Ein einfacher Ansatz, experimentelle Autoimmune Neuritis bei C57BL/6 Mäusen für funktionale und neuropathologische Bewertungen zu induzieren

Zusammenfassung

Dieser Bericht beschreibt einen einfachen Ansatz, um erfolgreich experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) mit dem Myelin Protein zero (P0)_180-199 Peptid in Kombination mit Freunds kompletten Adjuvans und Pertussis-Toxin zu induzieren. Wir präsentieren Ihnen eine ausgereifte Paradigma in der Lage, präzise Bewertung des Ausmaßes der funktionelle Defizite und Neuropathologie, die in diesem EAN auftreten.

Zusammenfassung

Experimentelle autoimmune Neuritis (EAN) ist ein gut geschätzt experimentellen Modell der autoimmunen peripheren demyelinisierenden Erkrankungen. EAN Krankheit wird induziert durch Immunisierung von Mäusen mit neurogenen Peptide, entzündlichen Angriff gegen Komponenten des peripheren Nervensystems (PNS) zu lenken. Die jüngsten Fortschritte konnten die Induktion von EAN in der relativ resistent C57BL/6-Maus-Linie mit Myelin Protein zero (P0)_106-125 oder P0_180-199 Peptide in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Pertussis-Toxin geliefert. Die Fähigkeit, EAN induzieren in den Stamm C57BL/6 ermöglicht den Einsatz der zahlreichen genetische Werkzeuge, die auf diesem Hintergrund Maus vorhanden und ermöglicht so das anspruchsvolle Studium der Pathogenese der Krankheit und Vernehmung der mechanistischen Wirkung neuer Therapeutika in Kombination mit transgene Ansätze. In der vorliegenden Studie zeigen wir einen einfachen Ansatz, um erfolgreich EAN verwendet P0_180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen zu induzieren. Wir skizzieren auch ein Protokoll für die Beurteilung der funktionellen Defizite, die in diesem Modell, begleitet von einer Reihe von neuropathologische Funktionen auftreten. Somit ist dieses Modell ein leistungsfähiges experimentellen Modell die Pathogenese der menschlichen peripheren demyelinisierenden Neuropathien zu studieren und die Wirksamkeit der möglichen Therapien zu bestimmen, die darauf abzielen, Myelin-Reparatur zu schützen gegen Nervenschäden in autoimmune Neuritis.

Einleitung

Periphere Neuropathien kann entweder genetisch bedingt oder erworben, mit erworbenen Neuropathien haben entweder metabolische, ischämische, entzündliche oder giftige Fällungsmitteln. Diese Krankheiten sind auch sinnvoll als axonalen oder demyelinative Ursprungs eingestuft. Die häufigsten erworbenen demyelinisierenden periphere Neuropathien akuten entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (AIDP sind, auch bekannt als Guillain-Barré-Syndrom, GBS) und chronisch entzündlichen demyelinisierenden Polyneuropathie (CIDP)^{1, 2 , 3 , 4}; Beide zeichnen sich pathogenetisch durch eine Autoimmunreaktion gegen die Myelinscheide, Demyelinisierung peripherer Nerven verursacht. Bei diesen Erkrankungen aktivierte T-Zellen der Blut-Nerven-Schranke und generieren eine Immunreaktion in der PNS. Aktivierung von Makrophagen innerhalb der Nerv dann verursacht Demyelinisierung entweder direkt über phagocytic Angriff, oder indirekt über freigesetzten Entzündungsmediatoren, was in klinischen Behinderungen wie Lähmungen und sensorische Dysfunktion⁵. Während demyelinated Axone die Fähigkeit behalten, Remyelinated nach Demyelinisierung, Remyelinisierung ist oft verzögert oder unvollständig, wodurch Anfälligkeit der nackten Axone zu irreversiblen Schäden, das ist die wesentliche Ursache für dauerhafte klinischen Behinderung. Derzeit wirksamsten Behandlungen sind immunmodulatorische, aber trotz ihrer Wirksamkeit in vielen Fällen die Erholung ist oft langsam und ~ 25 % der Patienten erleben residual funktionelle Defizite, die ihre Lebensqualität^{6deutlich zu reduzieren, 7}.

