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摘要

我们提出了一种方便的固相萃取与高压液相色谱 (HPLC) 结合电化学检测 (幼儿发展) 同时测定三单胺类神经递质和两个代谢物在婴儿的尿液中。我们还确定代谢物 MHPG 作为早期诊断婴儿脑损伤的潜在生物标志物。

摘要

生物液中儿茶酚胺类神经递质的提取和分析对评价神经系统功能和相关疾病具有重要意义, 但其精确测量仍然是一个挑战。许多协议已被描述为神经递质测量的各种仪器, 包括高压液相色谱 (HPLC)。然而, 存在着复杂的操作或难以检测的多目标的缺陷, 但目前仍存在着以高效液相色谱和敏感电化学或荧光检测为主导的分析技术, 由于灵敏度高, 选择性好。本文介绍了用静电纺丝复合纳米纤维组成的高压力液相色谱法在婴幼儿真实尿样中对儿茶酚胺的预处理和检测的详细协议。以聚苯乙烯为吸附剂的高分子冠醚, 也称为填料-纤维固相萃取 (PFSPE) 法。我们展示了如何容易 precleaned 尿样的碳纤维包装固体相柱, 以及如何在样品中的分析物可以迅速丰富, 吸, 并发现在一个幼儿系统。PFSPE 大大简化了生物样品的预处理程序, 从而减少了时间、费用和减少目标损失。

总的来说, 这项工作说明了一个简单和方便的协议, 固相萃取耦合的 HPLC-幼儿系统, 同时测定三单胺类神经递质 (NE), 肾上腺素 (E), 多巴胺 (DA)) 和两个其代谢产物 (3-甲氧基 4 hydroxyphenylglycol (MHPG) 和 34-二羟基苯乙酸 (DOPAC)) 在婴幼儿尿液中。建立的协议用于评估高危婴儿与围产期脑损伤和健康控制之间的尿儿茶酚胺及其代谢物的差异。比较分析发现两组尿 MHPG 有显著差异, 表明儿茶酚胺代谢物可能是早期诊断婴幼儿脑损伤危险病例的重要候选指标。

引言

儿茶酚胺类神经递质及其代谢物在体液中的含量可以影响神经功能, 并在很大程度上影响反应刺激状态的平衡1。异常可能导致多种疾病, 如 pheochromacytoma、肾上腺、神经母细胞瘤和神经系统疾病1,2。体液中儿茶酚胺的提取和测定对相关疾病的诊断有重要意义。然而, 生物样品中的儿茶酚胺存在于低浓度, 易于氧化。此外, 由于介质3中的大量干扰, 它们很难洗脱。因此, 同时检测生物液中的儿茶酚胺仍然是一个挑战。

有评论表明, 尿儿茶酚胺可以是一种压力的量度, 他们的水平是重要的生物标记反应的触觉刺激处理新生儿5。根据这项研究, 所有患有过早事件的婴儿都有患脑损伤的风险4,5,6, 伤害可能导致儿茶酚胺的异常释放和相关物质进入体液。在早期的阶段7,8中, 存在能够检测大脑损伤的先进磁共振技术。然而, 在前48小时内, 异常神经发育过程将导致永久性脑损伤, 这在医学图像11中是不明显的。此外, 高昂的成本和稀缺的仪器资源, 连同其他因素, 使得所有新生单位都无法获得这些专门的神经成像技术。然而, 使用易于接近和实用的生物标志物 (如儿茶酚胺及其代谢物) 可以克服这些缺点, 并筛选人体体液中的生物标记可能有助于早期诊断脑损伤, 并导致提示新生儿需要神经保护的识别9。尿中的儿茶酚胺可以是一个容易和明显的指标, 因为它的数量之间的直接关系释放到液体和 neuroactivity 功能。

