee et al . Tenho vindo a utilizar resina de polímero quimicamente modificada com éter de coroa como o adsorvente para extrair seletivamente catecolaminas de urina humana desde 200727. Além disso, em 2006, que Haibo et al. demonstrou uma abordagem de síntese facile para boronate afinidade extração adsorvente byutilizing um nanomagnetic functionalizable silsesquioxane oligoméricas poliédrico (POSS) composto de nanomagnetic com base e aplicando-a para o enriquecimento de catecolaminas em urina humana (noradrenalina, adrenalina e isoproterenol)28. Eles também aproveitaram os nanomateriais para cumprir o trabalho, usando uma tecnologia chamada nano-eletrofiação e formando o material fibroso de polímero em nanoescala. O processo de eletrofiação pode ajustar o diâmetro, morfologia e alinhamento espacial do produto, controlando a tensão de funcionamento e alterando o conteúdo da solução de fiação, juntamente com outros parâmetros,29. Comparado com o cartucho convencional do SPE, electrospun Nanofibras são altamente apropriadas extrair e enriquecer os analitos de destino de uma matriz complexa, como são equipados com elevados rácios de superfície-área-volume para adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada, e apresentam mais facilmente controlado superfície químicas Propriedades, permitindo que o apego à mão dos compostos alvo. Estas propriedades fazem-lhes boas escolhas para adsorventes SPE, reduzindo a fase sólida e a dessorção solvente quantidade30,31,de32,33. Para catecolaminas em amostras de urina, electrospun nanofibras compostas de éter de coroa apolymeric com poliestireno (PCE-PS) foram usadas para extrair seletivamente três catecolaminas (NE, E e DA)34. O jornal indicou que o éter de coroa seletiva adsorvido os destinos do NE, E e DA, que foi baseada na sua geometria correta para a vinculação de catecolaminas através de formando ligações de hidrogênio. Os resultados exibidos o éter coroa material efetivamente, remoção de outros compostos interferentes contidos em amostras biológicas. Inspirado por este relatório, um novo método foi desenvolvido para a extração seletiva das catecolaminas pelo uso de electrospun de nanofibras composto composto do PCE-PS.

Neste trabalho, o método relatado anteriormente34 foi melhorado e empregados não só para analisar com êxito E, NE e o pai, mas também seus metabolitos, MHPG e DOPAC, na urina. Podemos também explorar novas possibilidades para o mecanismo do processo de adsorção. O método mostra satisfatória eficiência de extração e seletividade para os cinco analitos, e o método foi verificado na análise da urina de bebês de alto risco com uma lesão cerebral perinatal e controles saudáveis.

Protocolo

Foi obtido consentimento dos pais, e aprovação do Conselho de revisão institucional foi obtida para o estudo. O estudo foi realizado em conformidade com o código de ética da associação médica mundial (declaração de Helsinque) para experimentos envolvendo seres humanos. Cuidadores de todos os participantes fornecidos autorização por escrito para serem incluídos no estudo. Aprovação do Comitê de ética do Hospital de Zhongda, afiliado com a Universidade do sudeste, obteve-se também.

1. preparação das soluções necessárias para a extração e a determinação de catecolaminas e colunas

  1. Prepare a coluna PFSPE. Divida 1-2 mg de nanofibras de PCE-PS em alíquotas de 5-6 e use uma haste de aço fina com 0,5 mm de diâmetro para comprimi-los ordenada na extremidade de uma ponta da pipeta com um volume de 200 µ l.
  2. Preparar a urina artificial por pesagem ureia 2,427 g 0,034 g de ácido úrico, creatinina de 0,09 g, citrato trissódico 0,297 g, 0,634 g de cloreto de sódio, 0,45 g de cloreto de potássio, 0,161 g de cloreto de amónio, 0,089 g de cloreto de cálcio dihidratado, 0,1 g de sulfato de magnésio hepta-hidratado, 0,034 g de bicarbonato de sódio, oxalato de sódio 0,003 g, 0,258 g sulfato de sódio, fosfato de-hidrogenofosfato de sódio 0,1 g e hidrogenofosfato dissódico de 0,011 g e dissolver os produtos químicos acima em 200 mL água deionizada água.
  3. Prepare 2 mg/mL solução stock de diphenylborate (DPBA) solução dissolvendo-se 2 mg do composto em 1 mL de água destilada. Armazenar a solução no escuro a 4 ° C.
  4. Padrão do analito
    Nota: A estrutura química e propriedades de catecolaminas são instáveis e facilmente decompor. O processo de preparação das normas tem que ser muito rápido e deve evitar a exposição à luz solar direta.
    1. Pese 1,0 mg de NE, E, DA, MHPG, DOPAC e padrão interno 3,4-dihydroxybenzylamine hydrobromide DHBA em tubos de microcentrifuga separadas 1,5 mL. Dilua a solução DHBA em água a 100 ng/mL antes da utilização.
    2. Oscila os padrões preparados no escuro em alta velocidade até analitos dissolvem completamente. Este é o estoque principal; armazenar a-20 ° C por até várias semanas.
    3. Prepare os 1.000 estoques secundária do analito ng/mL. Para NE, E, DA, DOPAC e MHPG, transferir 5 µ l de cada analito primário estoque para 4.975 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro a 4 ° C até o uso. Prepare estes diariamente novas soluções. Para DHBA, transferir 5 µ l de caldo primário para 4.995 µ l de água destilada em um tubo de centrífuga de 5 mL e armazená-lo no escuro separadamente a 4 ° C.
    4. Fazer mais diluições com o estoque de analito secundário para criar uma curva padrão (ex., complementar a tabela 2). Loja soluções no escuro a 4 ° C e preparar fresca diariamente.
    5. Teste a voltagem ideal do detector ECD usando o estoque padrão com concentração adequada. Varia a tensão para encontrar um valor onde os analitos tem a melhor aparência de pico.
  5. Preparar o eluente contendo ácido fosfórico de 30%, 15% acetonitrila, e 55% de água destilada. Para 10 mL de solvente eluente, usar 5,5 mL de água destilada e adicione 1,5 mL de acetonitrilo e 3 mL de ácido fosfórico gota a gota na água.

2. preparação de amostras de urina Real e fase móvel

  1. Têm mães coletar a primeira urina da manhã de seus bebês usando copos de urina asséptica. Transferi as amostras em tubos de polipropileno e rótulo imediatamente. Em seguida, armazene as amostras no congelador-20 ° C.
  2. Vórtice e centrifugar as amostras urinárias a 1.510 x g durante 10 minutos a temperatura (RT) para livrar-se da maioria das partículas interferência. Descartar o sedimento e reunir os sobrenadantes para novas experiências. A fim de extrair analitos efetivamente, proceda à PFSPE pré-tratamento (etapa 3) imediatamente após a centrifugação.
  3. Preparar a fase móvel
    1. Preparar um frasco limpo, pelo menos 1 L. A composição da fase móvel está listada na tabela complementar 1; para a fase móvel de 1 L, medida 6,7242 g de ácido cítrico, 93,06 mg de sal dissódico etileno diamina tetra acético (EDTA), de 7,02 g de ortofosfato de sódio monometallic, 404,5 mg de sal de sódio ácido 1-heptanesulfonic e 3,5 g de sódio hidratam de uma garrafa. Adicionar 40 mL acetonitrila e água destilada para 1.000 mL. Agitar e vibrar ultrassonicamente durante 15 min até que o problema na solução é tudo dissolvido.
    2. Usando um medidor de pH com um eletrodo de vidro, ajuste o valor de pH da fase móvel para 4.21 com uma solução saturada de hidróxido de sódio.
    3. Filtre a fase móvel com uma membrana de microporous fluoreto de polivinilideno 0,45 µm e um dispositivo de sucção de vácuo para se livrar de impurezas.
    4. Use vibração ultra-sônica por 15 min para desgaseificar a fase móvel cada vez antes de usar.

3. PFSPE extração e análise HPLC

  1. Ative as nanofibras. Pressione 100 µ l de metanol e 100 µ l de água sequencialmente através da coluna PFSPE usando uma seringa de 5 mL de forma lenta, gota a gota.
  2. Urina de Mix 100 µ l da amostra com solução DPBA 100 µ l 2 mg/ml e 30 µ l 100 ng/ml de solução DHBA (IS, padrão interno) em um tubo de 0,5 mL EP e, em seguida, transferir a solução mista para a coluna PFSPE. Pressione a solução mista amostra através da coluna PFSPE com uma seringa 5ml de plástico herméticos usando a força da pressão do ar.
  3. Lixiviar coluna três vezes carregando 100 µ l de solução DPBA (2 mg/mL) em coluna SPE e empurre a solução lentamente através do cartucho com uma pressão de ar, utilizando uma seringa de plástico herméticos de 5 mL.
  4. Carregar 50 µ l do eluente na coluna PFSPE e empurrá-lo através da coluna, recolhendo o eluído com um tubo de 0,5 mL EP.
  5. Ligue o desgaseificador HLPC para desgaseificar o ar no sistema. Antes da análise da amostra, o sistema deve executar para mais de 0,5 h com a fase móvel para equilibrar e reduzir o ruído da linha de base. Ver tabela complementar 1 mostrando os parâmetros de configuração do sistema de HPLC.
  6. 20 µ l do eluato usando um amostrador automático da amostra e depois injetá-lo no sistema de HPLC-ECD.
  7. Quando as pistas estiverem completas, desliga o celular detector usando a interface do detector. Não desligue o celular com o interruptor na parte traseira do detector, como isso poderia danificar o instrumento.
  8. Altere manualmente a composição da fase móvel, 10% de metanol e 90% de água. Executado pelo menos 30 min. Em seguida, altere manualmente a fase móvel para metanol grau HPLC. Executado por cerca de 15 min proteger o sistema em metanol. Execute esta etapa após o tempo de execução recomendado pode resultar em danos para a coluna e o detector. Desligue o fluxo e, em seguida, desligue o desgaseificador.

4. Phenylboronic ácido extração de cartuchos (PBA)

Procedimentos de extração de cartucho PBA foram semelhantes ao regime em Kumar et al. (2011) 25. todas as soluções são empurradas através do cartucho PBA (100 mg, 1 mL) com ar forçado por uma seringa.

  1. Condição do cartucho com 1 mL 80: 20 acetonitrila-água (v/v) contendo 1% de ácido fórmico e 1 mL de tampão fosfato de 50mm (pH 10) sequencialmente.
  2. Pressione a amostra de urina no buffer (tampão de fosfato de urina e 2 mL de 1 mL, pH 8,5) através do cartucho do PBA.
  3. Lave o cartucho com 1 mL 50: 50 v/v acetonitrilo-fosfato (10 mM, pH 8,5).
  4. Eluir o cartucho com 1 mL de acetonitrila-água (80: 20 v/v) contendo 1% de ácido fórmico.

5. identificação e quantificação de catecolaminas

  1. Linearidade
    1. Diluir o estoque de analitos secundário com urina artificial de seis concentrações (1.5, 3, 12, 25, 50 e 100 ng/mL); o volume de diluição da urina artificial segue suplementares tabela 2. Fazer três amostras paralelas com cada concentração para obter 18 analito experimental soluções para a construção de curvas de calibração.
    2. Dilua o estoque secundário de DHBA com urina artificial 10-fold para obter a solução experimental de 100 ng/mL.
    3. Pré-tratamento todas as soluções de analito de 5.1.1, de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE). Como na etapa 3, Injecte 20 µ l de cada eluído correspondente no sistema HPLC-ECD para obter uma cromatograma HPLC.
    4. Construir as curvas de calibração das substâncias a cinco analisar plotando a relação da área do pico (metas/IS) como eixo Y contra a relação de concentrações (metas/IS) como o eixo X, conforme mostrado na Figura complementar 1.
  2. LOD e LOQ valor para sensibilidade
    1. Injecte 20 µ l de urina artificial em branco no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3), para obter o cromatograma HPLC da amostra.
    2. No cromatograma da 5.2.1, coletar os 11 valores de sinal em branco e calcular o valor médio Xb e o desvio-padrão Sb. Calcular o mínimo sinal de uma substância que pode ser detectada em um determinado nível de confiança, X,L, como XL = Xb+ K * Sb (K é o coeficiente determinado pelo nível de confiança, Sb reflete o nível de ruído a método de medição e o nível de ruído da máquina). Assim, LOD = (a XLX -b) / s = (K * Sb) /S (S significa o valor da inclinação da curva de trabalho).
    3. Defina um número de 3:1 (K = 3) como o limite de detecção (LOD) e um S/N de 10:1 (K = 10) como o limite de quantificação (LOQ).
  3. Avaliar as recuperações
    1. Prepare as amostras de urina real e cravado. Diluir o estoque de analitos secundário com urina real de três concentrações (5, 50, 100 ng/mL) para obter as amostras de urina cravado. Prepare três amostras paralelas para cada solução de analito. Conte a concentração cravada como a quantidade de compostos cravado em amostra de urina. Defina esse valor como ums.
    2. Estoque DHBA diluído para 100 ng/mL, como na etapa 5.1.2.
    3. Processar cada solução de amostra de 5.3.1 de acordo com a etapa 3 (procedimentos de extração de PFSPE) e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade de compostos quantificados na amostra de urina cravado. Defina esse valor como umt.
    4. Injecte 20 µ l de amostra de urina no sistema HPLC-ECD (como na etapa 3) para obter o resultado do cromatograma. O valor de analitos será contado como uma quantidade inicial de compostos quantificados na amostra de urina. Defina esse valor como umeu.
    5. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Estima-se a percentagem de recuperação como metodológico recuperação % = (umt - Aeu) × 100 / (s). Valores médios são mostrados na tabela 1.
  4. Avaliar a imprecisão
    1. Prepare amostras de urina artificial cravado de 5, 50 e 100 ng/mL concentrações como na etapa 5.3.1. Prepare-se seis amostras paralelas para cada solução de analito. Prepare amostras experimentais frescas todos os dias.
    2. Dilua o estoque DHBA de 100 ng/mL como na etapa 5.1.2.
    3. Avaliar a precisão intradia (n = 6). Processar cada solução de amostra em 5.4.1 de acordo com a etapa 3 e injectar a 20 µ l de cada eluente correspondente no sistema HPLC-ECD para obter o cromatograma. Fazer a mesma operação seis vezes no mesmo dia.
    4. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Sob a mesma concentração do mesmo composto, o desvio-padrão relativo (RSD) dos seis ensaios em um dia é determinado como precisão intradia. Valores médios são mostrados na tabela 1.
    5. Avaliar a precisão inter dia (n = 6). Ao mesmo tempo todos os dias nos seis dias sequenciais, preparar amostras de urina artificial cravado para três concentrações de 5, 50, 100 ng/mL, como em 5.4.1 e 5.4.2. e processar cada analito solução da amostra de acordo com a etapa 3.
    6. Injecte a 20 µ l de cada correspondente eluato de 5.4.5 no sistema HPLC-ECD para obter resultados de cromatograma cada dia. Calcule a quantidade de compostos nas amostras da equação da curva padrão. Dia Interamericano de precisão é expresso o RSD da quantidade das amostras urina artificial cravado nas três concentrações de ensaios em seis dias sequenciais. Valores médios são mostrados na tabela 1.

Resultados

Este protocolo é um método PFSPE simples e conveniente para pré-tratamento de amostras de urina e enriquecer cinco catecolaminas para a deteção através de um sistema de HPLC-ECD; um diagrama do processo é mostrado na Figura 1. O protocolo inclui principalmente quatro etapas-ativando, carregamento, lavagem e farmacológicos - juntamente com uma pequena quantidade de nanofibras de PCE-PS e um dispositivo simples extração de fase sólida. A morfologia d...

Discussão

O método PFSPE proposto neste trabalho pode ser significativo e significativo no que diz respeito a sua rapidez, simplicidade e conveniência. Os adsorventes usados no protocolo são electrospun de nanofibras, que têm altos superfície rácios de área e o volume e adsorver substâncias a analisar com eficiência elevada. O procedimento só precisa de alguns miligramas de nanofibras e um pequeno volume de solvente eluente e não requer uma etapa de evaporação para concentrar os analitos. Aqui, apresentamos uma visão...

Divulgações

Os autores certificam que não há nenhum conflito de interesses com qualquer organização financeira sobre o material discutido neste artigo.

Agradecimentos

Este estudo foi suportado por nacional Science Foundation da China (No.81172720, n. º 81673230), o programa de investigação Social desenvolvimento de Jiangsu província ciência e departamento de tecnologia (n. º BE2016741), ciência & tecnologia projeto da China a administração geral de supervisão da qualidade, inspeção e quarentena (2015QK055), o programa de abrir projeto de laboratório chave de desenvolvimento infantil e aprendizagem das Ciências do Ministério da educação, Universidade do Sudeste (CDLS-2016-04). Sinceramente, reconhecemos canção Yuan e Ping Liu, que nos ajudaram na recolha de amostras.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipcolumn to contain nanofibers
PCE-PS nanofibersmaterial for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter)fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml)compress solution into the end of the tip
methanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408complex reagent
norepinephrine(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyte
epinephrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyte
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781interior label
acetonitrileSigma-Aldrich.Inc75-05-8eluriant and mobile phase
phosphoric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriant
uric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2artifical urine
creatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5artifical urine
trisodium citrateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3artifical urine
KClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7447-40-7artifical urine
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9artifical urine
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326artifical urine
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0artifical urine
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6artifical urine
disodium hydrogen phosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4artifical urine
ureaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6artifical urine
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5artifical urine
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artifical urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8artifical urine
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0artifical urine
citric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9artifical urine and mobile phase
EDTA disodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6mobile phase
monometallic sodium orthophosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6mobile phase
sodium hydroxideSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column)Aglilent12102018PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm columnDikma5020-06731HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACauto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid ChromatographyShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detectorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60Adetector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAsurface and porosity analyzer 

Referências

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