EAN ist eine weit verbreitete Tiermodell der demyelinisierenden peripheren Neuropathie, der wertvolle Einblicke in die Pathogenese und ein Mittel zur Beurteilung neuartiger Therapeutika⁴zur Verfügung gestellt hat. Dieses Modell induziert werden kann in verschiedenen Arten wie Kaninchen, Ratten, Mäuse und Meerschweinchen, und wird durch Immunisierung mit neurogenen Antigene induziert. Hängt jedoch letztlich die erfolgreiche EAN Induktion eine entsprechende Immunantwort für Krankheit auftreten. Angesichts der Arten (und inter-Arten/Stamm) Variationen in Funktion des Immunsystems, wurden mehrere Kombinationen von Antigenen und Hilfsstoffe entwickelt, um erfolgreich EAN induzieren. In Bezug auf murinen genetische Werkzeuge ist der C57BL/6 die am weitesten verbreitete; Das traditionelle P2 Protein Peptid 57-81 (P2_57-81), die Krankheit in der anfälligen SJL Maus Belastung⁸ führt ist jedoch nicht in der Lage zu unerlaubten Pathogenese, funktionelle Defizite in der C57BL/6-Belastung führen. Glücklicherweise, Sensibilisierung Paradigmen mit P0_106-125 oder P0_180-199 Peptide, geliefert in adjuvante kombiniert mit der Injektion von Keuchhusten Toxin bewältigt diese Barriere, so dass genetische Spezialtools in genutzt werden die EAN Mausmodell.

Hier ist eine einfache Methode für die Induktion von EAN in den Mäusen C57BL/6 vorgestellt. Darüber hinaus erfolgt eine detaillierte Gesamtkonzept, um die funktionelle und neuropathologische Defizite, die mit der Krankheit assoziiert zu bewerten. Die P0_180–199 Peptid⁹ wurde anstelle der P0_57-81 alternative¹⁰gewählt. Das P0_180–199 Modell produzieren weniger schwere klinische Symptome im Vergleich zu den P0_57-81 alternative¹⁰beschrieben worden und dürfte daher die Einführung von potenziell zu widerstehen schädliche genetische Störungen, von chirurgischen Eingriffen (z. B. osmotischen Pumpe Implantation) erholen und Laufband Gangart Funktionsprüfung⁴zugänglich ist. Jedoch konnte das Laufband Gangart Funktionstests und histologischen Protokolle hier beschriebenen leicht angewendet werden, wenn die Krankheit in einer P0_57-81 induzierte Variante zu studieren.

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Protokoll

alle hier beschriebene Verfahren wurden von Florey Instituts für Neurowissenschaften und psychische Gesundheit (Melbourne Brain Zentrum)-Tier-Ethik-Kommission genehmigt und folgen Sie der australischen Code of Practice für die Verwendung von Tieren für wissenschaftliche Zwecke.

1. EAN Induktion

Hinweis: EAN bei männlichen C57BL/6 Mäusen im Alter zwischen 6-8 Wochen erfolgreich induziert werden kann. Die Induktion-Protokoll dauert insgesamt 9 Tage. Tag 0 bezieht sich auf den Tag der ersten Immunisierung. Für dieses Protokoll Injektionen wurden unter Narkose durchgeführt (siehe Schritt unten 1.1.2).

1. Am Tag-1:
   1. bereiten das Pertussis-Toxin (siehe Tabelle der Materialien) Lösung von 1,6 µg/mL mit der sterilen 0,1 M Maus-isotonische Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (MT-PBS).
   2. Anesthetization mit Isofluran:
      ,
      1. platzieren Sie den Mauszeiger (C57BL/6, Männlich, 6-8 Wochen) in der Anesthetization Kammer und passen Sie die Sauerstoffzufuhr auf 1 L/min
      2. Schalten Sie den Verdampfer Isoflurane, passen Sie es auf 2,5 % für Anesthetization, und den Monitor atmen und warten Sie 2 Minuten, oder bis primäre Reflexe (Hornhaut und hinteren Gliedmaßen) reagieren nicht mehr
   3. Entfernen Sie die Maus aus der Kammer Anesthetization und verwalten die obige Pertussis-Toxin-Lösung über eine intraperitoneale (i.p.) Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 ^1/2 G 250 µL.
   4. Immunisierung der injizierbare Inokulum vorbereiten:
      1. Prepare Lösung A mit 2 mg/mL Lösung von P0 _180-199 Peptid (mit > 98 % Reinheit, Sequenz S-S-K-R-G-R-Q-T-P-V-L-Y-A-M-L-D-H-S-R-S) in 0,9 % Kochsalzlösung.
      2. Vorbereitung Lösung B mit 20 mg/mL Lösung von Mycobacterium Tuberculosis (siehe Tabelle der Materialien) in Freund ' s komplettes Adjuvans (FCA, bestehend aus: 15 % Mannide Monoolate + 85 % Paraffinöl und 0,5 mg/mL der ausgetrocknete getötet und getrockneten M Mycobacterium Butyricum).
      3. Zu das endgültige Inokulum zum Einspritzen, gleiches Volumen Teile Lösungen A und B in einem Wulst Schläger kombinieren und mischen Sie sie mit einer maximalen Geschwindigkeit für 1 min bei Raumtemperatur.
         Hinweis: Lösungen A und B können als Lager gehalten und bei 4 ° C für maximal einen Monat gelagert, sondern das kombinierte endgültige Inokulum muss frisch zubereitet werden, am Tag der Injektion Maus.
2. An Tag 0, verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion mit einer Nadel 23 G.
   Hinweis: Die Injektion kann platziert werden zwischen den Schulterblättern oder zwischen den hinteren Gliedmaßen und Rute über die Caudale Dorsum.
3. On Tag1 machen die Pertussis-Toxin-Lösung von 1,2 µg/mL (in MT-PBS) und verwalten 250 µL in eine Maus über i.p.-Injektion mit einer 0,5 mL Spritze mit einer Nadel 30 ^1/2 G.
4. Am 3. Tag, wiederholen Sie Schritt 1.3 oben.
   Hinweis: Lager-Lösungen A und B können aus und bei 4 ° c für maximal einen Monat gelagert werden. Allerdings muss das letzte injizierbare Inokulum, produziert durch die Kombination von Stammlösungen A und B, am Tag der Injektion erfolgen.
5. Am 8. Tag verwalten 50 µL des Inokulums (Vorbereitung in Schritt 1.1.4 beschrieben) in eine Maus über eine subkutane Injektion (siehe Schritt 1.2 oben), an der gleichen Einstichstelle wie in Schritt 1.2 (für jedes Tier)

