C57BL/6 farelerde deneysel otoimmün nörite fonksiyonel ve Neuropathological değerlendirmeler için ikna etmek için basit bir yaklaşım

Özet

Bu raporu başarıyla miyelin protein kullanarak deneysel otoimmün nörite (EAN) sıfır (P0)_180-199 peptid Freund'ın tam adjuvan ve boğmaca toksin ile birlikte ikna etmek için basit bir yaklaşım özetlenmektedir. Biz doğru bir şekilde işlevsel açıkları ve bu EAN meydana nevropatoloji ölçüde değerlendirirken yetenekli sofistike bir paradigma mevcut.

Özet

Deneysel otoimmün nörite (EAN) otoimmün periferik demiyelinizan hastalıklar iyi takdir bir deneysel modeldir. EAN hastalığı inflamatuar saldırının periferik sinir sistemi (PNS) bileşenlerinin doğru yönlendirmek için fare ile Nörojenik peptidler immunizing tarafından indüklenen olduğu. Son gelişmeler EAN indüksiyon miyelin protein sıfır (P0)_106-125 veya P0_180-199 peptidler boğmaca toksin enjeksiyonu ile birlikte adjuvan teslim kullanarak nispeten dayanıklı C57BL/6 fare çizgi etkinleştirdiniz. EAN C57BL/6 zorlanma ikna yeteneği bu fare arka plan üzerinde mevcut çok sayıda genetik araçları kullanmak için izin verir ve böylece hastalığın patogenezinde, sofistike çalışma ve sorgulama roman therapeutics mekanik eylem sağlar transgenik yaklaşımlar ile birlikte. Bu çalışmada, EAN C57BL/6 farelerde P0_180-199 peptid kullanarak başarılı bir şekilde ikna etmek için basit bir yaklaşım göstermektedir. Ayrıca bu modelde, neuropathological özellikleri dizesi ile birlikte ortaya çıkan fonksiyonel açıkları değerlendirilmesi için bir protokol anahat. Böylece, insan periferik demiyelinizan neuropathies patogenezi okumaya ve miyelin onarım teşvik ve otoimmün sinir hasarına karşı korumak amacı potansiyel tedavilerin etkinliğini belirlemek için güçlü bir deneme modeli bu modelidir nörite.

Giriş

Periferik neuropathies genetik kökenli veya edinsel, olabilir ya da metabolik, iskemik, enflamatuar veya toksik precipitants ile elde edilen neuropathies sahip. Bu hastalıklar da yararlı aksonal ya da demyelinative kökenli olarak sınıflandırılır. En yaygın alınan periferik neuropathies olan akut inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (AIDP, GBS Guillain-Barré Sendromu olarak da bilinir) demiyelinizan ve kronik inflamatuvar demiyelinizan polinöropati (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; her ikisi de pathogenetically neden demiyelinizasyon periferik sinirlerin miyelin kılıf karşı yönettiği bir otoimmün reaksiyon ile karakterizedir. Bu hastalıklarda aktive T hücreleri kan sinir bariyerini çapraz ve PNS içinde bir bağışıklık reaksiyon oluşturur. O zaman makrofajlar içinde sinir aktivasyonu demiyelinizasyon fagositik saldırı üzerinden doğrudan veya dolaylı olarak felç ve duyusal disfonksiyon⁵gibi klinik Engelli sonuçlanan salgılanan inflamatuar aracılar üzerinden neden olur. Demyelinated akson demiyelinizasyon takip remyelinated yeteneği korumak, ancak remyelination kez ertelendiği veya eksik, geri dönüşümsüz hasara için çıplak aksonlar duyarlılık içinde kaynaklanan kalıcı klinik en önemli nedeni olduğu sakatlık. Şu anda, en etkili tedavi immunomodulatory, ama onların yeterlik rağmen birçok durumda kurtarma genellikle yavaş ve ~ % 25 hastaların önemli ölçüde azaltmak onların yaşam kalitesi^{6artık işlevsel açıkları yaşayacaksınız, 7}.

EAN, değerli yorumlara Patogenez ve roman terapötik ajanlar⁴değerlendirmek için bir araç sağlamıştır periferik nöropati demiyelinizan yaygın olarak kullanılan bir hayvan modelidir. Bu model tavşanlar gibi farklı türlerin indüklenen sıçanlar, fareler ve eskiden şiling şimdi pigs ve bağışıklama Nörojenik antijenleri ile tarafından indüklenen. Ancak, sonuçta başarılı EAN indüksiyon gerçekleşmesi hastalığı için uygun bir bağışıklık yanıtı bağlıdır. Tür (ve arası species/zorlanma) varyasyonları bağışıklık fonksiyonu göz önüne alındığında, Çoklu kombinasyonları antijenleri ve adjuvan başarıyla EAN ikna etmek için geliştirilmiştir. Fare genetik araçları açısından C57BL/6 en çok kullanılan olduğunu; Ancak, geleneksel P2 protein peptid 57-81 (P2_57-81) duyarlı SJL fare zorlanma⁸ hastalığında sonuçlanan yasadışı patogenezinde C57BL/6 gerginlik içinde işlevsel açıkları önde gelen değiştiremiyor. Neyse ki, sensitizasyon paradigmalar P0_106-125 veya P0_180-199 peptidler, kullanarak teslim adjuvan kombine boğmaca enjeksiyon ile toksin içinde kullanılmak üzere Gelişmiş genetik araçları etkinleştirme Bu bariyer üstesinden gelebilir fare EAN modeli.

Burada, EAN indüksiyon C57BL/6 farelerde için basit bir yöntem sunulur. Ayrıca, kapsamlı ve detaylı bir yaklaşım hastalığı ile ilişkili işlevsel ve neuropathological açıkları değerlendirileceği tarafından sağlanır. P0_180-199 peptid⁹ P0_57-81 alternatif¹⁰tercih seçildi. P0_180-199 modeli P0_57-81 alternatif¹⁰ile karşılaştırıldığında daha az şiddetli klinik belirtiler üretmek için açıklanan ve bu nedenle potansiyel olarak getirilmesi dayanacak şekilde yüksektir zararlı genetik tedirginlikler, cerrahi işlemler (örneğin, ozmotik pompa implantasyon) kurtarmak ve⁴test koşu bandı yürüyüş işleve mükellef. Ancak, koşu bandı yürüyüş fonksiyon testleri ve histolojik protokolleri burada açıklanan kolayca bir P0 indüklenen_57-81 değişken hastalığında okurken uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

burada açıklanan tüm yordamlar Florey Enstitüsü tarafından Nörobilim ve ruh sağlığı (Melbourne beyin merkezi) hayvan Etik Komitesi için kabul edildi ve Avustralya uygulama kodu kullanımı hayvanlar için bilimsel için izleyin. Amaçlar.

1. EAN indüksiyon

Not: EAN başarıyla 6-8 hafta arasında yaşlı erkek C57BL/6 farelerde indüklenen. İndüksiyon Protokolü Toplamda 9 gün alır. Gün 0 ilk aşılama gün anlamına gelir. Bu iletişim kuralı için anestezi altında enjeksiyonları yapılmıştır (bkz. Adım 1.1.2 aşağıda).

1. Üzerinde gün -1:
   1. boğmaca toksin hazırlamak (bakınız Tablo reçetesi) çözüm olarak 1.6 µg/mL steril 0.1 M fare izotonik fosfat kullanarak tamponlu tuz (MT-PBS).
   2. Anesthetization isoflurane ile:
      1. (C57BL/6, erkek, 6-8 hafta) fare anesthetization odasında yerleştirin ve oksijen akışı 1 L/dak için ayarlamak
      2. İsoflurane Buharlaştırıcı çevirmek, anesthetization ve nefes monitör için % 2.5 şekilde ayarlamak ve bekle 2 min için veya birincil refleksleri (kornea ve arka bacak) kadar artık duyarlı
   3. Fare anesthetization odasından kaldırın ve yukarıdaki boğmaca toksin eriyik 0.5 mL şırınga 30 ^1/2 G iğne ile kullanarak bir mayi (IP) enjeksiyon yolu ile 250 µL yönetmek.
   4. Enjekte edilebilir inoculum bağışıklama için hazırlamak:
      1. P0 _180-199 peptid, 2 mg/mL solüsyon kullanarak hazırla Çözüm A (ile > %98 saflıkta, sıra S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) % 0,9 serum içinde.
      2. Hazırlama Çözüm B Mycobacterium tüberküloz 20 mg/mL solüsyon kullanarak (Tablo malzemeleri görmek) Freund içinde ' s tam adjuvan (FCA, oluşan: % 15 mannide monoolate + %85 0,5 mg/mL ve parafin yağı rendelenmiş öldürdü ve kuru M Mycobacterium butyricum),.
      3. Enjekte için son inoculum yapmak için eşit cilt bölgelerinde çözümleri A ve B bir boncuk çırpıcı birleştirmek ve bunları oda sıcaklığında 1 dk. için maksimum hızda karıştırın.
         Not: A ve B çözümleri olabilir stok olarak devam etti ve en fazla bir ay 4 ° C'de depolanan ama kombine son inoculum fare enjeksiyon gününde taze hazırlanmalıdır.
2. Günü 0, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare 23 G iğne kullanarak bir Subkutan Enjeksiyon yolu ile.
   Not: Enjeksiyon veya arka bacak ve kuyruk kürek kemikleri arasında Kaudal patolojisi üzerinde yerleştirilebilir.
3. On gün 1, boğmaca toksin çözüm olarak 1,2 µg/mL (MT-PBS) yapmak ve bir fare 0.5 mL şırınga 30 ^1/2 G iğne ile kullanarak IP enjeksiyon yoluyla içine 250 µL yönetmek.
4. Üzerinde gün 3, tekrar 1.3 yukarıdaki adım.
   Not: Stok çözümleri A ve B oluşan ve en fazla bir ay 4 ˚C depolandığı. Ancak, hisse senedi çözümleri A ve B, birleştirerek üretilen son enjekte edilebilir inoculum enjeksiyon gününde yapılmalıdır.
5. Gün 8, inoculum (1.1.4. adımda açıklanan hazırlık) 50 µL yönetmek içine bir fare Subkutan Enjeksiyon yolu ile (bkz. Adım 1,2 yukarıdaki) adım 1.2 (için her hayvan) olduğu gibi aynı enjeksiyon yerinde

2. klinik puanlama

1. klinik günlük 0 gününden başlayarak puanlama gerçekleştirmek.
2. Her fare 0, 1, 2, 3 veya 4 yayımlanmış kriterleri ⁴ göre bir puan vermek. EAN klinik puanlama için bkz. Tablo 1.
   Not: tutarlılık sağlamak için bir çaba fareler aynı anda puan için her gün aynı araştırmacı tarafından yapılmalıdır.

3. Motor işlevi değerlendirme

Not: motor performans için hayvanların kohort aynı klinik puanlama paralel olarak değerlendirilir. Motor işlevi değerlendirme cihazları bir yürüyüş işlevi görüntüleme sistemi (Tablo malzemeleri görmek) yüklü olduğu bir bilgisayara bağlı gerekir. Ayrıca değerlendirilmek için tüm fareler EAN indüksiyon öncesinde çalışan görev habituated tavsiye edilir. Bunu yapmak için uygulama çalıştırır (2 test çalıştırmalarını fare başına) üç gün önce hastalık indüksiyon (gün -3) gerçekleştirilir.

1. Motor işlevi değerlendirme cihazları ve anahtar ışık düğmesini açmak.
2. Scruff fare sıkıca ve kendi ayakları kırmızı mürekkeple kuyruğunu tutarak dolu bir kap üzerine düşürerek mürekkep.
   Not: Bu adımı C57BL/6 zorlanma için gereklidir, ancak bir fare yük bir Beyaz önlük renkle kullanılırsa atlanabilir.
3. Fareyi yürüyen bölmenin içine getirin ve koşu bandı hızını 15 cm/s.
4. Koşu bandı ve tıklayın açın " Kayıt " çalışan hareket görüntüleme sistemi yürüyüş işlevini kullanarak fare yakalamak için düğmesini (Tablo malzemeleri görmek).
5. Bir zamanlayıcıyı kullanın ve her çalışan için 36 ölçmek s. 36 s, stop kayıt ve stop treadmill sonra.
   Not: Bu 36 s aralığı için çalışan görev başarıyla tamamlanamıyor fareler başarısız olarak kabul edilir.
6. Video dosyası belirtilen klasöre kaydedin.
7. Her fare değerlendirilmek için yukarıdaki adımları yineleyin. Aynı çalışan görev ile fareler her 3 günde testi.
8. Analiz yazılımı yürüyüş işlev parametreleri (bkz Tablo reçetesi) kullanarak düzenlenmiş video dosyalarını.
   Not: Nasıl farklı motor parametreleri çözümleneceği ayrıntılarını yazılım arasında çok farklılık lütfen üreticiye başvurun ' s öğretim analiz önce. Aksonal histolojik kanıt elde etmek için ve miyelin hasar immünhistokimya veya elektron mikroskobu, hayvan dokuları herhangi bir sahne sonrası motor işlevleri değerlendirme araştırma özel amaçları bağlı olarak alınabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

P0_180-199 peptid C57BL/6 fareler yol açan bir monophasic hastalığı klinik skoru ile EAN indüklenen başlangıcından ilk aşılama (dpi) ve en büyük puanı önem 25 dpi gözlenen 6 gün sonrası takip bazı klinik skora göre 40 dpi gelişmeleri süre (şekil 1)^4,9. Yürüyüş işlevi, açısından fare başlar basit bir görevin çalışmasını 6 dpi olarak erken başarısız ve 3...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Bu raporu C57BL/6 farelerde P0_180-199 peptid kullanarak, anahtar neuropathological ve fonksiyonel açıkları EAN ile indüklenen farelerde miktar etkinleştirme EAN ikna etmek için basit bir yöntem özetliyor. Burada açıklanan EAN indüksiyon Protokolü bağışıklama enjeksiyonları gerçekleştirirken anestezi kullanımı farklıdır. İsoflurane anestezi kullanımını büyük ölçüde inoculum hacmi subkutan istenilen yere en az hata ve stres hayvanlara enjekte edilir emin olmak için yeteneğini ge...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc