Un enfoque Simple para inducir Neuritis Autoinmune Experimental en ratones C57BL/6 para las evaluaciones funcionales y Neuropathological

Resumen

Este informe describe un enfoque simple para inducir con éxito neuritis autoinmune experimental (EAN) utilizando la mielina proteína cero (P0)_180-199 péptido en combinación con adyuvante completo de Freund y toxina del pertussis. Presentamos un paradigma sofisticado capaz de evaluar con precisión la magnitud de los déficits funcionales y neuropatología que ocurren en este EAN.

Resumen

Neuritis autoinmune experimental (EAN) es un bien apreciado modelo experimental de enfermedades desmielinizantes periféricas autoinmunes. Enfermedad EAN es inducida por inmunizar a ratones con péptidos neurogénicas para dirigir un ataque inflamatorio hacia los componentes del sistema nervioso periférico (PNS). Los avances recientes han permitido la inducción de la EAN en la línea de ratón C57BL/6 relativamente resistente utilizando mielina proteína cero (P0)_106-125 o P0_180-199 péptidos entregados en adyuvante combinada con la inyección de la Toxina pertussis. La capacidad de inducir la EAN en la cepa C57BL/6 permite el uso de las herramientas genéticas numerosos que existen en este fondo de ratón y permite así el sofisticado estudio de patogénesis de la enfermedad y el interrogatorio de la acción mecanicista de la nueva terapéutica en combinación con los enfoques de transgénicos. En este estudio, demostramos un enfoque simple para inducir con éxito EAN con el péptido de_180-199 P0 en ratones C57BL/6. También describiremos un protocolo para la evaluación de los déficits funcionales que se producen en este modelo, acompañado por una serie de características de neuropathological. Así, este modelo es un potente modelo experimental para estudiar la patogenesia de neuropatías desmielinizantes periféricas humanas y determinar la eficacia de terapias potenciales que pretenden promover la reparación de la mielina y proteger contra el daño del nervio en autoinmune neuritis.

Introducción

Neuropatías periféricas pueden ser genéticas en origen o adquirida, con neuropatías adquiridas teniendo ya sea metabólica, isquémico, precipitados inflamatorios o tóxicos. Estas enfermedades se clasifican también provechosamente como axonal o demyelinative en origen. El más común adquirida desmielinizante Neuropatías periféricas son la polineuropatía desmielinizante inflamatoria aguda (AIDP, también conocido como síndrome de Guillain-Barré, SGB) e inflamatoria desmielinizante polineuropatía crónica (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; ambos pathogenetically se caracterizan por una reacción autoinmune dirigida contra la mielina, provocando desmielinización de los nervios periféricos. En estas enfermedades, las células T activadas atraviesan la barrera del nervio y generan una reacción inmune en el PNS. Activación de los macrófagos dentro del nervio entonces causa desmielinización directamente a través de ataque fagocítico o indirectamente a través de mediadores inflamatorios secretados, dando por resultado clínicos incapacidades como parálisis y disfunción sensorial⁵. Mientras que los axones demyelinated conservan la capacidad de ser remyelinated después de desmielinización, remielinización se retrasa a menudo o incompleta, dando por resultado susceptibilidad de los axones desnudos a daño irreversible, que es la causa principal de la clínica permanente discapacidad. En la actualidad, los tratamientos más eficaces son inmunomoduladores, pero a pesar de su eficacia, en muchos casos la recuperación es a menudo lento y ~ 25% de los pacientes experimentarán déficits funcionales residuales que reducen significativamente su calidad de vida^{6, 7}.

EAN es un modelo animal ampliamente utilizado de demyelinating de neuropatía periférica que ha proporcionado información valiosa en la patogenesia y a fin de evaluar nuevos agentes terapéuticos⁴. Este modelo puede ser inducido en diferentes especies tales como conejos, ratas, ratones y conejillos de Indias y es inducida por la vacunación con antígenos neurogénicas. Sin embargo, en última instancia la exitosa inducción EAN depende de una respuesta inmune apropiada para la enfermedad de que se produzca. Teniendo en cuenta las variaciones de la especie (y inter-especies/cepa) en la función inmune, se han desarrollado múltiples combinaciones de antígenos y adyuvantes para inducir con éxito el Código EAN. En términos de herramientas genéticas murinas, C57BL/6 es el más utilizado; sin embargo, el péptido de la proteína P2 tradicional 57-81 (P2_57-81) que resulta en la enfermedad en el ratón SJL susceptibles cepa⁸ es incapaz de patogenesia ilícito Conduce a déficits funcionales en la cepa C57BL/6. Afortunadamente, paradigmas de sensibilización mediante el P0_106-125 o P0_180-199 péptidos, se entregó en adyuvante combinada con la inyección de pertussis toxina puede superar esta barrera, que permiten sofisticadas herramientas genéticas ser utilizados en la modelo murino de EAN.