2. klinische Bewertung

1. durchführen, klinische Bewertung, täglich ab am Tag 0.
2. Geben jedem Mausklick eine Punktzahl von 0, 1, 2, 3 oder 4 nach den veröffentlichten Kriterien ⁴. Siehe Tabelle 1 für die EAN klinische Wertung.
   Hinweis: aus Gründen der Kohärenz eine Anstrengungen unternommen werden sollten Mäuse gleichzeitig Tor täglich von der gleichen Forscher.

3. Motor-Funktion Bewertung

Hinweis: die Motorleistung wird parallel mit klinischen erzielte bei der gleichen Altersgruppe Tiere bewertet. Der motorischen Funktion Bewertung Apparat muss an einen Computer angeschlossen werden, dass ein Gang-Funktion-imaging-System (siehe Tabelle der Materialien) installiert hat. Es wird auch empfohlen, dass alle Mäuse zu beurteilenden an die ausgeführte Aufgabe vor EAN Induktion gewöhnt werden sollten. Zu diesem Zweck werden Praxis läuft (2 Testläufe per Mausklick) drei Tage vor der Krankheit Induktion (Tag-3) durchgeführt.

1. Zug auf das motorische Funktion Bewertung Gerät und schalten Sie die Lichttaste.
2. Genick der Maus fest und Tinte seine Füße durch Absenken auf einen Behälter, gefüllt mit roter Tinte gedrückter Schwanzspitze.
   Hinweis: Dieser Schritt ist erforderlich für die C57BL/6-Belastung, aber kann übersprungen werden, wenn eine Maus-Sorte mit einem weißen Fellfarbe verwendet wird.
3. Platzieren Sie den Mauszeiger in das Fach zu Fuß und stellen Sie die Laufband Geschwindigkeit 15 cm/s.
4. Schalten Sie das Laufband und klicken Sie auf die " Rekord "-Taste, um die laufende Bewegung der Maus über die Gangart Funktion imaging-System zu erfassen (siehe Tabelle der Materialien).
5. Verwenden Sie einen Zeitgeber und messen jedes Rennen um 36 s. Nach 36 s, Aufnahme beenden und Stop der Tretmühle.
   Hinweis: Mäuse, die erfolgreich ausgeführte Aufgabe für dieses 36 s-Intervall können nicht gelten als gescheitert zu sein.
6. Speichern die video-Datei im Ordner "benannten".
7. Wiederholen Sie die oben genannten Schritte für jede Maus beurteilt werden. Testen Sie die Mäuse mit der gleichen ausgeführte Aufgabe alle 3 Tage.
8. Analysieren die bearbeiteten video-Dateien mit Software für Gang Funktionsparameter (siehe Tabelle der Materialien).
   Hinweis: Die Details der Analyse verschiedener Motorparameter variieren unter Software also entnehmen Sie bitte den Hersteller ' s Anweisung vor der Analyse. Histologischen Nachweis der axonalen zu gewinnen und Myelinschäden entweder über Immunohistochemistry oder Elektronenmikroskopie, Tier Gewebe zu den Phase Motorik Abschlusstest je nach den spezifischen Zielen der Forschung eingenommen werden können.

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Ergebnisse

P0_180-199 Peptid induzierten EAN C57BL/6 Mäusen führt zu eine monophasische Erkrankung mit klinischen Score Ausbruch aus 6 Tage nach ersten Immunisierung (dpi) und maximale Punktzahl Schweregrad von 25 dpi beobachtet wird gefolgt von einigen klinischen Ergebnis Verbesserung von 40 dpi Dauer (Abbildung 1)^4,9. In Bezug auf die Gangart Funktion Mäuse beginnen zu versagen bei laufenden einfa...

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Diskussion

Dieser Bericht beschreibt eine einfache Methode um EAN verwendet P0_180-199 Peptid bei C57BL/6 Mäusen, so dass die Quantifizierung der wichtigsten neuropathologische und funktionelle Defizite bei Mäusen mit EAN induziert induzieren. DISTINCT zu dem hier beschriebenen EAN Induktion-Protokoll ist die Verwendung der Anästhesie während der Durchführung der Impfung-Injektionen. Die Verwendung von Isofluran-Narkose verbessert erheblich die Möglichkeit, sicherzustellen, dass das Gesamtvolumen des Inokulums an de...

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Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6, male, 6-8 weeks old	Australian Bioresources Cenre, WA, Australia
Pertussis toxin	List Biological Laboratories, Inc., CA, USA	#181
0.1 M mouse-isotonic phosphated buffered salined (MT-PBS)			Laboratories will have their own protocol.
Isoflurane	Pharmachem, QLD, Australia		Laboratories will have their own protocol for administration.
P0180–199 peptide	Wuxi Nordisk Biotech Co. Lt. SHG, CHN		P0180–199, sequence S–S–K–R–G–R– Q–T–P–V–L–Y–A–M–L–D–H–S–R–S
Heat killed Mycobacterium tuberculosis (strain H37RA)	Difco, MI, USA	#231141
Freund's complete adjuvant (FCA)	Difco, MI, USA	#263910
16% Paraformaldehyde (PFA)	Electron Microscopy Services	#15710	Dilute to 4% PFA day of tissue collection.
25% glutaraldheyde	ProSciTech Pty Ltd, QLD, Australia	#11-30-8	Dilute to 2.5% glutaraldehyde day of fixation.
Sodium azide	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SL189	Create 10% (w/v) stock in 0.1M MT-PBS. Use at 0.03% (v/v).
Sucrose	Chem-Supply Pty Ltd, SA, Australia	SA030	Use at 30% (w/v).
Optimum cutting temperature (OCT) medium	Sakura Finetek, CA, USA	#4583
Normal donkey serum	Merck Millipore, MA, USA	#S30-100	Use as antibody diluent at 10% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
Triton-X 100	Sigma Aldrich, MI, USA	#90o2-31-1	Use in antibody diluent at 0.3% (v/v) or other concentration determined by own laboratory.
rabbit anti-amyloid precursor protein (APP)	Invitrogen (Life Technologies), CA, USA	S12700	Used at 1:400 or titrate in own lab.
rabbit anti-contactin-associated protein-1 (Caspr)	Gift from Prof Elior Peles, Wiezmann Institute of Science, Israel		Used at 1:500 or titrate in own lab.
Appropriate Alexa Fluor conjugated secondary antibodies	Molecular Probes (Life Technologies), OR, USA	Various	Use at 1:200 or titrate in own lab. Choice of species the antibody was raised in and Alexa Fluor chosen is at the discretion of each laboratory.
Aqueous mounting solution	Dako (Agilent), CA, USA	#S3023	Each laboratory will have their own preference.
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
0.5 mL syringe with 301/2 g needles	BD	#326105
23 g needles	BD	#305143
Red ink pad			Any red ink pad or red food dye could be used to mark the animals' feet.
DigiGate apparatus (includes treadmill)	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
DigiGate Imaging System	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Stopwatch			Any timer may be used.
DigiGait 8 Software	eMouse Specifics Inc. Framingham, MA
Dissecting microscope	Zeiss		Any appropriate dissecting microscope may be used.
Charged slides	Superfrost Plus, Lomb Scientific Pty Ltd	SF41296SP
Cyrostat	Leica		Any suitable cyrostat may be used.
Perfusion equipment and dissecting instruments			Labs will have their own perfusion protoctols.
Opaque humified chamber			Labs may produce their own using an opaque plastic container.
PAP pene	GeneTex (USA)		Wax pencil, or surface tension may also be used to create a well around the tissue section.
Confocal microscope	Zeis LSM780		Any confocal microscope with appropriate laser lines may be used.
FIJI/Image J	National Institues of Health		Available from www.fiji.sc