在生物体液中, 脑脊液 (CSF) 和血浆样本不易通过现有的创伤程序, 而且由于粘附蛋白和其他杂质也很难消除干扰, 导致了麻烦和耗时的取样过程不适合重复检测。此外, 对于儿童来说, 很难以创伤的方式获取样本。因此, 尿液取样优于其他形式的取样, 因为它是无创、易操作的, 可以反复进行。尿样丰富, 易于贮存, 比其他生物样品具有更大的优越性。

定量测定生物液中儿茶酚胺的主要方法包括 radioenzymic 化验10、酶联免疫吸附剂化验11、伏安12和热透镜光谱分析13。但存在着复杂的操作和难以检测的多目标等缺点。目前, 主要的分析技术是高效液相色谱 (HPLC)14, 加上敏感的电化学15或荧光检测16, 因为其灵敏度高, 选择性好。采用串联质谱技术, 如液相色谱/质谱 (lc/ms) 和液相色谱/质谱/质谱 (lc/ms), 分析和定量的神经递质可以达到高准确性和特异性17,18。然而, MS 技术需要昂贵的仪器和大量的合格的人力, 使这一方法难以普遍适用于大多数传统实验室。高效液相色谱-幼儿早期系统在大多数常规和临床实验室中都有广泛的应用, 因此成为研究小组用于化学测定的一个普遍而又好的选择, 但它们要求将样品引入系统中进行清洁和微型卷19。因此, 在分析之前, 对样品进行提纯和浓缩是非常重要的。纯化步骤的经典方法是液-液萃取14,15,20和离线固相萃取, 包括活化氧化铝柱21,22和 diphenylborate (DPBA) 络合23,24,25,26。

Myeongho 李等。已使用以冠醚化学修饰的高分子树脂作为吸附剂, 自 2007年27以来选择性地从人尿中提取儿茶酚胺。此外, 在 2006年, 海博他et al。演示了一种简便的合成方法, boronate 亲和萃取吸附剂利用 functionalizable 纳米磁性面体寡聚 silsesquioxane (POSS) 的合成, 并将其应用于富集的儿茶酚胺人尿 (去甲肾上腺素, 肾上腺素和肾上腺素)28。他们也利用纳米材料来完成这项工作, 使用一种叫做纳米静电纺丝技术, 在纳米尺度上形成聚合物纤维材料。静电纺丝工艺可以通过控制工作电压和改变纺丝溶液的含量以及其他参数29来调整产品的直径、形貌和空间对准。与传统的 SPE 碳粉相比, 静电纺丝纳米纤维非常适合从复杂基质中提取和丰富目标分析物, 因为它们具有较高的表面积-体积比, 能有效吸附高效的分析分析,展示更易于控制的表面化学性质, 允许方便地附着的目标化合物。这些特性使它们成为 SPE 吸附剂的好选择, 大大减少了固相和解吸溶剂量30,31,32,33。对于尿样中的儿茶酚胺, 采用 apolymeric 冠醚与聚苯乙烯 (四氯乙烯-PS) 组成的静电纺丝纳米纤维, 选择性提取三儿茶酚胺 (NE, E, DA) 34.研究表明, 选择性冠醚吸附了 NE、E、DA 等靶点, 其基础是通过形成氢键来结合儿茶酚胺的正确几何。该结果有效地显示了材料冠醚, 去除了生物样品中含有的其它干扰化合物。通过本报告的启发, 提出了一种新的方法, 用于选择性提取儿茶酚胺的静电纺丝复合纳米纤维组成的四氯乙烯-PS。

本文对以前的34方法进行了改进和应用, 不仅成功地分析了 E、NE 和 DA, 而且在尿液中还有其代谢物、MHPG 和 DOPAC。我们还探讨了吸附过程机理的新可能性。该方法对五种分析物的提取效率和选择性有满意的效果, 并对围产期脑损伤和健康控制的高危儿尿液的检测进行了验证。

研究方案

获得了父母的知情同意, 并获得了机构审查委员会的批准。这项研究是按照世界医学协会 (赫尔辛基宣言) 的道德准则进行的, 涉及人类的实验。所有参与者的照顾者都提供了书面同意, 让他们参加这项研究。还获得了东南大学附属中大医院的伦理委员会批准。

1. 为提取和测定儿茶酚胺所需的柱和溶液的制备

  1. 准备 PFSPE 列。将1-2 毫克的四氯乙烯-PS 纳米纤维分成5-6 整除数, 并使用直径为0.5 毫米的细钢棒将它们有序地压缩到吸管尖端的末端, 体积为200µL。
  2. 用2.427 克尿素, 0.034 克尿酸, 0.09 克肌酐, 0.297 克柠檬酸三钠, 0.634 克氯化钠, 0.45 克氯化钾, 0.161 克氯化铵, 0.089 克氯化钙二水合物, 0.1 克硫酸镁制备人工尿液水合物, 0.034 克碳酸氢钠, 0.003 克草酸钠, 0.258 克硫酸钠, 0.1 克磷酸二氢钠, 0.011 克磷酸氢钠, 溶解上述化学物质为200毫升去离子水。
  3. 通过将2毫克的化合物溶解到1毫升蒸馏水中, 制备出2毫克/毫升的 diphenylborate (DPBA) 溶液。在4摄氏度的黑暗中存储解决方案。
  4. 分析标准
    注: 儿茶酚胺的化学结构和性质不稳定, 易于分解。标准的制备过程必须非常快, 并且要防止暴露在阳光直射下。
    1. 1.0 毫克的 NE, E, DA, MHPG, DOPAC 和内部标准 34-dihydroxybenzylamine 氢溴酸盐 DHBA 在单独1.5 毫升离心管。在使用前将水中的 DHBA 溶液稀释至100毫升。
    2. 在黑暗中以高速振荡准备好的标准, 直到完全溶解。这是主要的股票;贮存在-20 摄氏度, 长达数周。
    3. 准备1000次/毫升分析物的储存。对于 NE, E, DA, DOPAC 和 MHPG, 将每一个主要分析物的5µL 转移到4975µL 的蒸馏水中5毫升离心管, 并存储在黑暗中4°c, 直到使用。每天新鲜地准备这些解决方案。对于 DHBA, 将5µL 的原库存转移到5毫升离心管中的4995µL 蒸馏水中, 并分别在4摄氏度处存放在黑暗中。
    4. 进一步稀释二次分析物库存, 以创建标准曲线 (e. g,补充表 2)。存储解决方案在黑暗中的4°c, 并准备新鲜的每日。
    5. 用合适浓度的标准库存测试幼儿早期检测器的最佳电压。改变电压, 以找到一个值, 其中的表现出最好的峰值外观。
  5. 制备含有30% 磷酸、15% 乙腈和55% 蒸馏水的淋洗剂组成。对于10毫升的淋洗剂组成溶剂, 使用5.5 毫升蒸馏水, 并加入1.5 毫升的乙腈和3毫升的磷酸滴入水中。

2. 实际尿样和流动相的制备

  1. 让母亲用无菌尿杯收集婴儿的第一个清晨尿液。立即将样品转成聚丙烯管和标签。然后, 把样品存放在-20 摄氏度的冰箱里。
  2. 涡流和离心机的尿样在 1510 x g 10 分钟室温 (RT), 以摆脱大多数微粒干扰。丢弃沉积物, 收集上清液进行进一步实验。为了有效地提取样品, 在离心后立即进行 PFSPE 预处理 (步骤 3)。
  3. 准备移动阶段
    1. 准备一个干净的瓶子, 至少1升。移动阶段的构成列在补充表 1中;1 L 流动相, 测量6.7242 克柠檬酸, 93.06 毫克乙烯二胺四乙酸钠盐, 7.02 克 monometallic 钠磷酸, 404.5 毫克的 1-heptanesulfonic 酸钠盐和3.5 克钠水合物进入瓶子。加入40毫升乙腈和蒸馏水到1000毫升。搅动和震动超声15分钟, 直到溶液中的物质全部溶解。
    2. 使用带有玻璃电极的 ph 计, 用饱和氢氧化钠溶液将移动相的 ph 值调整为4.21。
    3. 用0.45 µm 聚偏氟乙烯微孔膜和真空吸尘装置过滤移动相, 去除杂质。
    4. 每次使用前, 使用超声波振动15分钟, 以加气移动相。

3. PFSPE 提取和高效液相色谱分析

  1. 激活纳米纤维。按100µL 甲醇和100µL 的水依次通过 PFSPE 柱使用5毫升注射器缓慢, 滴状的方式。
  2. 混合100µL 尿样与100µL 2 毫克/毫升 DPBA 溶液和30µL 100 ng/毫升 DHBA 溶液 (是, 内部标准) 在0.5 毫升 EP 管, 然后将混合溶液转移到 PFSPE 柱。通过 PFSPE 柱上的混合样品溶液, 用5毫升气密塑料注射器, 使用气压的力量。
  3. 通过将100µL 的 DPBA 溶液 (2 毫克/毫升) 装入 SPE 柱中, 将该柱浸出三次, 并使用5毫升气密塑料注射器将溶液缓慢地通过带气压的墨盒。
  4. 将淋洗剂组成的50µL 加载到 PFSPE 柱上, 并将其推入柱上, 用0.5 毫升 EP 管收集洗脱液。
  5. 打开 HLPC degasser, 把系统里的空气加起来。在样品分析之前, 系统应运行超过0.5 小时的移动相平衡和减少基线噪音。请参见辅助表 1 , 其中显示了 HPLC 系统的设置参数。
  6. 样品20µL 的洗脱液使用自动取样器, 然后注入到 HPLC-幼儿系统。
  7. 当运行完成后, 使用探测器接口关闭探测器单元。不要用开关在探测器背面关闭单元格, 因为这会损坏仪器。
  8. 手动将移动相组成改为10% 甲醇和90% 水。至少运行30分钟。然后, 手动将移动相转化为高效液相色谱级甲醇。运行约15分钟, 以保护系统在甲醇。如果在建议的运行时间之后无法运行此步骤, 可能会导致列和检测器的损坏。关闭流, 然后关闭 degasser。

4. 苯硼酸碳粉盒 (PBA) 提取

PBA 墨盒提取过程类似于库马尔et al中的方案。(2011)25. 所有解决方案都通过 PBA 墨盒 (100 毫克, 1 毫升) 通过注射器强制的空气进行推送。

  1. 将墨盒与1毫升80:20 乙腈-水 (v/v), 含有1% 甲酸和1毫升50毫米磷酸盐缓冲 (pH 10) 顺序。
  2. 按下缓冲尿样 (1 毫升尿液和2毫升磷酸盐缓冲器, pH 值 8.5) 通过 PBA 墨盒。
  3. 用1毫升 50:50 v/v 乙腈-磷酸盐缓冲液清洗墨盒 (10 毫米, pH 8.5)。
  4. 洗脱1毫升乙腈-水 (80:20 伏/v), 含有1% 甲酸的墨盒。

5. 对儿茶酚胺的鉴定和量化

  1. 线性
    1. 用人工尿液稀释二次分析物, 以六浓度 (1.5、3、12、25、50和 100 ng/毫升);人工尿液稀释量在补充表 2之后。用每浓度三个平行样品得到18个分析物的实验解来构造定标曲线。
    2. 用人工尿稀释 DHBA 二次库存10倍, 得到100的实验溶液。
    3. 根据步骤 3 (PFSPE 提取程序), 预处理所有来自5.1.1 的分析解。在步骤3中, 将每个相应洗脱液的20µL 注入 hplc-幼儿系统, 得到 hplc 色谱图谱。
    4. 通过绘制峰值面积 (目标/是) 与 Y 轴的比值 (目标/是) 作为 X 轴, 构造五分析物的校准曲线, 如补充图 1所示。
  2. 灵敏度的 LOD 和 loq 矿用值
    1. 将20µL 的空白人工尿液注入 hplc-幼儿系统 (如步骤 3), 获得样品的 hplc 色谱。
    2. 在5.2.1 的色谱中, 收集11个空白信号值, 并计算平均值 Xb和标准偏差的b。计算可在一定置信度下检测到的物质的最小信号, xl, 作为 xl = xb+ K Sb (K 是由置信度确定的系数, Sb反映了测量方法和机器噪声的水平)。因此, LOD = (xL-xb)/s = (K sb)/s (s 代表工作曲线的斜率值)。
    3. 将 3:1 (K=3) 的 s/n 定义为检测的极限 (LOD), 并将 10:1 (K=10) 的 s/n 作为量化 (loq 矿用) 的极限。
  3. 评估恢复
    1. 准备真实的和有刺的尿样。用真正的尿液稀释二次分析仪, 以三浓度 (5, 50, 100 ng/毫升), 以获得尖刺尿样。为每种分析溶液准备三个平行样品。当靶化合物的数量被注入尿样中时, 数出尖刺浓度。将此值定义为A的。
    2. 稀释 DHBA 库存至100毫升, 如步骤5.1.2。
    3. 根据步骤 3 (PFSPE 提取程序) 从5.3.1 处理每个样本溶液, 并将每个相应淋洗剂组成的20µL 注入 HPLC-幼儿系统以获得色谱结果。分析物的价值将被算作定量的靶化合物数量在被刺的尿样品。将此值定义为t。
    4. 将20µL 的尿样注入 HPLC-幼儿 (如步骤 3) 系统以获得色谱结果。分析物的价值将被计算为尿样中量化的靶化合物的初始数量。将此值定义为Ai。
    5. 从标准曲线方程计算样品中目标化合物的数量。百分比恢复估计为方法恢复% = (At - i) x 100/(s)。平均值显示在表 1中。
  4. 评估不精确性
    1. 在步骤5.3.1 中, 将含有的人工尿标本准备成5、50和 100 ng/毫升浓度。为每种分析溶液准备六个平行样品。每天准备新鲜的实验样品。
    2. 稀释 DHBA 库存至100毫升5.1.2。
    3. 评估日内精度 (n=6)。按照步骤3对5.4.1 中的每个样本溶液进行处理, 并将每个淋洗剂组成的20µL 注入到 HPLC-幼儿系统中以获得色谱。在同一天执行相同的操作六次。
    4. 从标准曲线方程计算样品中目标化合物的数量。在同一化合物浓度相同的情况下, 一天内六种化验的相对标准差 (RSD) 确定为日内精度。平均值显示在表 1中。
    5. 评估日间精度 (n=6)。同时每天在六连续的天, 准备尖刺的人工尿样品为三浓度 5, 50, 100 ng/毫升, 如在5.4.1 和 5.4.2, 并处理每个分析样品解决方案根据步骤3。
    6. 将每个相应洗脱液的20µL 从5.4.5 注入 HPLC-幼儿系统, 以获得每一天的色谱结果。从标准曲线方程计算样品中目标化合物的数量。在六个连续天数内, 从三浓度的尿液样本中检测量的 RSD 表示日间精度。平均值显示在表 1中。

结果

该协议是一种简便、方便的 PFSPE 方法, 预处理尿样, 通过高效液相色谱-幼儿系统丰富五儿茶酚胺进行检测;进程的图表显示在图 1中。该协议主要包括四步激活, 加载, 冲洗和洗脱-结合少量的四氯乙烯-PS 纳米纤维和一个简单的固相萃取装置。用表面和孔隙度分析仪对四氯乙烯-PS 纳米纤维的形貌进行了评估 (见材料表)。纹理属性-赌注 (布鲁?...

讨论

本文提出的 PFSPE 方法在快速、简便、方便等方面具有重要意义。该协议中所用的吸附剂是静电纺丝纳米纤维, 具有较高的表面面积到体积比, 并吸附的方法, 高效。该程序只需要几毫克的碳纤维和少量的淋洗剂组成溶剂, 不需要蒸发步骤集中的分析。在这里, 我们详细介绍了一种基于 HPLC-幼儿发展的协议, 这将允许新用户建立有效的方法来检测和量化三儿茶酚胺及其两个代谢产物 (NE, E, DA 和 MHPG, DOPAC...

披露声明

提交人证明, 与任何金融组织对本文所讨论的材料没有利益冲突。

致谢

这项研究得到了中国国家科学基金会 (81172720, 81673230 号) 的支持, 江苏省科技部社会发展研究项目 (no。BE2016741), 中国质量监督检验检疫总局科学 & 技术项目 (2015QK055), 教育部儿童发展与学习科学重点实验室开放项目方案,东南大学 (CDLS-2016-04)。我们真诚地感谢元宋和萍柳协助我们收集样品。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL pipette tipcolumn to contain nanofibers
PCE-PS nanofibersmaterial for PFSPE extraction
steel rod (about 0.5 mm diameter)fill the nanofibres into the column
gastight plastic syringe (5 ml)compress solution into the end of the tip
methanolSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd67-56-1
diphenylborinic acid 2-aminoethyl ester(DPBA)Sigma-Aldrich.IncA-106408complex reagent
norepinephrine(NE)Sigma-Aldrich.IncA-9512analyte
3-Methoxy-4-hydroxyphenylglycol(MHPG)Sigma-Aldrich.IncH1377analyte
epinephrine(E)Sigma-Aldrich.Inc100154-200503analyte
3, 4-Dihydroxyphenylacetic acid(DOPAC)Sigma-Aldrich.IncD-9128analyte
dopamine(DA)Sigma-Aldrich.IncH-8502analyte
3, 4-dihydroxybenzylamine hydrobromide(DHBA)Sigma-Aldrich.Inc858781interior label
acetonitrileSigma-Aldrich.Inc75-05-8eluriant and mobile phase
phosphoric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7664-38-2eluriant
uric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd69-93-2artifical urine
creatinineSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd60-27-5artifical urine
trisodium citrateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd6132-04-3artifical urine
KClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7447-40-7artifical urine
NH4ClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd12125-02-9artifical urine
NaHCO3Sinopharm Chemical ReagentCo., LtdSWC0140326artifical urine
C2Na2O4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd62-76-0artifical urine
NaSO4Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7757-82-6artifical urine
disodium hydrogen phosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10039-32-4artifical urine
ureaSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd57-13-6artifical urine
NaClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-14-5artifical urine
MgSO4.7H2OSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10034-99-8artifical urine
CaCl2Sinopharm Chemical ReagentCo., Ltd10035-04-8artifical urine
HClSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7647-01-0artifical urine
citric acidSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd77-92-9artifical urine and mobile phase
EDTA disodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd34124-14-6mobile phase
monometallic sodium orthophosphateSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd7558-80-7artifical urine and mobile phase
1-heptanesulfonic acid sodium saltSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd22767-50-6mobile phase
sodium hydroxideSinopharm Chemical ReagentCo., Ltd1310-73-2mobile phase
phenylboronic acid column(PBA column)Aglilent12102018PBA extraction
Inertsil® ODS-3 5 µm 4.6×150 mm columnDikma5020-06731HPLC column for seperation
SHIMADZU SIL-20AC prominence AUTO SAMPLERShimadzu Corporation, JapanSIL-20ACauto injection for eluriant
SHIMADZU LC-20AD High Performance Liquid ChromatographyShimadzu Corporation, JapanLC-20ADHPLC pump
SHIMADZU L-ECD-60A electrochemical detectorShimadzu Corporation, JapanL-ECD-60Adetector for the analytes
ASAP 2020 Accelerated Surface Area and Porosimetry SystemMicromeritics, USAsurface and porosity analyzer 

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