Aquí, se presenta un método simple para la inducción de la EAN en los ratones C57BL/6. Además, se proporciona un enfoque integral detallado por el cual evaluar los déficits funcionales y neuropathological asociados a la enfermedad. El P0_180–199 péptido⁹ fue elegida preferentemente a la alternativa de P0_57-81 ¹⁰. El modelo de₁₉₉ P0_180–se ha descrito para producir signos clínicos menos severos en comparación con la alternativa de P0_57-81 ¹⁰y por lo tanto es probable que soportar potencialmente la introducción de perturbaciones genéticas deletéreas, recuperan de procedimientos quirúrgicos (como la implantación de la bomba osmótica) y es favorables a la función de paso de cinta de correr pruebas⁴. Sin embargo, la cinta de correr pruebas de la función de marcha y protocolos histológicos descritos aquí podrían fácilmente aplicarse al estudiar la enfermedad en una variante de_57-81 inducida por P0.

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Protocolo

todos los procedimientos aquí descritos fueron aprobados por el Instituto de Florey de Neurociencia y Salud Mental (centro del cerebro de Melbourne) Comité de ética Animal y seguir el código australiano de prácticas para el uso de animales para la ciencia Efectos.

1. inducción de EAN

Nota: EAN puede ser inducida con éxito en ratones C57BL/6 machos de edades comprendidas entre 6-8 semanas. El protocolo de inducción lleva 9 días en total. Día 0 se refiere al día de la primera vacunación. De este protocolo, las inyecciones se realizaron bajo anestesia (ver paso siguiente 1.1.2).

1. En el día -1:
   1. preparación de la toxina de Pertussis (véase Tabla de materiales) solución de 1.6 μg/mL con la estéril 0,1 M de fosfato ratón isotónica tamponada con solución salina (MT-PBS).
   2. Anestesia con isoflurano:
      1. Coloque el ratón (C57BL/6, hombre, 6-8 semanas) en la cámara de anestesia y ajustar el flujo de oxígeno a 1 L/min.
      2. Encienda el vaporizador de isoflurano, ajústelo al 2,5% para la anestesia y monitor de respiración y espera por 2 min, o hasta que los reflejos primarios (miembro de la córneo y posteriores) ya no responden
   3. Quitar el ratón de la cámara de anestesia y administre 250 μl de la solución anterior de la toxina del Pertussis mediante inyección intraperitoneal (i.p.) utilizando una jeringa de 0.5 mL con una aguja de 30 ^1/2 G.
   4. Preparar el inóculo inyectable para la inmunización:
      1. preparar Solución A solución 2 mg/mL de P0 _180-199 péptido (con > 98% pureza, secuencia S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) en solución salina al 0.9%.
      2. Preparar Solución B con 20 mg/mL solución de Mycobacterium tuberculosis (véase Tabla de materiales) en Freund ' coadyuvante completo de s (FCA, que comprende: mannide 15% monoolate + 85% de aceite de parafina y 0,5 mg/mL de desecado muertos y secos M Mycobacterium butyricum).
      3. Para hacer el inóculo final para inyectar, combinar partes de igual volumen de soluciones A y B en un batidor del grano y mezcla a velocidad máxima durante 1 min a temperatura ambiente.
         Nota: Soluciones A y B pueden ser mantenidas como acciones y almacenadas a 4 ° C por un máximo de un mes, pero el inóculo final combinado debe estar recién preparado en el día de la inyección de ratón.
2. En el día 0, administrar 50 μl del inóculo (preparación descrito en el paso 1.1.4) en un ratón mediante una inyección subcutánea con una aguja de 23 G.
   Nota: La inyección puede colocarse entre los omóplatos, o entre las extremidades y la cola del dorso caudal.
3. En día 1, la solución de la toxina del Pertussis de 1.2 μg/mL (en MT-PBS) y administrar 250 μL en un ratón vía la inyección i.p. utilizando una jeringa de 0.5 mL con una aguja de 30 ^1/2 G.
4. Día 3, repetir paso anterior 1.3.
   Nota: Las soluciones Stock A y B pueden ser formadas y almacenadas a 4 ° c por un máximo de un mes. Sin embargo, el inóculo inyectable final, producido por la combinación de las soluciones madre A y B, debe hacerse en el día de la inyección.
5. El día 8, administrar 50 μl del inóculo (preparación descrito en el paso 1.1.4) en un ratón mediante una inyección subcutánea (ver paso anterior 1.2), en el mismo sitio de inyección como en el paso 1.2 (para cada animal)

2. puntuación clínica

1. realizar la puntuación clínica a diario a partir del día 0.
2. Dar a cada ratón una puntuación de 0, 1, 2, 3 o 4 de acuerdo con los criterios publicados ⁴. Vea la tabla 1 para EAN puntuación clínica.
   Nota: Por consistencia, hacer un esfuerzo debe anotar ratones al mismo tiempo diariamente por el investigador mismo.

3. Evaluación de la función del motor

Nota: se evalúa el rendimiento del motor en paralelo con la puntuación clínica de la misma cohorte de animales. El aparato de evaluación de la función motora debe conectarse a un ordenador que cuenta con un sistema de proyección de imagen de la función de marcha (véase Tabla de materiales) instalado. También se recomienda que todos los ratones a evaluarse deben ser habituados a la tarea corriente antes de la inducción de la EAN. Para ello, pistas de práctica (2 funcionamientos de prueba por ratón) se llevan a cabo tres días antes de la inducción de la enfermedad (día -3).

1. Encienda el aparato de evaluación de la función motora y encienda el botón de luz.
2. Pescuezo el ratón firmemente y la tinta de sus pies bajando en un recipiente llenado de tinta roja mientras sostiene su cola.
   Nota: Este paso es necesario para la cepa C57BL/6, pero puede omitirse si se usa una cepa de ratón con un color de capa blanca.
3. Coloque el ratón en el compartimiento de a pie y ajustar la velocidad de la cinta a 15 cm/s.
4. Encienda la caminadora y haga clic en el " registro " botón para capturar el corriente movimiento del ratón mediante la función de paso sistema de imagen (véase Tabla de materiales).
5. Usar un cronómetro y medir cada uno que funciona para 36 s. Después de 36 s, grabación de parada y parada de la caminadora.
   Nota: Los ratones que no se pueden completar la tarea corriente para este intervalo s 36 se consideran que han fracasado.
6. Guardar el archivo de vídeo en la carpeta.
7. Repetir los pasos anteriores para cada ratón a evaluarse. Los ratones con la misma tarea de ejecución de la prueba cada 3 días.
8. Analizar los archivos de vídeo editados usando software para parámetros de la función de marcha (véase Tabla de materiales).
   Nota: Los detalles de cómo analizar los diferentes parámetros del motor varían entre software así que por favor, consulte al fabricante ' instrucción de s antes del análisis. Para obtener evidencia histológica de axonal y daño de la mielina mediante inmunohistoquímica o microscopia electrónica, los tejidos pueden tomarse en cualquier etapa post función motora evaluación dependiendo de los objetivos específicos de investigación animal.

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Resultados

P0_180-199 péptido inducido EAN en plomos de ratones C57BL/6 a una enfermedad monofásica con puntuación clínica inicio de post 6 días primera inmunización (PPP) y la máxima puntuación severidad se observa desde dpi 25 seguido de un score clínico mejora de 40 dpi duración (figura 1)^4,9. En cuanto a la función de la marcha, ratones empiezan a fracasar en una tarea simple de ejecuci?...

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Discusión

Este informe describe un método sencillo para inducir EAN con el péptido de_180-199 P0 en ratones C57BL/6, lo que permite la cuantificación de los déficits neuropathological y funcionales claves en ratones inducidos con EAN. Distinto en el protocolo de inducción de EAN se describe aquí es el uso de anestesia mientras se realizan las inyecciones de inmunización. El uso de la anestesia isoflurano mejora en gran medida la capacidad para garantizar que el volumen total de inóculo se inyecta por vía subcut?...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc